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双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计
双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)【技术背景】目前检测HBsAg的技术有：①两位点一步法：可出现钩状效应，待测抗原浓度过高出现假低值或假阴性；②两步法：无钩状效应；③一步半法：减少钩状效应。本实验所采用的方法为一步半法，此法是基于抗原抗体特异性反应的原理，因此对于所检测的抗原其对应的抗体是特异性的，待测抗原必须存在于抗体结合的抗原决定簇，因此，此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。【病人准备】虽然在进行乙肝表面抗原检查前没有空腹检查的要求，但检查前一天应注意不喝酒、不服用任何对检测结果有影响的药物。【标本的采集与保存】血清：采用正确医用技术采集静脉血2ml，待血液自然完全凝固后，转/分离心10分钟，取新鲜血清用于检测。血浆：用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一作抗凝剂）采集静脉血2ml，转/分离心10分钟，取新鲜血浆用于检测。血清样品：5天内测定，可以放置于4℃；超过一周，-80℃保存2.实验前准备1） 用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本，平衡至室温（18-25℃）；2） 将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。【原理】将抗HBs 的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清和酶标记抗体（抗HBs-HRP），血清中HBsAg与微孔板上的包被抗体（抗HBs）结合，洗涤分离后，加人酶底物系统，留在微孔板表面抗HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物中的HRP催化底物进行显色反应。根据显色反应颜色的深浅（吸光度A高低）与血清标本中HBsAg含量成正相关，以此判定血清样品中HBsAg 的有无及相对含量。显色为阳性，不显色为阴性。【试剂与器材】1.试剂
抗HBs包被的微孔板、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止剂、封板膜2.器材
加样枪（20μL、50μL -250μL）、恒温设备（恒温水浴箱或恒温箱）、洗板机、酶标仪、吸水纸、消毒缸要求：a ）酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %，分别在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之间，吸光度（A 值）要求可以测到小数点后两位；b ）移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ，分别在99- 101μL和49.5μL-50.5μL 之间；c ）恒温系统在37 ℃ 、43℃ 的温度变异应成±1℃ 。【操作方法】1.编号将微孔板按序编号。每批实验应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，其余为待测血清孔（3孔）。2.加样品稀释液：每孔加入样品稀释液20μL或一滴，空白孔不加。3.加样：在待测血清孔、阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应血清100μL/孔。轻轻振荡混匀。4.温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。5.加酶标物：小心揭掉封板膜，每孔加入酶标试剂50μL或1滴，空白孔不加。轻轻振荡混匀。6.温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。7.将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水稀释20倍后备用。8.洗板：小心揭掉封板膜，手工洗涤5次，每次都要在吸水纸上尽量拍干或用洗板机洗涤5次，最后一次尽量扣干。9.显色：每孔加显色剂A和显色剂B各50μL或1滴，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30min。10.比色测定：每孔加终止剂50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪主波长为450nm，次波长630nm，10min内测定各孔吸光度（A）值【结果判定】1．临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照孔A均值×2.1 （阴性对照孔A值低于0.05者，按0.05，高于0.05按实际A值计算计算）2.计算S / CO比值（S为样品A值）3.阳性结果：样品A值≥CO值或S / CO ≥ 1为HBsAg阳性4. 阴性结果：样品A值＜ CO值或S / CO ＜ 1为HBsAg阴性5.有效性判断：阴性对照孔A值≤0.1，阳性对照孔A值≥0.8。否则试验无效。【 质量控制】室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。一、 分析前质量控制1、标本采集：规范操作意识；防止溶血；要正确使用抗凝剂和真空采血管；2、标本处理：及时分离血清或血浆；高危标本应注明；标本闭光、应专人运送。二、分析中质量控制1、试剂、校准品和耗材必须取得国家相关部门的批文，在有效期内正确使用，妥善保藏，质检;2、选购高质量、有批文的仪器设备，要正确使用、定期检查、维护和保养，使其在最佳状态下运转；3、实验室内检测结果比对：一个实验室对同一项目用不同方法，试剂，仪器，或在不同地点进行检测，需对不同方法，试剂，仪器，不同地点的检测结果进行比对；4、严格规范操作程序：HBsAg测定项目和仪器应有SOP，并严格遵守；5、保持检测系统的完整性和有效性，对检测系统的精密度、准确度、可报告范围、参考区间等性能进行核实、确认和评价；6、对于脂血、溶血标本应采取一定措施，做室内质控和室间质控；7、室内质控应连续每天监测，且试验时带质控物随标本一起测定，并对质控结果进行分析判断。三、检验后质量控制1、检验结果的审核和发放：评价HBsAg的测定结果与检验对象的符合性；根据检验结果是否需要作其他补充检查；有无异常结果；应对检测系统和检验过程进行评审，以保证检验结果的真实性和可靠性；判断标本的检验结果是否可靠，检验报告是否可发出。2、室间质量控制：每年参加卫生部、省以市级临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。
【影响因素与注意事项】（1）标本：①乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求。②血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。③采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。④不使用任何热处理过的标本，严重溶血或脂血标本不能使用。 高浓度RF、高胆红素、溶血、高脂等标本可能干扰实验，应避免使用。⑤.存放：样本于2-8℃可储存一周；样本长期储存应放置于-20℃或-20℃以下环境中，且不宜反复冻融。（2）试剂盒：试剂盒从冷藏环境中取出，应平衡至室温后再使用。不同批号或不同厂商的试剂切勿混用或互换。（3）检测： 检测必须符合国家有关HBsAg检测的实验室管理及安全的规定，并按有关规定处理所使用组分及样品。（4）加标本和试剂液时应准确加入，且经常对加注器进行校正。不同试剂分开加入，避免交叉污染。。（5）温度、时间： 严格控制反应温度和时间，并尽量使用移液器加样，结果判定以酶标仪读数为准。（6）洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板孔干燥。封板膜不能重复使用（7）显色时必须现加底物液，后加显色剂液，以免显色过低。（8）所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。（9）酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责技术校准过的，符合实验标准。（10）尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源 ：以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。
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一步法和二步法检测乙型肝炎病毒表面抗原的比较
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这个问题我百思不得其解，望高人能够指点一下
09-06-04 &匿名提问
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。    在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。    在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成&夹心复合物&。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。    假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。    双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。    双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
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