什么叫酶？酶的作用有什么特性？影响酶活力的主要因素有那些？_百度知道
什么叫酶？酶的作用有什么特性？影响酶活力的主要因素有那些？
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酶物细胞自合种催化剂（物催化剂）其基本蛋白质；高催化效率、高度专性、调节性温度pH值影响酶力比较重要两素
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在酵母中各种各样进行着生命活动的物质被发现，然后被这样命名。
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共价催化（covalent catalysis）：一个底物或底物的一部分与催化剂形成共价键，然后被转移给第二个底物。许多酶催化的基团转移反应都是通过共价方式进行的。
酶的催化机理和一般化学催化剂基本相同，也是先和反应物（酶的底物）结合成络合物，通过降低反应的能来提高化学反应的速度，在恒定温度下，化学反应体系中每个反应物分子所含的能量虽然差别较大，但其平均值较低，这是反应的初态。
S（底物）→P（产物）这个反应之所以能够进行，是因为有相当部分的S分子已被激活成为活化（过渡态）分子，活化分子越多，反应速度越快。在特定温度时，化学...
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能催化底物反应具物性物质高效性专性性温度PH等
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酶的筛选、表达、设计和生产
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酶发现于19世纪后半叶，在20世纪初开始应用于工业。典型的例子有：在纺织生产中用淀粉酶消除凝结在纺织品上的淀粉；奶酪生产中使用的牛凝乳酶；胰酶应用于皮革软化和生丝脱胶；有利于啤酒的稳定性。在过去的10—20年中，由于生物技术，特别是遗传和蛋白质工程技术的发展，酶在洗涤剂、纺织、谷物湿法碾磨、食品、果汁和造纸等方面均有着广泛的应用。酶作为应用在中是近年来的事。酶应用在饲料工业中的益处包括（Annison,1993；Bedford和Schulze,1998；Simon,1998）：① 平衡动物内源酶体系的缺陷。② 消除饲料中的抗营养因子。③ 提高饲料利用率。随着人们对酶的理解不断深入，酶的应用领域不断拓展。提供更快捷的鉴别方法、发现新的酶种、提高酶的活力是成功应用的关键要素。本章将专门评述当前应用于发现、研究和发展以微生物为主要来源的新酶种的技术。背景酶的分类和来源酶是极其有效的、具有高度专一性的催化剂，无毒， pH值和温度适性范围也很宽。酶分为如下几类（International Union of Biochemistry and Molecular Biology,1992）：① 氧化还原酶，催化转移氢原子，这些酶有时也称为脱氢酶或还原酶。当氢的受体是氧时，这些酶称为氧化酶。② 转移酶，转移一个基团，例如糖基，从一个化合物转移到另一个化合物。③ 水解酶，催化特定化学键的裂解，包括碳氧键、碳氮键、碳碳键和磷氧键。特别当水是受体分子的转移反应。目前许多在饲料工业中应用的酶，例如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和磷酸酶，都是水解酶。④ 裂解酶，如同水解酶一样，裂解化学键。作用机理是产生双键或环状化合物，他们同样也可以催化发生逆反应，在双键上加入其它基团。⑤ 异构酶，催化在同一个分子内结构发生变化。⑥ 连接酶，通过水解高能化合物（如ATP）释放能量催化2个分子的连接反应。目前为止，绝大多数酶都是由适合中性的或偏碱性环境的微生物产生的，而且这些微生物仍然是商业酶制剂很有价值的源泉。其它一些微生物体系，例如：一些极端条件下生存的微生物也越来越受到重视（Kristjiansson和 Hreggridsson，1995；Vander Oost等，1996），如嗜热微生物等。