ALyS505N—0 冻了影响实验 客厅吊顶效果图吗

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【求助】做冰冻切片的固定问题
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这个帖子发布于8年零294天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我打算做免疫组化检测鼻息肉表面抗原的表达,需要在手术室收集标本.而收集齐2-3个病人标本大概需要一个上午,我打算先放在多聚甲醛保存,然后再送到实验室做冰冻切片.但书上说甲醛固定后可以使细胞上的蛋白质交联,引起抗原封闭,石蜡切片要抗原修复,那冰冻切片需要抗原修复吗?
不知道邀请谁?试试他们
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总结一下你所说的问题:1.取下来的标本怎么保存。 我们实验室的做法是4%中性甲醛固定,然后转移至30%葡萄糖中,4度冰箱至组织块沉底。这样做的目的是使组织块充分脱水,避免冰冻切片时因组织中水分形成的冰晶在切片上造成孔洞,有孔洞的片子会很难看,甚至无法使用。2.切片时怎么包埋。上面有同学提到胶水,这个东西在不得已的情况下可以用来替代专用的包埋剂,我们实验室都用过。但是个人感觉还是用包埋剂的好,主要是包埋的时候不会产生气泡空泡,这在贴片的时候是很讨厌的事情。另外,胶水中的水分含量高对于组织包埋同样会产生不好的影响。3.冰冻切片用不用做抗原修复。一般来讲,做冰冻切片的目的就在与保持良好的抗原性,因此不用做抗原修复。但个人认为,要不要抗原修复,怎么修复,并没有一个绝对的答案。如果做的结果不好,就要从多个方面找原因,包括胰酶修复,蛋白酶修复等都可以尝试。
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选择做冰冻切片无非是为了更好地保护抗原物质,半天时间的话用生理盐水就可以了。如果不放心就找个帮手中途转冻一下。我自己做冰冻切片的时候用生理盐水,外加碎冰,两个多小时都没问题的。然后直接用浆糊或专用包埋剂(OCT)包埋,冻起来,然后切片。等切片风干后用冰丙酮固定的。冰冻切片是不要抗原修复的。不过冰冻切片的免疫组化结果一般都没有石蜡切片好看,你在文献里看一下就知道。如果不是试剂的限制或者所检测抗原的限制,选择做石蜡的会更省心些最后图也会更漂亮些的。
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我们实验室也做冰冻切片免疫组化,不用抗原修复!
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选择做冰冻切片无非是为了更好地保护抗原物质,半天时间的话用生理盐水就可以了。如果不放心就找个帮手中途转冻一下。我自己做冰冻切片的时候用生理盐水,外加碎冰,两个多小时都没问题的。然后直接用浆糊或专用包埋剂(OCT)包埋,冻起来,然后切片。等切片风干后用冰丙酮固定的。冰冻切片是不要抗原修复的。不过冰冻切片的免疫组化结果一般都没有石蜡切片好看,你在文献里看一下就知道。如果不是试剂的限制或者所检测抗原的限制,选择做石蜡的会更省心些最后图也会更漂亮些的。
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我也要做冰冻切片,我的组织都保存在-80度冰箱,不知这对做冰冻切片有没有影响?如果我要将冰箱中的组织运送到实验室,需要用液氮罐运送吗?
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1, 组织块可以在-80度长期保存,可达半年以上(经验)。2,如果把组织块从-80拿到切片机,必须用液氮。防止组织块化掉而使组织形态发生变形,另外也防止RNA降解!不过也见有的人用冰来转移组织块。本人没这样试过,所以不知道这样做的效果如何。最好还是用液氮,也不费事!
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谢谢helloabing!我还要问一下你,做成切片后想拿到其它地方做后面的步骤,直接拿过去就可以吗?切片怎么保存?能保存多长时间了?冰冻切片做出来的图会比石蜡切片难看吗?
