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PCR扩增DNA序列无条带
最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。
想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。
PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。
考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。
求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题 : Originally posted by kapa1 at
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题 我是用Omega的试剂盒提的，基因组直接跑电泳结果还行。我试试原来提出来确定能跑的DNA看看。
谢谢哈！ 是不是忘加什么东西了, 或者水出了问题. : Originally posted by bullfrog325 at
是不是忘加什么东西了, 或者水出了问题. 买的生工的DEPC-treated water，用之前用0.22um滤膜又过滤了一遍... 你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能扩出来，你也可以试试，可以避免你在提基因组的过程中的错误。 PCR不出现扩增条带
　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究,最后写出了调整顺序。　
　1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。(5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
　　2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　
　　　3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　
　　　4.Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　　　5.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　
　　6.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
　　一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。再往后，重新提取DNA模板、换酶和改变反应体积。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。& &&&
& &过去，我也回答过PCR无产物的问题，但是这次回答按照近日我更新以后的内容回答。
& &看来PCR 的问题是多，这是我在两天里第三次回答同类问题。 小木虫的帖子流动量可能太大，1小时可能有的帖子就很难找了，所以重复类型的问题，我只好做重复的问答，当然如果能够深入地继续讨论我更欢迎！:D:D : Originally posted by 凌波丽 at
PCR不出现扩增条带
　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对 ... 谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
2、已经用两种酶做过了
3、引物，这里讲的很有帮助，到时候给引物跑一下PCR。引物使用Primer3设计的，程序是否有问题？其他的引物参数我也提供了...
4、镁离子在Buffer中提供了，没有精确控制。而这里不应该是Mg2+的原因，因为做16s的时候也没扩出来，而之前用同样buffer是可以的
5、准备做温度梯度，但是温度和时间如何设定呢？
6、菌株来自CGSC，通过NCBI查到序列设计的引物
恳请根据具体情况仔细帮忙分析下，谢谢！ : Originally posted by liyongliangx at
你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能扩出来，你也可以试试，可以避免你在提基因组的过程中的错误。 恩，我先试试前面条件，不行就用菌液做PCR，然后确定是不是重提质粒。谢谢：） : Originally posted by liyongliangx at
你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能扩出来，你也可以试试，可以避免你在提基因组的过程中的错误。 打错了，是重提基因组DNA 72℃延伸步骤1min时间短了，takara的taq酶理论上最高一分钟延伸1k，你这目标条带这么长要么延长延伸时间，要么重新设计引物，把你的目标条带分两端扩增然后测序。
如果说内参有问题lz可以设计一个扩增内参只要内参扩增出来那么体系就没有问题。 楼主，其实PCR做不出有很多原因的，有时候可能不是你的反应体系或者反应条件的问题，有时可能真的是运气问题。我的建议是退火温度减5度，然后在正负2~3度之间做梯度，循环数增加到30个，然后两台PCR仪同时做一样的条件，有时候真的是不同PCR仪的结果不同，我们原来就有这样的情况，同一实验室两台同品牌同型号同期购买的PCR仪，就有一个P不出有一个能P出。当然只是建议，希望楼主尽快做出实验 谢耳朵楼主：
& && &感觉最有可能就是引物问题，用引物blast验证一下吧 : Originally posted by 夏财神 at
谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
... 我说的还笼统！！！？？？
那我不说了！！！！ : Originally posted by 夏财神 at
谢谢，不过这个都太笼统了吧。
我前面给出了具体的条件和后续探索，希望这位高手能仔细看过之后再回答吧。
1、模板，前面提到是采用Omega的试剂盒提取，并经过电泳确认了，怎么再判断它是否有问题？