植物来源的酶制剂以及利用植物细胞遗传工程品系和转基因植物开发酶制剂的途径也在探索之中。酶的特性一种微生物通常能同时产生不同的类型、具有不同功能的酶。许多酶是由多种酶组成的复合体。纤维素酶系是一个比较典型的例子，它是纤维素酶的复合物，它们协同作用降解纤维素。每一种微生物产生的降解纤维素的酶系都是不同的，它们往往含有几种类型的纤维素酶。它们的作用方式和底物特异性也是不同的。内切葡萄糖苷酶（内切纤维素酶）以随机的方式攻击纤维素多聚物内部的葡萄糖苷键，产生各种长度的纤维素短链和寡糖。另一种纤维素酶——纤维二糖水解酶，攻击纤维素长链的末端，主要产物是纤维二糖。被内切葡萄糖苷酶攻击产生的纤维末端越多，作为纤维二糖水解酶作用的底物也越多。纤维二糖是纤维二糖酶的终端产物抑制剂，它通过β—葡萄糖苷酶的作用可以把纤维二糖转化成葡萄糖从而缓解其抑制作用。因此，整个纤维素酶系的协同作用是推动纤维素降解成葡萄糖的关键因素，所产生葡萄糖是许多微生物的重要能源。进一步研究的兴趣在于产生降解纤维素的微生物通常产生各种内切葡萄糖苷酶和（或）纤维二糖酶，这些酶具有不同的物理化学性质。例如：分子量、等电点、最适作用pH和温度、稳定性和底物特异性。一种微生物同时产生木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶和脂肪酶也不罕见。微生物依靠这些酶从各种资源中获得营养，使它适应各种环境条件（如pH、温度等）。这些机制延续了几百万年。微生物细胞能对环境变化产生反应，启动相应的基因来表达所需要的酶和其它蛋白质，或关闭非必须蛋白质的合成和相应的代谢途径。通过这些调节，使得微生物对能量的利用更有效，从而更有利于生长繁殖和适应生存竞争。尽管能够在自然界中发现许多酶在饲料中有应用价值，但是野生菌株产酶能力很低，对绝大多数商业性应用来说是不合适的。需要说明的是许多微生物产生的是复合酶，这些酶在应用时是有益处的。其中只有1—2种酶起主导作用，有些酶组分对实际应用是有利的，而另有一些是有害的。一个典型的例子是含有内切木聚糖酶和木糖苷酶的混合物，前者对降解木聚糖、降低粘度是很有效的，后者催化水解短链木聚寡糖成木糖，已知木糖对某些动物会引发白内障、腹泻和厌食等。显然，这些负面影响是有害的（Schutte，1990；Schutte et al；）。在设计一个产酶微生物以前，搞清哪些或哪一种酶是有益的十分重要，这样做有利于指导选择合适的产酶菌种、优化生产工艺、降低不必要的负面影响，同时提高经济效益。鉴定和发展具有特定功能的酶酶的鉴定发展一种酶产品通常依赖于筛选大量的微生物，挑选能产生具有特定生物化学和物理性质的符合实际使用要求的产酶菌种。产酶微生物的传统筛选过程包括对从各种渠道来源微生物中分离获得的纯酶的价值评定，产酶微生物来源于以下几个方面：① 从已有的保藏菌种或可以索取的菌种（例如：Trichoderma，Aspergillus和Bacillus）中筛选。② 从富含目标底物的环境中分离筛选。③ 从传统意义的高产酶的菌种中筛选。这些方法已成功地运用了很多年。这些方法也存在很多限制因素，它们仅仅让人们接触了广阔无限、丰富多彩地微生物世界地很小一部分。事实上据信，至今为止，人们只培养利用了很少一部分微生物，不足总量的1%。（Pace et al.，1986；ward etal.，1992；Amann etal.，1996；Pace，1997）其原因部分是由于大部分微生物是不能用常规方法培养。一些传统的资源和方法依然行之有效，最近还建立起了一些方法专门用于那些不可培养的微生物的培养和分析等（Olsen et al.,1986；Pace et al.,1986；Saiki et al.，1998；Weller and Ward，1989；Ward et al.，1992；Amann et al.，）。这些方法绝大多数涉及核酸分析手段而不需要培养特定的微生物。其中之一是对特定的微生物基因组进行测序来筛选与已知基因相关联的DNA片段，这些片段能表达特定的酶活。其它一些方法包括从不能培养的微生物或混合培养的微生物菌群中提取扩增特定的DNA片段。这些途径和其它一些方法，包括应用RNA的手段，将在本章后续内容中作详细讨论。