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1, 切好的冰冻片子也放在-80保存,做接下来的步骤时,一般先把片子放在切片盒里面晾干,在50度展片台上烘干也可以。2,切好的片子在-80也能长期保存,跟组织块一样。3,一般情况下,冰冻切片做IHC没有石蜡切片做出来的效果好,包括形态上和信号着色上。看文献的时候会发现,做的漂亮的图片一般是用石蜡切片做出来的。
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麻烦想求助一下:1、取完组织块后先要涂包埋剂再放入-80保存吗?怎么涂?2、什么包埋剂好些,胶水也行吗?另外有说要先将组织块放蔗糖中,再放于混和蔗糖与包埋剂的溶剂中,需要这样吗?
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helloabing你好,看你在线,还想请教一下你,免疫组化法,固定液用4%多聚甲醛可以吗,要现用现配吗?
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dlchq战友你好!刚看到你上面的帖子,刚才下线了。我们做免疫组化没用过4%多聚甲醛,我们的石蜡切片是用的波恩氏固定液,里面含有甲醛。但我们做原位杂交用的是4%多聚甲醛。听说过别人用4%多聚甲醛做免疫组化,但不知道效果怎么样。
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dlchq 麻烦想求助一下:1、取完组织块后先要涂包埋剂再放入-80保存吗?怎么涂?2、什么包埋剂好些,胶水也行吗?另外有说要先将组织块放蔗糖中,再放于混和蔗糖与包埋剂的溶剂中,需要这样吗?1,如果取较大块的组织,可以先直接放在液氮里面,如果需要保存的话再放在-80,切片的时候再包埋;如果取的组织块非常的小(如直径小于0.5mm的组织、体积小于1立方毫米的组织等),那么要先用包埋剂包埋(如果切片的时候再包埋容易使组织化掉,而使组织形态发生改变;也容易起气泡,而给切片带来麻烦)。我们的方法是:先在锡箔纸上(其他东西也可以)滴一滴包埋剂,然后把新鲜的组织块放在包埋剂中,再把锡箔纸放在液氮上面慢慢薰(紧贴液氮表面,不要接触液氮,否则容易裂),等包埋剂变硬之后再把它投入液氮中。2,包埋剂我们用的是OTC。3,胶水???这是您的创意?有想法!没试过!呵呵!4,有个师兄用过蔗糖固定。不过我不知道具体步骤,抱歉!但我知道他用蔗糖固定完再用包埋剂直接包埋,不是包埋剂与蔗糖的混合液。也可能别的实验室用的是混合液来包埋,您再具体查查文献吧。以上仅为个人意见,仅供参考!祝顺利!
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总结一下你所说的问题:1.取下来的标本怎么保存。 我们实验室的做法是4%中性甲醛固定,然后转移至30%葡萄糖中,4度冰箱至组织块沉底。这样做的目的是使组织块充分脱水,避免冰冻切片时因组织中水分形成的冰晶在切片上造成孔洞,有孔洞的片子会很难看,甚至无法使用。2.切片时怎么包埋。上面有同学提到胶水,这个东西在不得已的情况下可以用来替代专用的包埋剂,我们实验室都用过。但是个人感觉还是用包埋剂的好,主要是包埋的时候不会产生气泡空泡,这在贴片的时候是很讨厌的事情。另外,胶水中的水分含量高对于组织包埋同样会产生不好的影响。3.冰冻切片用不用做抗原修复。一般来讲,做冰冻切片的目的就在与保持良好的抗原性,因此不用做抗原修复。但个人认为,要不要抗原修复,怎么修复,并没有一个绝对的答案。如果做的结果不好,就要从多个方面找原因,包括胰酶修复,蛋白酶修复等都可以尝试。
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MaggieRen2004 3.冰冻切片用不用做抗原修复。一般来讲,做冰冻切片的目的就在与保持良好的抗原性,因此不用做抗原修复。但个人认为,要不要抗原修复,怎么修复,并没有一个绝对的答案。如果做的结果不好,就要从多个方面找原因,包括胰酶修复,蛋白酶修复等都可以尝试。楼上的战友您好!您讲到的冰冻切片胰酶修复,蛋白酶修复,麻烦您能否说的具体点,谢谢!
