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自身抗体检测技术简介及应用
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自身抗体检测技术简介及应用
主讲人：戴永刚
自身抗体　　
自身抗体是指针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应。—旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体，但不会发生疾病，但如果自身抗体的滴度超过某—水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾病。
中有许多自身抗体，其中最重要的是。另外，（ACA）、中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）、（AMA）、抗红细胞抗体、抗血小板抗体、、抗神经原抗体、、抗、抗胰岛素体抗体（AIA）等也都是自身抗体。
一、自身抗体产生原因
　　抗体一般是由于外来蛋白质或其他物质（尤其是致病菌）进入机体后由免疫系统产生，用于免疫反应以消灭外来的有害物质。通常情况下，免疫系统能够识别并忽视机体自身的细胞，并不对其产生抗体；同时，免疫系统也不会对环境中没有威胁的物质（如食物），产生过度反应。但是，在特定情况下，免疫系统对于机体自身的物质的识别失效，把它们认为是外来的入侵物，从而产生针对这些物质的抗体（即自身抗体），引发自身免疫。这些自身抗体会攻击机体自身的细胞、组织、器官，引起炎症反应，对机体造成损害。
　　自身抗体的产生可能是致病抗原(细菌、病毒等)与自身成分之间存在某些相同的分子结构：出现了与自身抗原发生交叉反应的免疫应答；也可能是某些感染因素使自身抗原变性，免疫系统对这些暴露的新抗原产生自身抗体。
　　自身抗体致病作用尚不清楚，它究竟是的“原因”还是“后果”有不同看法，对有高滴度自身抗体，而无临床症状者可不必治疗，但应定期到医院随诊复查。
二、自身抗体导致的疾病
抗双螺旋DNA
系统性红斑狼疮
抗外切体复合物
硬化性肌炎
抗Ro或La蛋白
系统性红斑狼疮、婴儿房室阻滞、原发性干燥综合征
抗Smith抗原
系统性红斑狼疮
抗磷脂综合征
抗单链退火蛋白或单链结合蛋白
干燥综合征
抗中性粒细胞细胞质 (c-ANCA)
韦格纳肉芽肿
抗中性粒细胞核周 (p-ANCA)
显微镜下型多血管炎、Churg-Strauss综合征、系统性血管炎 （非特异）、结节性多动脉炎（并未得到证实）
抗IgG（类风湿因子）
类风湿性关节炎
抗拓扑异构酶
慢性自免疫肝炎
原发性胆汁性肝硬化
抗烟碱型乙酰胆碱受体
重症肌无力
抗电压控门钙离子通道
Lambert-Eaton综合征
抗甲状腺过氧化物酶 (microsomal)
桥本甲状腺炎
格雷夫斯病
副肿瘤性小脑综合征
抗电压控门钾离子通道 (VGKC)
边缘叶脑炎
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体 (NMDA)
自身抗体检测方法
一、免疫印迹
免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
1、免疫印迹法的基本原理
将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。
2、免疫印迹法的基本步骤
免疫印迹法（ 以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。
3、免疫印迹法的优点
　　免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点：
　　3.1、 湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作；
　　3.2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔；
　　3.3、 免疫印迹分析只需少量试剂；
　　3.4、 孵育、洗涤的时间明显减短；
　　3.5、可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定；
　　3.6、结果以图谱形式可长期保存；
　　3.7、 免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。
二、间接免疫荧光
（Immunofluorescence technique ）又称，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在、生物化学和的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用进行组织或内抗原物质的定位。
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
　　标记的抗抗体是，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
2、常见荧光物质
　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
　　⑴（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