为了完善这些技术，还需要投入很多努力去发展自动化的、模拟的、高灵敏性的、准确而快速的方法分析从各种资源中获得的核酸和酶。尽管在自然界中存在各种各样的酶。但是有时这些酶并不具备实际需要的全部特性。并不需要对具有一些额外特性或不良特性的目标酶进行再筛选，可以通过蛋白质序列修饰、应用，使得性能有缺陷的酶蛋白得到完善，同时不丧失原有的优良特性。酶的蛋白质工程可以通过定向的或随机的诱变进行。在有些情况下采用一些化学方法，例如酰基化或甲基化。尽管化学方法获得了一定的成功，但是总的来说，它的可预期性差。定向诱变是通过DNA重组技术改变DNA编码密码赖改造酶的特性。（Carter Wells 1987；Bott，1988；Esteu，1993 ；Cleland 1996），包括选择性的替换、缺失或嵌入，也可以是二种酶的特定结构的选择性组合，产生杂交酶或嵌合酶（Schneider et al，1981；Mas et al 1986）。运用X—射线衍射、NMR和其他方法研究和推导酶蛋白三维结构并以此为基础实施蛋白质工程。分子图像和模型分析研究可以预测单个或多个氨基酸替换对结构的影响。在过去的大约40年内，已经有3000多种蛋白质的结构被揭示出来（PDB1996；Godzik 1997）。尽管如此，以氨基酸的序列为基础来预测蛋白质的结构还是有困难的。值得幸运的是，目前已存在着一些其它的方法。例如，随机诱变，定向诱导。这些对于目的蛋白质定向设计是有力的工具。应用这些技术可以产生所需要催化剂，而不需要对蛋白质的结构有很深的了解。几十年来，随机诱变一直作为一种工具用来增加遗传变异性和改进微生物菌种和作物的生产性能。通过核酸序列的随机修饰，然后筛选所需要的特性，可以获得改良菌种和改良酶。修饰或诱变编码目的酶的DNA序列可以通过物理的（热处理、冷冻处理、紫外诱变等）或化学的方法进行。与定向改造工程相比，随机诱变无法控制突变的数量和结果，它们仅在氨基酸序列的局部产生一些修饰，这就意味着产生庞大的诱变和筛选工作量。这些诱变方法需要高效、快速的鉴别技术进行配合。定向进化过程包括多次重复诱变筛选，经过每一个循环获得的优良诱变体再接受下一轮处理，使得每次获得的性能提高得到积累。这个过程需要：一个合适的用来表达基因的宿主微生物、产生遗传变异的恰当方法和合适的筛选方法。另外，为了确保高的成功率，需要筛选大量的可操作的克隆。还有一个可以采用的方法是DNA随机重组。这种技术涉及DNA序列的随机片段化，然后通过各种手段把各种片段组装成基因。通过蛋白质工程和定向进化等技术运用到酶的筛选中，可以产生在特定条件下生产性能得到提高的杂交分子。酶的发展和生产一旦目标酶得到确认，编码酶的基因就可以放入合适的宿主细胞。正如前面所提到的，许多从自然界中分离得到的能够产生所需要的酶的菌株并不是生产上合适的宿主菌。尽管通过调整发酵条件，从某种程度上可以改变天然菌株和突变菌株产生蛋白质的类型和数量。但是在大多数情况下，要想获得理想的纯度和繁殖力和经济有效性，还有相当距离和难度。安全性也是同样重要的。目前使用的宿主细胞往往局限于那些具有安全使用历史的菌株，因此需要采用重组技术。如果对重组细胞内的基因有了充分认识，那么在正常生产条件下安全性就没有问题。他能够正常控制基因改良菌株酶的表达。有发展前景的产酶微生物应具有以下能力：① 产生和分泌大量的完整的蛋白质。②进行适当蛋白质折叠和翻译后的修饰，例如：信号肽裂解、蛋白质裂解、糖基化和形成二硫键。③产生稳定的重组细胞或转化子。④符合法律规定如“公认安全”（GRAS）特性（Vanden Horbergh等，1997）。除了考虑产酶菌的本性之外，工业化规模的发酵工艺和提取过程也是需要综合考虑的重要环节。这些过程必须是可靠的，能符合所有的安全和质量保证要求，能提供一个重复性好、质量高的产品。在理想条件下，产酶菌株改良与产酶发酵研究相匹配。同样，发酵的研究进展应与后处理技术相同步。因为发酵液的特性对细胞分离和产品回收等下游处理影响很大。发酵和提取过程必须紧密结合，生产液体浓缩酶，进而在花费不大的情况下能够制成稳定的液体或固体产品。成功的发酵过程包括：①对微生物宿主细胞生理特性的深入了解。