在使用柱层析进行多糖 薄层层析分离的时候，sephadex G200的填料在实验前要进行什么前处理？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2012-03-05 04:24 标签： 多糖 薄层层析
因此，许多学者也纷纷开始研究多糖，而多糖的分离纯化也成为了研究多糖不可或缺 &..
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多糖分离纯化方法及应用实例
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Sephadex-G50
Sephadex-G50
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<font color="#0-用Sephadex G200分离多糖请问用什么洗脱？
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[用Sephadex G200分离多糖请问用什么洗脱？] 用Sephadex G200分离多糖请问用什么洗脱？用0.05或0.2的NaCl还是用去离子水？小弟刚做多糖，请各位前辈指教！ 关键词:[多糖 洗脱 去离子水]…
用Sephadex G200分离多糖请问用什么洗脱？用0.05或0.2的NaCl还是用去离子水？小弟刚做多糖，请各位前辈指教！
Sephadex G200是分子筛填料，上柱时只要恒定的流速，不用洗脱的，根据多糖的大小，出峰顺序不一样的，减少上样量、降低流速、增加高径比都能提高分辨率
Sephadex G200是分子筛填料,一般如果分离的多糖跟填料没有吸附作用的话用水洗托就可以了，如果有吸附可以用0.15的NaCl洗托。
用盐还是水来洗脱，主要取决于多糖是否带电荷等情况。假设多糖是中性的，盐的存在与多少对于洗脱影响不大；但是，如果是酸性糖，则可能与基质的非体积排阻效应（主要是电荷相互作用）较大，需要用适当高些的来完成。
大家接着讨论一下过离子交换柱时用碱洗和用盐洗的区别
应该说是改变pH和改变I（离子强度），这两个因素都能够影响离子表面电位。pH一般比I的影响强烈。对于硅胶基色谱柱，pH只能选择2~8，甚至要更窄（对IEX来说），高分子基色谱柱对pH范围没有很高要求，可以在碱性条件下操作; I只改变大分子表面电荷强度而不能改变符号（与pH不同）。所以，如果先做一个zeta-potential vs pH的图谱，对于摸索pH条件很有帮助。不过，目前一般都用调节I的，没有多少人调pH。此外，还要考虑，洗脱条件与检测器之间的匹配问题。
Sephadex G200是分子筛，上柱时只要恒定的流速，不用洗脱的，根据多糖的大小，出峰顺序不一样的，减少上样量、降低流速、增加高径比都能提高分辨率你这是从分析的角度谈的，如果从制备的角度，还要综合考虑分辨率和制备能力capacity ，必要时候需要牺牲一定的分辨率，在过载条件下操作。例如，流速就不是越低越好。
你这是从分析的角度谈的，如果从制备的角度，还要综合考虑分辨率和制备能力capacity ，必要时候需要牺牲一定的分辨率，在过载条件下操作。例如，流速就不是越低越好。嘿嘿，谢谢大侠的补充，在制备时，确实应该综合考虑resolution和capacity，我感觉如果两者不能很好协调的时候，应该牺牲的是capacity，而不是resolution。分子筛一般主要是两大用途：除盐和分离，对于前者要求不是很严，sephadex G25 G50 都是专门用来除盐的，载量最高可以达到柱体积的20%，而且对于流速等条件的要求都不高；分子筛层析如果用来分离不同大小的蛋白或多糖一般是用在后面的精纯化阶段，我们平常纯化的时候不到万不得已是不会用到分子筛的，因为它的上样量很小，而且做一次需要的时间也很长，与离子交换、疏水或反向等比起来太费时费力，这时用分子筛来分离首先考虑的就是它的分辨率，当然在保证分辨率的情况下通过增加流速、增加上样量等方法来提高capacity是最好的，但是如果上述条件的改变影响了resolution和recovery，那么最好是在保证resolution和recovery的情况下少量多次进行层析分离。
大家接着讨论一下过离子交换柱时用碱洗和用盐洗的区别离子交换色谱洗脱主要是两种方式，第一种是增加缓冲中的盐离子浓度，这些离子会和蛋白竞争性的与配基吸附，随着离子强度的增大，洗脱离子依靠数量上的优势优先与配基结合，从而使不同离子特性的蛋白洗脱；第二种方式是通过改变pH的方法改变蛋白自身的带电特性，这时由于蛋白自身带电性质的改变，不用盐离子竞争性吸附，它自身就会从配基上解离。一般离子交换洗脱的时候优先考虑用增加离子强度的方法进行洗脱，因为通过改变pH的方法使蛋白解离一般会经过蛋白的pI，这时蛋白溶解度降低会降低，会存在沉积到上的危险（当然使用极高或极低的pH应该能把蛋白洗脱下来，但是这个同样涉及到蛋白在该pH的稳定性问题）；用增加离子强度的方法进行洗脱有时会使疏水性特别强的蛋白出现盐析从而沉淀在填料上的现象，这时再通过一味增加盐离子强度无法使蛋白洗脱的，此时只能把盐离子强度降低，用改变pH的方式进行洗脱。
还有一个问题，我用g200填料分离纯化多糖不用恒流泵的话非常非常慢，开始10秒多钟滴一滴，后来开始50秒钟才能滴一滴，并且用恒流泵的话，g200的填料就会漏，我在柱子下面加了两层膜也不行，还是有少许的填料漏出，请问各位前辈怎么解决？
还有一个问题，我用g200填料分离纯化多糖不用恒流泵的话非常非常慢，开始10秒多钟滴一滴，后来开始50秒钟才能滴一滴，并且用恒流泵的话，g200的填料就会漏，我在柱子下面加了两层膜也不行，还是有少许的填料漏出，请问各位前辈怎么解决？sephadex系列的填料刚性不好，g75以上的填料早就停止生产了，G后面的数字越大、刚性越差，我们用g200时也遇到过这种问题，这个是填料本身性质带来的，漏出来的那个是破碎的填料，这时很难有分离效果的。建议你更换填料，如sephacryl S 200或 S300之类的，它的刚性要好的多。
多谢前辈！
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