... 好呀！！你有本事是吧！！！别问我呀！！！我讨厌你这样的人！！！ 大概看了一下前面几楼的回复，其实应该基本都把问题点出来了，我就建议楼主注意几点：
1. 优化PCR条件，做温度梯度PCR，可以同时在不同的退火温度下反应，很容易学的。13楼说的很好，就在你认为最合适的Tm值上下2~3度作梯度，再稍宽一点也可以，看自己需要。另外，普遍经验是引物Tm值减5度就是你实际用于PCR的退火温度了；
2. 模板的量，按你说的，跑电泳后条带很清楚，估计你的模版含量应该是很丰富的，检查下是不是PCR体系中浓度太高了？另外，一定不要加错试剂。
3. 引物设计你觉得可能有问题，那么你就多设计几对试试，然后可用BLAST比对检查下引物的特异性。
4.你最终扩增的片段1000多bp，不长，应该不难扩才对，GC值也不算高，或者你可以用TAq酶说明书里的条件试试，只需将自己的退火问题改为自己的。另外，模板、引物、酶的量完全可以参考酶的说明书里的量试试看，一般不会有很大问题的。
& &祝好！ 另外，若楼主问题解决了，希望能跟大家分享一下经验，多多交流~赠人玫瑰，手有余香！祝好！ 是什么带都没有吗？根据你的目的片段长度，会不会延伸时间过短？ : Originally posted by yilunanxia at
72℃延伸步骤1min时间短了，takara的taq酶理论上最高一分钟延伸1k，你这目标条带这么长要么延长延伸时间，要么重新设计引物，把你的目标条带分两端扩增然后测序。
如果说内参有问题lz可以设计一个扩增内参只要内参 ... 谢谢，我试一下调整延伸的时间。
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基因的PCR扩增实验扩增不出DNA条带是什么原因？
基因的PCR扩增实验扩增不出DNA条带是什么原因？
可能有很多原因，最常见的原因是1.模板不干净，2.引物设计不当，3.退火温度过高，等等
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有可能最开始提取基因时就破坏了
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出门在外也不愁做标曲的质粒PCR条带非常弱，是怎么回事啊(质粒,条带,标准曲线,目的基因)
22:11:12&&&来源：&&&评论：&&
[做标曲的质粒PCR条带非常弱，是怎么回事啊(质粒,条带,标准曲线,目的基因)] 我做标准曲线用的质粒都做了很久了 内参的片段连上去之后PCR非常不好做，原液根本拉不出来带，稀释200倍之后带也非常弱谁知道是怎么回事呢？同样倍数稀释的目的基因质粒的条带就非常亮！ 关键词:[质粒 条带 标准曲线 目的基因 内参 常亮]…
我做标准曲线用的质粒都做了很久了 内参的片段连上去之后PCR非常不好做，原液根本拉不出来带，稀释200倍之后带也非常弱谁知道是怎么回事呢？同样倍数稀释的目的基因质粒的条带就非常亮！
没有人知道么？很着急啊！质粒扩增一般都很亮，不管克隆的是目的片段还是内参。而且扩增对PCR反应条件要求不高。条带很弱考虑一下会不会是以下原因：1. 质粒浓度的确非常小。2. 克隆并未成功，即使通过PCR检测也为假阳性。3. 引物本身因素或其他原因导致引物引发效率比较低。个人估计，第2种可能性较大。谢谢，我再做一次克隆试试看吧：（只这个克隆都做了很久了， 都没有弄好~
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向各位求助，PCR扩增目的基因条带很弱，
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这个帖子发布于9年零191天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我行PCR用10×STRBUFFER,下一步怎么处里，向各位请教，谢谢
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目的条带可以呀，你做什么用呀。要回收的话足够了
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我也觉得你的条带还可以哦，试试增加循环数或模板量，退火温度也有影响啊！
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如果认为扩增的产物是你需要的，但是量不够，可以切胶回收产物，然后以回收后的产物为模板，继续PCR，可以得到足够量的产物。
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较亮的为B-actin,我的目的基因为两个条带，我是进行半定量请各位多多指教，谢谢
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你可以touch down PCR扩增程序，可以明显提高PCR产量。
关于丁香园PCR扩增为什么会产生除目的基因条带外的其他条带_百度知道
PCR扩增为什么会产生除目的基因条带外的其他条带
这个可能的情况太多了最常见是引物不特异，如果引物与模版其他地方结合，扩出来的指定不是你想要的大小；引物如果自己跟自己结合了，就是引物二聚体，很小，跑1%的胶都会跑到溴酚蓝下面很多其次考虑模版问题，如果模版本身有大规模重复（很长的重复或串联重复），扩出来的东西也可能会多一段或少一段然后考虑酶的活性，虽然你觉得自己的延伸时间够长，但你不能保证体系里所有反应都是100%的还有一条其实也很重要，就是退货温度，用软件查出来的温度不一定就是准的，通常情况下，如果退火温度过低，PCR产物容易出现多条带，原因就是非特异结合；退火温度高的话相反，出弥散还有许多情况你都找不到原因，很有可能就是用的胶不好造成的如果你是自己做实验，建议先查引物结构，再查基因结构，如果都没问题改变一下退火温度；从质粒或基因组上扩建议加betain（不记得怎么拼了），如果扩增的目的片段很长（&3K？）建议加inhanser(同样不记的怎么拼。。。喃举蹿断讷登寸券丹猾)如果是答简答题，你就当没看到我
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一般涉及引物设计问题比较多见；另外，调整一下退火温度；Taq酶与引物别加太多！
引物的特异性不够好呗
在别的地方也能结合上去
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