②具备合适的培养基。③优化微生物和它在发酵罐中的物理化学环境的相互作用。物理化学环境一旦确定，就可以运用计算机进行自动控制发酵过程。在所有对生产有影响的因素一定的条件下，可以采用数理统计的方法优化各种参数以达到理想生产状态。培养基的类型和微生物细胞产生的副产物对酶蛋白的回收产量和下游处理的费用将产生较大的影响。即使是作为粗制品的酶产品也需要进行发酵后的加工处理。把酶蛋白从发酵液中分离出来，首先需要经过过滤、沉淀、萃取和其它方式进行浓缩，然后进行复配。当浓度是需要着重考虑的因素时，一步或多步分离纯化的后加工处理是必须的。酶产品的纯度指标需要与每一步分离纯化操作的经济性进行综合平衡考虑。这些思想应该纳入到整个下游加工处理中。还有，发酵使用的原料和回收方式对发酵液废水的处理有明显的影响。酶经过回收浓缩以后，通常需要复配，以满足产品的稳定性要求，使之适用于特定的适用条件和最终使用者后加工的操作要求。对于应用于食品和饲料的产品需要使用食品级原料。对于固体产品，在尽可能的情况下，固体产品、酶浓缩液或复配制剂应制成干燥的固体颗粒产品，以满足健康安全的要求，例如低粉尘。筛选筛选在本质上是寻找特定的编码目的酶的基因。在过去是特指检测活菌的产酶性能（传统的微生物筛选法）。但是今天，应用现代分子生物学检测手段，筛选过程就不需要培养活体微生物。和所有的方法一样，不同方法各有利弊，但是这些技术的组合运用（组合筛选）往往可以产生最佳效果。探索和研究微生物最有意义的出发点是：自然界微生物的丰富多样性。（Bull，1992）很少有人想到，地球有生命以来，85%以上的时间是微生物的历史，其后不足15%的时间才包括有有动植物。由微生物创造的生理生化代谢形式事实上是无法计数的。在长达4多亿年的进化过程中产生的酶。被用来完美地维持细胞的生命过程。但是不管怎样，许多酶需要在特定的环境中发挥作用，而这种微生态环境与外界的生理生长条件相差很远。自然界还存在着某些能使酶失活变性的化学物质。在通常情况下，产酶微生物的筛选策略是依据酶的应用和发生作用的物理化学条件设计的。因此，选择在特定的运用条件下酶的表现活性是筛选高产菌种过程中关键的第一步。另外，获得一个相关的庞大基因库是取得筛选计划成功的前提。这些步骤包括客观分析检测从环境中收集获得的各种生物材料（如土壤），或者采用生态选择法，它是采用一种目标筛选，在特定的生态环境中筛选具有特定催化作用的酶。设计的策略可以筛选特定的、没有或很少探寻过的环境，以便从新发现的微生物菌群中获得尽可能多的遗传多样性。为了获得新的基因，探寻一些极端环境，例如火山温泉、高盐湖和极地土壤，往往可以发现许多具有特定性能的微生物（Horikoshi,1995；Kristjansson and Hreggvidsson,1995；Horikoshi and Grant,1998）。另外，对现有已知的微生物进行系统分析检测有时也能有较好的收获，值得一做。天然菌株筛选（Natural isolate screening）筛选材料源泉可以是植物、动物或者微生物——包括原核生物（例如：细菌和古细菌）和真核生物（酵母和霉菌）。在当今条件下，饲料用酶制剂主要是由微生物产生的。传统的从自然界中分离筛选产酶微生物的方法是来源于1945年以后几十年内建立起来的类似发现抗生素（包括青霉素和链霉素）的方法。它涉及几千种来自土壤和植物的样品，采用随机法从微生物群体中分离筛选纯种。尽管有许多自动测定分析技术的辅助，研究的进展速度在很大程度上仍然取决于挑选的纯种的数量。以前，以土样为出发菌进行菌种分离筛选的策略主要是以经验为主。但是许多研究工作和方法可以大大减少实验工作量。这些过程包括使用由微生物学家Beyerinck和Winogradsky在20世纪初建立起来的富集培养法，把样品在设定的选择培养基中进行选择性培养，可以提高目的菌种的比例。通过调节培养条件，只有那些能表达特定酶的微生物才能生长和生存。例如，为了富集得到高产木聚糖酶的菌种，在培养基中加入木聚糖，并使其成为唯一的碳源和能源。在这种情况下，只有能产生木聚糖酶的微生物（不论是组成性的还是诱导性的）才能生存下来，从而使培养基中富含这种目的微生物。