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十二万分感谢上面两位老师的回复,受益匪浅!另外:1、我们的冰箱可以最低达到-60 这样保存可以吗?2、4%中性甲醛和4%多聚甲醛有何区别?
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TO:helloabing老师
比较感兴趣您的方法,我的标本可能要厚2MM,大小1-1.5CM,应该算较大的是吗?切片的时候再包埋的方法是什么?谢谢!
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dlchq 十二万分感谢上面两位老师的回复,受益匪浅!另外:1、我们的冰箱可以最低达到-60 这样保存可以吗?2、4%中性甲醛和4%多聚甲醛有何区别?第二个问题本人不太了解,无法答复。抱歉!至于第一个问题,我感觉应该是可以的。现在实验室常用的低温冰箱大部分是-80或者-70,好像-80更多一些(我们原来实验室是-70,不过周围实验室好像都用的-80)。所以-60好像也可以(仅仅是好像,呵呵!)。不清楚实验室的低温冰箱为什么都在-70或者-80,是随便设的一个温度,还是有什么科学依据,不得而知!应该是有科学依据的,您自己再查查相关资料吧。
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我就是用冰转移组织块的,从-80度冰箱到切片机大概花了十几分钟的时间,结果切出来的片子里面全是小洞,形态结构全部看不清楚,那个郁闷呀!下次也用液氮试试看,希望能好点。
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dlchq TO:helloabing老师
比较感兴趣您的方法,我的标本可能要厚2MM,大小1-1.5CM,应该算较大的是吗?切片的时候再包埋的方法是什么?谢谢!您的组织块应该算是比较大的,所以可以切片的时候再包埋。至于方法,不统一,全凭个人经验,以下是我们实验室的包埋方法:1,先在托上(就是固定组织块的那个小东东)涂一些包埋剂,不要涂的太少,切片的时候容易脱落;也没必要太多,浪费。2,等包埋剂快要全部凝固但最上面还有一点点没凝固的时候,把组织放在上面,这样即可以使组织被固定住,又不至于使组织过多地处于液体状态的包埋剂中而使组织外面一层化掉。3,然后由里到外,从下到上,一点一点地往组织上涂包埋剂。注意一定要是渐进式的(先涂一点,等凝固了,再接下来涂其他部分),不要图快而用包埋剂一次性把整个组织都包起来,这样容易使组织化掉。4,直到整个组织块都被包埋起来了,就OK了。不知道说得是否明白,仅供参考!
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helloabing edited on
我也作冰冻切片,观察组织荧光。我把组织用多聚甲醛固定以后在用20%的蔗糖浸泡,时间根据组织大小而定,但是一定要等组织沉到容器底部不会在漂浮上来才行。目的是为了保护冰冻切片过程中温度过低造成的细胞质结成冰晶而破裂。做免疫组化之前我一般会抗原修复,否则效果不好。冰冻切片作抗原修复的方法是:将片子放在盒子中,加入0.01M的柠檬酸缓冲液,放在水域锅中96-98摄氏度30分钟,但是千万不能让水沸腾,这样片子很容易脱落。
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4%多聚甲醛固定对冰冻切片和免疫组化都没有影响,但是在甲醛中固定时间不宜过长,时间长了甲醛会分解成甲酸,就会影响实验结果了,长时间保存请将组织至于30%蔗糖水中。
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请注意:蔗糖脱水一定要缓慢,即“梯度脱水”,依次从甲醛到5%,10%,15%,20%,30%的蔗糖水,每次发现组织沉底了就可以进入更高浓度蔗糖。有时侯含水量高的组织,如脑组织等要脱上几天水呢!这样的组织切片才不会有洞。