　　有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
　　⑵四乙基（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
　　最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。&
　　(3)镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3
　　螯合物的激发光宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）又称抗核酸抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
　抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)，（二），（三），（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为。ANA 主要存在于，也见于、，甚至及LgE中。
　　常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。
一、抗核抗体分类
抗核抗体的分类，由于核抗原不同，有多种不同的ANA 。
1、抗DNA抗体
　　抗DNA抗体有抗双链DNA（ds DNA）和抗单链(ss DNA)抗体之分。抗ds DNA抗体与SLE的关系密切，且随疾病的活动度而升降，病情好转者其滴度多下降甚或转阴。抗ss DNA抗体则与抗ds DNA不同，可在多种疾病出现，包括一些非自身免疫性疾病，如和感染。故在临床上无实用价值。而抗ds DNA抗体被认为是（SLE）所特有。
　　测定本抗体的方法有法（IFA），放射免疫法（Farr法），ELISA，血凝法等。我国的临床工作者多采用前两种方法，尤其是IFA法。它是以短膜虫或马锥虫为底物，利用其体内含有的纯双链DNA，进行免疫荧光测定。 稀释度达1：5或更高者称为阳性。以Farr法测抗DNA抗体，结合率&20%者为阳性。据资料显示，SLE阳性率为62%，活动期67.7%，缓解期29.1%，非SLE者阳性率虽达20%，但其结合率多在30%以下。有7%的正常人呈假性反应。结合率高于30%者几乎都是活动期SLE。
抗DNA的自身抗体在SLE发病中起一定作用。在一些SLE患者，DNA大分子存在于循环中或粘附于多种器官的微血管结构，这些循环或器官原位抗原型DNA均可与循环自身抗体发生反应，形成免疫复合物，激活炎症系统，在一些器官如肾脏，肺和脑组织引起免疫复合物介导的疾病，导致组织损伤。
2、抗可提取的核抗原
　　（extractable nuclear antigen.ENA）抗体，此抗体原经盐水或磷酸缓冲液处理，易从胞核中提取出来，且不含DNA。应用，抗ENA抗体型染色多呈斑点型。此类抗原分为九种，故产生九种相应抗体。
　　（1）抗核糖核蛋白抗体(antiribonucleoprotein；)：抗原来源与SM相同。它对去氧核糖核酸酶不敏感，但对核糖核酸酶，胰酶敏感。1972年把它作为诊断混合性结缔组织病（MCTD）的重要血清学依据。但以后发现本抗体可在多种出现，不具备对某个病的特异性，但有助于鉴别结缔组织病和非结缔组织病。抗核RNP抗体见于近32%的SLE患者，几乎见于所有MCTD患者。
　　（2）抗SM抗体：SM系一患者Smith的简称。1966年Tan&Kunkel首先在患者Smith体中发现。抗原来源于小牛，兔胸腺，人脾等组织的一种酸性糖蛋白。抗SM抗体可见于1/3或以上的SLE患者，不出现于其他疾病中，对SLE诊断有特异性，成为很有价值的SLE诊断标志，但无此抗体不能排除诊断。
　　（3）抗SS-A抗体：系在发现Sjogren氏综合征（SS）的"A"抗原后而命名，主要见于SS。本抗原可以从人、牛、猪脾中提取。它除存在核内外，也存在于细胞浆内。对胰酶敏感，对核糖核酸酶抵抗，能耐热（56度）。
　　（4）抗Ha抗体：抗Ha抗体可与小牛胸腺可溶性核提取物(以及小牛和鼠的肝提取物)起反应。见于SS患者,亦称之为SS-B抗体.应用沉淀素反应，结合以及荧光技术检测。目前多数人认为13%SLE及33%SS患者有抗Ha沉淀性抗体。
　　（5）抗PM-1抗体：系多发性肌炎的特异性抗体。抗原系小牛胸腺核提取物，有人暂称之为PM-1。最初有人应用，确定该抗体特性，在皮肌类患者中发现PM-1抗体。有人测定在多发性肌类患者阳性率13.6%，皮肌类（DM）20%，系统性硬化并肌炎25%，SLE并肌炎偶有阳性，在其他疾病和正常人均阴性。说明本抗体对肌炎诊断有一定特异性。
　　（6）抗MA1抗体：为近年发现抗核酸蛋白抗原的抗体，称之为抗MA1抗体。该抗体只出现于某些严重的SLE患者中。
　　（7）抗Scl-70抗体：因出现在硬皮病且其分子量为70000，故名。抗原为碱性，北京协和医院对系统性硬化用免疫双扩散法测定得抗Scl-70抗体阳性率为60%。在其他结缔组织和非结缔组织病偶有阳性，而正常人均阴性，说明本抗体有较高的特异性，是系统性硬化的。
　　（8）：因患者而命名。国外报道在多发性肌炎（PM）患者阳性率为30-50%，合并有的肌炎则达60%，而在（DM）患者则低于10%，在其他疾病均阴性。
　　（9）抗Ku抗体：因患者命名，国外报道本抗体多见于合并有肌炎的系统性硬化患者，阳性率达55%。