这种体系还可以进一步深化完善。例如，如果需要酸性木聚糖酶，那么富集培养基的pH值应该设计在pH值为4—6的条件下，只能使产酸性木聚糖酶的微生物生长。其最终结果可以通过巧妙地选择环境进行检验，使选择效果得到进一步提高。例如，酸性的土壤、动物的粪便和森林的腐败物。在环境中采集样品和在实验室中进行检查分离的时间间隔也是至关重要的，因为微生物某些变化是不可逆的。即使是保存最完好的样品也会不断发生化学和物理变化，导致某些菌体活力下降甚至死亡。采集与分离检查的时间间隔越长，产生的变化也越严重。尽快处理样品有许多优点，它可以分离获得各种完全不同的微生物。有时为某些特定的微生物或为微生物的某种特定活力设计特定“诱饵”也是很有用的。一种比较典型的“原位”富集的例子是把棉花塞放到类似湖底沉积物的环境中，然后过一段时间回收采集样品内，带入实验室分离筛选具有分泌纤维素酶活力的菌种。样品的预处理往往是比较关键的和至关重要的。堆肥和富含有机物的土壤中含有大量的微生物，所以需要进行适当的稀释，或者需要进行特定的设计。选择性技术包括：认真仔细地用空气干燥土样，以减少革兰氏阴性细菌。或者在80℃左右进行短暂的热处理，使得耐热的细菌孢子（例如芽孢杆菌）能完整地存活下来。抗生素也可以添加在生长培养基中。例如：革兰氏阳性细菌相对于革兰氏阴性细菌对青霉素更敏感。菌体的筛选技术有许多是经验性的。例如：用水溶性琼脂或几丁质琼脂分离筛选缓慢生长的防线菌，有关这方面的方法是很多的（Williams et al.,1984）。生态法的优势是利用了自然存在的选择压力法。例如：在pH为9.0的碱性环境中，只有嗜碱性微生物才能生存，这可能是由于这些微生物能产生在碱性条件下稳定的高活力的酶。而事实证明也是如此（Jones et al.,1998）。但是高产饲料用酶的菌种的筛选方法就没有上述明显清晰。例如，是什么筛选植酸酶产生菌的天然环境?植酸，在某些植物种子内，它是磷的主要储存形式。紧邻发芽种子的根部是筛选产生植酸酶菌种的合适取样部位。无论采用何种筛选方法，筛选步骤都依赖于某种标准，这些标准必须结合寻找的目标微生物的某种特定活力。最常用的方法是让微生物生长在含有恰当的酶底物的琼脂平板上，以鉴定所需菌种的产酶活力。运用的方法通常是属于专利的，它往往是一种艺术手段而不仅仅是精确科学。其中有些方法是众所周知的。例如，在琼脂培养基中加入酪蛋白作为唯一碳源，使琼脂平板呈不透明状，然后当表面生长菌落周围出现透明的清晰小圈时，表明这些微生物能分泌降解酪蛋白的酶。特定的酶蛋白裂解反应可以通过发色反应来检测。发色反应来源于含有生色基团的化合物的降解反应。只有当特定的水解反应发生以后，这种发色反应才是可见的。微生物的选择在整个筛选过程中是至关重要的的阶段。这种选择是很主观的。受影响的因素很多，特别是当涉及的微生物数量很多时。尽管在筛选过程中伴随着各种选择形式，但是要分辩出生长在琼脂培养基上的各种微生物仍然是很困难的。尤其是对于细菌的分辩筛选，除非它们被清晰地染色，否则从它们的外形上看几乎是相同的。这种情况对于采用随机分离法从自然界筛选菌种来说会产生一个很大的弱点——重复筛选；即相同的微生物会从不同采样地点的样品中不断出现。这也就解释了为什么当今有这么多的产品来源于很有限的微生物种属。而且直到现在为止，绝大多数筛选方法还是很保守的。采用营养丰富的培养基有利于快速生长的微生物（这些微生物对营养要求不高），从而最终导致某种微生物占据绝对优势。具有这些特性的微生物包括-----真菌，例如：Aspergillus和Trichoderma（曲霉和木霉）和细菌如芽孢杆菌和假单胞菌，它们能够产生丰富的酶，不少已经商品化。为了确保足够的微生物多样性和度量筛选广度，需要对筛选种群的生物多样性做一些评估。十多年前，采用的是一项繁琐的检测工作，逐一检测每一个微生物。现在，由于有了快速分子检测技术，一些新的分析手段可以很快把未知的微生物归入相应的种属。这些技术包括：全蛋白测定法、扩增长链多态性（同一繁殖群中出现2个以上的遗传相异的个体）、核型、扩增核糖体DNA限制性分析、内转录隔离子——PCR扩增、单链DNA构像的多态性结合复式电泳分析、图像数据分析计算等。