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再次感谢大家!这里的人情味很浓,大家都很热心,建议也很切实,真高兴能有这么多老师和战友在一起,自己才不会感到孤立无援!后悔没能早点来到这里!:I确定一下,根据上面各位老师的建议,我个人的理解是这样的:我的组织块取后,立刻放入液氮速冻,可放入-80冰箱(我们是-60冰箱)长期保存。切片前涂包埋剂(打算切10UM厚)(我做的是胃组织,您认为冷冻箱的温度多少合适?),切片附贴于载玻片上,然后多聚甲醛固定(上面老师提到时间不宜过长,那么多长时间合适?),放入蔗糖“梯度脱水”,然后可以加一抗,4度孵育24小时,PBS洗涤,再加二抗,DAB成色,HE复染,DPX封片,显微镜观察,您们认为这样可行吗?:)
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dlchq edited on
我们实验室做法是先用4%多聚甲醛固定过夜,再30%蔗糖4度浸泡至沉底,然后按常规免疫组化步骤操作,不用抗原修复。使用4%多聚甲醛固定过夜的目的是可以消除细胞溶酶体等的活性,迅速固定抗原,防止抗原丢失。30%蔗糖脱水除了脱水防止冰冻过程中细胞内形成冰晶,另外还可以消除组织内残留的甲醛,对细胞具有保护作用。
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dlchq 十二万分感谢上面两位老师的回复,受益匪浅!另外:1、我们的冰箱可以最低达到-60 这样保存可以吗?2、4%中性甲醛和4%多聚甲醛有何区别?
关于第二个问题,我以前在丁香园看到有战友讲过,4%多聚甲醛解聚后的浓度与10%中性甲醛浓度相当。因为中性甲醛在生产工艺过程中会产生上些甲酸等物质,对细胞的超微结构有破坏作用,所以大多用4%多聚甲醛。
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我最近也正在做冰冻切片,新手上路之前也查了很多相关的资料方法,但是一直没有个具体的方案因为需要事先取材保存,我采用的是4%多聚甲醛固定后在70%乙醇中保存,还有一部分是蔗糖中保存,-30度。最近两天才开始切片,切片的时候也遇到了不少问题:1,切出来的片子老卷,或者皱到一起,不知道是不是跟刀片有关2,切完之后在37度烘干,应该烘到什么样的程度,昨天烘了一个小时染色到一半都有些材料掉了3,如果切完之后不染色应该怎么保存呢刚开始实验,问题有点多,希望各位前辈多多指点3KS!
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还有个问题,用的包埋剂总是会有很多气泡,有没有办法避免啊?谢谢了
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dlchq 再次感谢大家!这里的人情味很浓,大家都很热心,建议也很切实,真高兴能有这么多老师和战友在一起,自己才不会感到孤立无援!后悔没能早点来到这里!:I确定一下,根据上面各位老师的建议,我个人的理解是这样的:我的组织块取后,立刻放入液氮速冻,可放入-80冰箱(我们是-60冰箱)长期保存。切片前涂包埋剂(打算切10UM厚)(我做的是胃组织,您认为冷冻箱的温度多少合适?),切片附贴于载玻片上,然后多聚甲醛固定(上面老师提到时间不宜过长,那么多长时间合适?),放入蔗糖“梯度脱水”,然后可以加一抗,4度孵育24小时,PBS洗涤,再加二抗,DAB成色,HE复染,DPX封片,显微镜观察,您们认为这样可行吗?:)冷冻箱?是切片机里面的温度吗?-20就可以
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slena 还有个问题,用的包埋剂总是会有很多气泡,有没有办法避免啊?谢谢了1,先用包埋剂由上到下,由内到外一点一点地把组织块包好,在向外延伸,直到整个组织块包完全。2,也可以把组织块先在包埋剂里面“打个滚”(在切片机里面操作),这样组织块外面就包了一层薄薄的包埋剂,然后再正常包就可以了!