总之，抗PM-1，抗Jo-1，抗Ku都与肌炎有关。
3、抗组蛋白抗体
组蛋白是一组，含有稍高量的赖氨酸及精氨酸。是与DNA形成的复合物，结合成DNA一组蛋白。组蛋白抗体见于药物诱发的SLE。国外报道，用免疫荧光三步法测23例药物致狼疮阳性率为96%，12例SLE中42%阳性。北京协和医院以同样方法检测488例服用异烟肼，68例服用苯妥英钠，40例服用复降片（内含肼苯哒嗪），都在服用6个月以上者和另133例服他巴唑3个月以上者，无一例查到本抗体。这种差异可能与近年来我国服用肼苯哒嗪和的患者较少之故，也不能除外人种不同而造成的差异。
4、抗着丝点抗体
其抗原为紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质。因此需要选择分裂相活跃的细胞作为底物，这种细胞的着丝点较易被暴露。多选用人喉癌（HEP-2），其优点是核大，分裂相多。国外报道本抗体多见于（即表现为软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，）。阳性率达90%以上，称之为CREST的标记抗体。根据协和医院观察测定结果，我国系统性硬化绝大部分是弥散型，CREST型极少见；抗着丝点抗体的阳性率在系统性硬化为20%，CREST型38%，弥散型10%，说明它不一定是CREST型的标记抗体。
5、抗核仁抗体
　　抗核仁抗体是一组对核仁不同RNA成分的抗体。由于成分（4-6sRNA）不同，因此构成斑块，斑点，均质等不同图型。本核体在以HEP-2细胞为底物间接免疫荧光检查为明显。协和医院免疫组的阳性率是PSS38.5%，SLE6.1%，RA15.3%，（阳性者都合并有指端硬化），SS8.6%，PM/DM10.0%，雷诺现象25%，其他结缔组织病和正常人均阴性。抗核仁抗体不仅在PSS最多见，且滴度亦高，故它对PSS诊断有一定的帮助。
抗核抗体的检测在自身免疫病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效和预后估计中具有较大的意义，因此常将抗核抗体的检测作为自身免疫病的重要初筛试验。
二、抗核抗体的意义
　　（1）SLE：约99%（86%～100%）的活动期SLE病人ANA阳性，其滴度也常为1:80，但它的特异性差。对于未经治疗的疑似患者，多次检查抗核抗体，若结果阴性，应考虑其他疾病的可能。ANA阳性本身不能任何疾病，但ANA阳性且伴有特征性狼疮症状则支持狼疮诊断。ANA阴性几乎可除外SLE的诊断。但应注意有5%的SLE病人ANA可为阴性，这其中大部分为抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性，因为测定ANA通常用鼠肝或鼠肾做底物，而这些组织核内含SSA、SSB、Jo-1、rRNP抗原相对较少，所以不易测出其相应抗体。可加做人喉癌上皮细胞为底物的方法进行检测。
　　抗核抗体谱包括抗核抗体（ANA）、抗DNA抗体、抗核内可溶性抗原抗体（ENA）。ENA又包括抗抗体（Sm）、抗（RNP）抗体、抗干燥综合征A（SSA/Ro）抗体、抗干燥综合征B（SSB/La）抗体、抗硬皮病-70（Scl-70）抗体。临床意义为：[1]ANA：ANA为一系列抗细胞核抗原的自身抗体的总称。一般应用免疫荧光的方法检测。根据核荧光的类型分为以下几种类型：①周边型（M 型）：核周边的荧光增强呈环状。M型的ANA主要有组成，故高滴度的M型ANA几乎仅见于SLE，因此有助于SLE的诊断。②均质型（H 型）：整个细胞核呈一片模糊而均匀的荧光。H型的ANA主要有抗脱氧核蛋白抗体组成。高滴度的H型ANA主要见于SLE，而低滴度H型ANA偶可见于药物性狼疮，JRA等其他自身免疫性疾病。③斑点型（S型）：核内荧光呈颗粒状。是有抗Sm抗体，抗SSB/La抗体、抗Scl-70抗体等多种抗体组成。因此S型ANA可见于SLE，混合性结缔组织病（MCTD），硬皮病（PSS），干燥综合征（SS），多法性肌炎及皮肌炎（PM或DM）等自身免疫病。[2]抗DNA抗体：抗DNA抗体主要为抗双链DNA（ds-DNA）抗体。主要见于SLE患儿，其他疾病及正常人很少出现，是 SLE的诊断标准之一。高滴度的抗ds-DNA抗体不仅表示疾病的活动性，而且提示疾病累及肾脏的可能性。[3]ENA：①抗Sm抗体：其抗原主要为U簇小分子细胞核糖核蛋白微粒。抗Sm抗体是SLE的特异性抗体，为SLE的诊断指标之一。Sm抗体与狼疮的肾脏和中枢神经病变有关。②抗RNP抗体：其抗原主要为U1小分子细胞核糖核蛋白粒子，主要见于，患者SLE、PSS或DM的临床表现，高滴度的RNP抗体为混合结缔组织病的标志。③抗 SSA/Ro抗体：抗SSA抗体主要参与皮肤的病理损害，引起重度过敏为特征的急性皮肤型狼疮的皮损，当母体血清中含有IgG类的抗SSA抗体，可引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损，该抗体还可以与胎儿的心脏的传导系统结合，导致新生儿先天性心脏完全型传导组滞。④抗SSB/La抗体：该抗体是目前公认的干燥综合征的标志抗体，其他免疫性疾病如果发现抗SSB抗体阳性，患者一般有继发性干燥综合征。⑤抗Scl-70抗体：其仅见于硬皮病，是硬皮病的特异性抗体。因此你还要进一步检查查明引抗核抗体阳性的病因。
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