这些技术提供了收集菌种多样性的信息。今天运用这些技术可以对小亚基单位的核糖体RNA（ssurRNA）进行基因测序，然后对照日益丰富的微生物数据库，就可以对某些特定的微生物进行分类，从而识别和发现新的微生物。结合选择性数据，赋予鉴定的微生物特定的性状。这些信息为今后设计特定的微生物分离筛选步骤和更严格的筛选标准提供了可靠的前提。尽管这样，在实际操作中仍然很容易漏检有潜力的新菌种，特别是当需要检测的平皿有数百个，而每个平皿含有上百个单菌落时就很容易出现漏检。今天，这项工作可以由连接计算机的成像系统的菌落挑选机器人完成。正如前面所提示的，以前一个经常遇到的问题是从自然界中筛选分离获得的菌种的产酶浓度往往很低，即使优化生长和产酶条件野生菌内在的最大产酶能力从商业生产的角度来看，仍然是有限的；传统的遗传操作方法是筛选具有优良变异性状的突变株，以提高产酶能力，这种传统技术已经采用了几十年。近年来，现代分子生物学技术的发展，大大加快了在实验室条件下改造或改良微生物性状的可能性。但是不管怎样，越来越多的证据表明，许多与遗传工程有关的技术和现象在自然界不同种属微生物之间也有发生，这或许也是微生物为了适应环境而发生变化的机会性本性的部分原因。这种变化直接导致在一个微生物群体内产生一个新的性状。新性状的产生取决于选择活力，特别是当环境中存在对微生物具有致死性的化学物质时，例如：除草剂。这个过程可以在实验室中用连续发酵培养进行模拟，但是这个概念不能与产生新的微生物相混淆。微生物发生内部调节以适应环境的变化保护其遗传个性不同于出现一个完全新的微生物。事实上，我们几乎不可能看到一个没有任何外界干扰而突然出现的一个新的微生物。分子筛选(molecular Screening)近十年来，生物技术的快速发展使得直接测定DNA核苷酸序列成为现实。目前在公共数据库中已经有数千条基因链的测序结果。尽管绝大多数是来自于翻译的遗传密码（即是调节基因而不是结构基因）。近十年来，微生物基因测序得到了快速发展，如今已有大约35种原核生物（细菌和古微生物）和3种真核微生物的全基因组序列被测定。另外，目前大约还有70个微生物基因组正在进行全序列测定。针对这种情况，有几条途径可供选择。如果一种合适的“主导酶”（例如酸性木聚糖酶）在某个特定种属的微生物中被发现鉴定，那么，就可以在相关的种属微生物中寻找其同源的酶。这个过程需要运用遗传学（即由酶蛋白的结构推测DNA的核苷酸序列）。酶是由多种氨基酸以共价结合的方式连接而成的一个多聚氨基酸。在酶蛋白分子中，氨基酸的连接序列可以通过已知的N—末端分析法进行测定。由于遗传密码是通用的，所以根据氨基酸序列就可以推测编码目的酶蛋白的可能核苷酸序列。根据这个理论，可以构建含有15—20个特异性核苷酸短链的探针（或者引物）。因为DNA是由二条完全互补的核苷酸长链构成的双螺旋长链。用PCR技术，引物探针能从相应的微生物的染色体DNA中钩取同源基因，并转移到宿主细胞内（例如大肠杆菌），使基因得到表达，表达的产物是同源酶（Daborge and Lange，1998）。当然，实际操作要比上述描述的过程复杂。但是，在实际操作中有可能发现一些催化功能相同而氨基酸序列明显不同的同功酶。这些酶在进化过程中仍然保留着组成活性中心的几个关键氨基酸。在实际检测时发现，这些新酶也许有明显不同的特性，例如，与未改进的酶分子相比，新的酶蛋白pH和温度稳定性提高了。采用这种方法，相关种属微生物家族的所有成员都将被筛选。尽管这是一个强有力的技术方法，它也受到如何从目标微生物中分离扩增合适的DNA链的限制。同时，它也局限于已知的、经过研究的和保藏的微生物。据估计，人类从自然界中分离筛选出来的微生物不足自然界中微生物总量的1%，而进行过充分研究的更是寥寥无几（Amann et al，1995）。研究认为，从外界环境收集的样品中，不足25%的微生物能够在实验室中得到分离培养。有许多原因可以解释为什么样品中的部分微生物不能得到分离纯化。有些细胞处于休眠状态；有些已经遭到破坏或将要死亡；有些微生物不是样品环境中真正的“居民”，即不是活跃群体的组成部分；有些是等待环境变化而有利于自我生存的“机会主义者”；而有些是人类目前还不清楚它的培养要求，以至于在实验室条件下也无法进行分离培养。