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helloabing edited on
slena 我最近也正在做冰冻切片,新手上路之前也查了很多相关的资料方法,但是一直没有个具体的方案因为需要事先取材保存,我采用的是4%多聚甲醛固定后在70%乙醇中保存,还有一部分是蔗糖中保存,-30度。最近两天才开始切片,切片的时候也遇到了不少问题:1,切出来的片子老卷,或者皱到一起,不知道是不是跟刀片有关2,切完之后在37度烘干,应该烘到什么样的程度,昨天烘了一个小时染色到一半都有些材料掉了3,如果切完之后不染色应该怎么保存呢刚开始实验,问题有点多,希望各位前辈多多指点3KS!1,片子卷属于正常现象,不过有时候也是可以避免的。我切片的时候是把组织块修成菱形,一个角朝下,这时候如果卷的话就可以把这个角切掉,使组织块跟刀片接触的部分是平的,这样就可以避免切出来的片子卷。一般跟刀片是没关系的,至少我感觉是这样。2,其实完全可以不烘的,我感觉材料掉很可能说明您的载玻片处理的不好!2,可以-80保存。短时间内也可以-20.
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万分感谢helloabing!如果不烘干的话对后面的实验会不会有影响啊,切片之后要做染色,后面还要做杂交,流程多的话很容易掉片吧冰冻切片后打算用来做RNA原位杂交,这样就会存在RNA酶的污染问题,冰冻切片机(我们实验室的是LEICA CM1900)需要经过怎样的处理阿?有没有人做过,可以给点建议阿?3KS !:-)
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还要请教祁门红茶一个问题:用蔗糖脱水后,是就将材料在30%的蔗糖溶液中低温(-20度)保存吗?那在切片前是不是还要把材料拿出来用PBS洗两遍,洗去蔗糖阿 ?也请各位高手指点阿
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slena 万分感谢helloabing!如果不烘干的话对后面的实验会不会有影响啊,切片之后要做染色,后面还要做杂交,流程多的话很容易掉片吧冰冻切片后打算用来做RNA原位杂交,这样就会存在RNA酶的污染问题,冰冻切片机(我们实验室的是LEICA CM1900)需要经过怎样的处理阿?有没有人做过,可以给点建议阿?3KS !:-)1,不会掉片的,冰冻切片不像石蜡切片,因为石蜡切片修复的时候容易掉。我们做原位杂交的步骤应该比你做染色的步骤要多吧,但从来也没掉过,呵呵!2,冰冻切片机不用处理,只要调到-20就可以了。切片的时候戴个手套。其实RNA酶主要是内源性的,外源性的影响很小(经验),当然还是注意点好。
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我有时候做出来的切片组织结构非常不好。做切片时,每次从液氮罐中取出组织,做切片的老师都要等它化掉,然后修剪一下,去掉两头,留下中间。一直搞不清楚到底是操作上的问题还是组织取样的问题?
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hpcl 做切片的老师都要等它化掉。MY GOD!!!这就是问题所在!化掉后组织变得疏松并且变形!为什么不事先把组织块修好,而非等到切的时候再修呢?即使切片的时候再修也没必要把组织块化掉啊。
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helloabing edited on
有几个问题想请教:急!1、有老师说4%多聚甲醛固定时间不宜太长,那么以多长时间合适?2、30%蔗糖是用蒸馏水配还是用PBS液配?PBS液如不说浓度指的一般是多少?0.1MPBS液是否等于0.1mmol/LPBS液?免疫荧光法所需PBS液配制时需要加青霉素或链霉素或吗?标本在30%蔗糖液中最多可保存多长时间?多少度保存?3、有人做过肌间神经从铺片吗(我要做的是胃组织),可否传授一下具体方法?谢谢!
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dlchq edited on
关于丁香园君,已阅读到文档的结尾了呢~~
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手冻肿了用热水洗好还是凉水洗好?