值得幸运的是，近年来生物技术的发展，使得人类至少能研究了解一部分不能培养的微生物（Hugenholtz and Pace，1996）；能够直接从外界收集的含有微生物的样品中提取DNA。尽管存在着许多能够从天然微生物群体中提取染色体DNA的技术，但是，并不是所有的细胞对裂解反应同样敏感。回收DNA也不可能达到100%；另一个值得注意的问题是目前检测的微生物仅占整个微生物群体很小的一部分。在通常情况下，绝大多数的微生物DNA是不具有代表性的，除非事先对样品进行了标准化处理。最近，对来源广泛的微生物DNA克隆进行ssurRNA测序，发现从南极海洋到黄石国家公园温泉中的微生物具有极其广泛的生物多样性，这些微生物在几年以前不曾检测，现在已有待分离培养（Hugenholtz and Pace，1996；DeLong，1997）。它同时也表明，那些已分离培养的微生物也许不是环境微生物中优势菌群，由此对富集培养筛选微生物的方法提出了新的挑战。采用PCR技术，用已知的基因序列做对照，可以对环境中的DNA进行分析。这个过程需要高质量的DNA样品。因为PCR筛选对样品中的污染物是极其敏感的。或者也可以用含有荧光放射性标记的DNA杂交技术钩取DNA。用限制性内切酶把外界获得的DNA切割成小片段，再把这些小片段的基因克隆到表达宿主细胞（例如大肠杆菌）内。依靠与天然菌株筛选相似的方法可以筛选表达新酶的克隆子。但是，不管怎样，所有这些建立在相似性筛选基础上的分子生物学分析法有一个很大的弱点，它们需要与已经获得的记录数据相对照比较。研究表明：已经测序的全基因组DNA序列（例如：枯草芽孢杆菌）70%以上的还没有确定它们的生物学功能。这些事实表明，用来分离筛选新型酶的资源还有很大余地。同时也表明，在这个地球上，生物的多样性还是以微观世界（微生物世界）为主。从食品、饲料应用角度出发运用传统微生物筛选方法还是分子筛选手段从微生物或基因多样性中筛选新酶并无多大差异。可以获得的资源事实上是无穷无尽的，但是，在应用条件下，酶的最终活性仍然是筛选过程中需要考虑的关键因素。蛋白质工程饲料酶面临的挑战是经常要求对酶蛋白的结构进行修饰以适应新的作用环境，或者赋予酶蛋白新的催化功能。应用蛋白质定向改造技术创造出了几种用于清洗和淀粉加工的酶，它们表现出的性能优于自然界中存在的性能最好的同功酶。应用于清洗和淀粉加工的酶所处的作用环境远不同于自然界的生物环境。洗涤剂中含有表面活性剂和缓冲盐以维持高度碱性的作用环境。而淀粉在液化过程中，其作用温度通常要接近105℃。如何提高从自然界不同生态环境中获得的酶的作用效力是目前面临的一个挑战。例如：从Bacillus lentus分泌的蛋白酶和由地衣芽孢杆菌产生的用于淀粉加工的α—淀粉酶。而这二种酶都不能在商业要求的条件下发挥作用，它们的作用功效在自然条件下发挥最佳两种条件相去甚远。尽管Bacillus licheniformis是中温微生物，但是由它产生的α—淀粉酶在淀粉加工的过程中的功效却等同于甚至高于嗜热微生物B.sterthermophilus产生的α—淀粉酶。由B.lentus产生的蛋白酶在接近中性条件下的作用效果要比在洗涤剂的碱性条件下优越。已经从自然界中发现的生物酶所具有的功能效果是丰富多彩的。这些酶的形成是生物长期进化的结果。它们的结构相对稳定，包含的氨基酸组成能适应生物进化过程中的各种变化要求。目前所进行的蛋白质工程研究是对自然界获得的酶蛋白进行定向改造，使其更适应商业化要求。有许多方法可以用来改进酶蛋白特性。在通常情况下，如前所述，第一步是筛选自然界中存在的酶，挑选最好的出发酶种。依据生物多样性有针对性地取样抓取，通过分析氨基酸序列来比较不同样品酶的的功能特性，由此获得一些酶分子结构和功能之间的相关性线索。但是，由于在进化中产生了很多变异，鉴定酶蛋白分子中氨基酸序列变化所导致的特性改变是异常困难的。例如，蛋白酶Carlsberg 和蛋白酶BPNˊ在275个氨基酸残基链的有87个氨基酸（Siezen et al，1991）。这二种酶的动力学特性完全不同。