手冻肿了,应该用温水洗。因为热水或者冷水,都会刺激到冻肿的部位,引起发痒或者刺痛,这种做只会让症状更严重。冬天手冻肿了,治疗方法:1、萝卜法将萝卜切厚片,煮熟趁热贴敷患处,凉后更换。连敷3-4天可愈。2、生姜法生姜火上烤热,切片擦涂患处,可消肿止痒;或生姜切碎,浸泡于70%的酒精中,20天后用酒精擦涂患部,日数次。3、桔皮法鲜桔皮3-4个,生姜30克,加水2000毫升,煎煮30分钟,待水稍凉后浸泡患处,每次30分钟,水凉再加热。冬天预防冻疮的方法:1、严冬季节皮肤暴露处应当保护,如出门时使用口罩、手套、防风耳罩。涂少量凡士林可减少皮肤散热,也有保温作用。鞋袜大小、松紧要合适,不要过紧过小。2、潮湿可加速体内热量的散发,容易发生冻伤,因此要保持服装鞋袜的干燥,受潮后要及时更换,有利于保温。3、要避免肢体长期静止不动,坐久了、立久了要适当活动,以促进血液循环、减少冻疮发生。4、冬季易患冻疮的人,除皮肤起水泡或溃烂者外,可用生姜片或辣椒涂擦易患冻疮的部位,每日2次,可减轻或避免冻疮的发生。5、对已患冻疮的部位,应加强保暖。6、也可用100瓦灯泡代替红外线仪进行照射治疗。并经常按摩,以促进血液循环。约1周后,症状即可消失,表皮逐渐脱落,不留疤痕。7、如果局部除上述症状外,还有水泡出现,较大的可用不含酒精的消毒剂(如1%新洁尔灭溶液)等,清洁患处和周围皮肤后,用注射器吸出其中渗液,并涂些抗菌药膏加以包扎。小的水泡不需要刺破,经过2~3周后,水泡逐渐干枯,形成黑色干痂,脱落后创面已经愈合。8、对已经溃破的创面,可先消毒周围正常皮肤,再用无菌温盐水清洗创面后,涂以抗菌药物加以包扎。并经常检查创面愈合情况和更换药物及包扎纱布等。9、冬季室外工作者应注意休息和营养,以增加抗寒能力。有人外出时喜欢饮酒挡寒,但酒后血管扩张,增加人体热量向外发散,反而不利于抗寒,且容易引起感冒。冻疮治疗要因人而异,因病各异,合理恰当的治疗方法,往往可获得事半功倍的效果,蜻蜒点水般的治疗是不会奏效的。“冻疮早治,未发先治”,才能达到不发的目的。
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用正常体温的温水泡。不能直接用太高温度的热水。因为冻住的手毛细血管和皮肤组织收缩,有大量的积血在血管里。如果直接用热水烫可能导致毛细血管破裂。
用热水常洗下。还有个最简单的方法就是在家用很热的辣椒水泡,一个星期肯定好,我的都好了药店里的十滴水据说很管用,不过我没有 买到 用白萝卜煮水泡。可以消肿我试的,现在好了
用凉水好,每年都要习惯用凉水洗脸洗手,慢慢地不怕冷,不会再冻肿。我以前也是了。
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冻肿了一定要用冷水
热水会使你的皮肤 在即冷的情况下忽然升温 最后导致烫伤 最好是先搓手
等手有热的感觉了
以手感觉不烫为准
二者都不好。宜用温水。
拿冬瓜皮熬好后洗手洗脚,治疗冻疮效果不错~~
冻疮是一种发生于寒冷季节的末梢部位皮肤局限性淤血性红斑性疾病。是冬季常见病,一般在气温10℃以下发生,至春季气候转暖后自愈,但入冬后又易再发。
未破溃的冻疮可用促进血液循环的药物如10%樟脑醑或辣椒酊局部揉擦。民间用辣椒煎水局部烫洗,有一定效果。还可厚搽蜂蜜猪油软膏(猪油30%,蜂蜜70%),每日一次。已成溃疡时应用5%硼酸软膏。红霉素软膏、0.5%新霉素软膏等一日三次涂搽并包扎。近来多用复方貂油防冻膏防治各型冻疮。也可氦氖激光器照射治疗。每日一次。10次为一疗程,可防治复发。内服药物可用末梢血管扩张剂如烟酸或维生素E等,硝苯吡啶10-20mg,3次/日,对本病有防治作用。中医治则为温经,通络,活血化瘀,方用当归四逆汤或阳和汤加减。
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