正如下面要讨论的，二者在87个氨基酸残基中仅有1至3个氨基酸有差异就足以导致其动力学特性发生明显的变化。蛋白质的四级结构在鉴定导致酶蛋白功能差异的可能结构因素时具有重要作用。枯草芽孢杆菌蛋白酶工程酶是线性的多肽链，其氨基酸序列是由相应结构基因的DNA序列决定的。多肽链合成以后，酶蛋白折叠形成稳定的三维结构，使得在线性长链上相距很远的氨基酸能在组成空间三维构像时紧密结合形成新的结构体。这些氨基酸残基组成的紧密结构以及赋予了酶分子特定的催化特性。作为一个例子：蛋白酶BPNˊ（丝氨酸蛋白酶）的底物结合位点是由32位的天门冬氨酸、64位的组氨酸和221位的丝氨酸组成的。而且几乎所有的丝氨酸蛋白酶的活性位点都是如此。不仅蛋白酶是这样，其它类型的同一类酶的活性位点也几乎都是相同的。在多肽链上存在着一广泛的阻遏区域，该肽链含有具有活性的221位丝氨酸，其羟基氧攻击底物并与之结合。图13.1蛋白酶BPNˊ的三维结构（Bott et al.,1988），折叠成活性位点的氨基酸残基是Asp32、His64和Ser221。催化位点处于阻遏区域，并在此形成底物结合区域。搞清哪些氨基酸残基构成了底物结合表面具有重要的意义。这有助于破译在众多的氨基酸残基的组合中何种组合赋予了酶蛋白特定的功能。由于重点研究了由B.amyloliquefacien产生的蛋白酶BPNˊ和由B.licheniformis产生的蛋白酶Carlsberg之间的氨基酸残基区别，从而知道在可能存在的87种替代组合中，有3种组合是导致这二种酶的催化活性产生差异的原因（Walls et al，1987）。枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的催化效率指数kcat大约是BPNˊ的十倍，而且底物作用的特异性（底物的优先选择性）也不同。尽管蛋白酶Carlsberg和蛋白酶BPNˊ的氨基酸序列有区别，但是它们的三维空间折叠模式是相同的（或相似的）。所以，尽管这二种酶和相关的氨基酸残基的化学组成有差异。但是，它们结构是同源的。它们四级空间结构的相似性体现在：构成催化活性位点相对限制性区域和与底物结合位点进而已知在87个AA中有三个可能影响酶的动力学参数和作用特异性。通过这3个氨基酸残基的替代反应，研究酶蛋白的动力学参数和作用特异性的变化。用丝氨酸替代156位谷氨酸、用丙氨酸替代169位甘氨酸、用异亮氨酸替代酪氨酸。由此产生了枯草杆菌蛋白酶BPNˊ的变异体，其动力学参数和作用特异性与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg相似（Wells et al.,1987）。在这些变化中，只要其中有一个氨基酸残基发生替代反应就足以对酶蛋白的催化效率指数kcat产生显著的影响，甚至对于在217位用异亮氨酸替代酪氨酸产生的变异酶蛋白Y217L，为了容纳替代的氨基酸残基而仅需作轻微重排即可。（注意，在217位，异亮氨酸替代酪氨酸。）图13.2 比较天然的蛋白酶BPNˊ和它的变异体的三级结构，在变异体中217位的酪氨酸被异亮氨酸替代。淀粉酶工程一个类似的方案策略已经被成功地用于改进淀粉酶。由B.lichenformis产生的α—淀粉酶有458个氨基酸。如图13.3所示，在三维结构上显示酶蛋白有三个亚基，活性位点和底物结合位点处于亚基A和B之间。对淀粉酶进行工程改造的主要目的是为了提高其稳定性。通过探索研究不同种属微生物菌 产生的α—淀粉酶的多样性，使淀粉酶的稳定性得以提高。通过随机筛选产酶变异株可以在结构同源性较大而来源不同的α—淀粉酶之间互换主要氨基酸（活性位点的氨基酸或对稳定性有重大影响的氨基酸）。这些氨基酸残基在其它α—淀粉酶中积累在同源区域众多的氨基酸残基将填充在表面的孔穴中，使酶分子结构得到稳定。有一个例子，如图13.4所示，在第379位的氨基酸残基，原来的丙氨酸被丝氨酸代替。这种方法可以用来产生变异株，使其所产酶的pH和热稳定性得到提高（Day et al，1998）。图13.3 来源于B.licheniformisα-淀粉酶的三级结构。分子由三部分组成，亚基A 、亚基B和亚基C。催化和底物结合区域位于亚基A和亚基B之间。（Courtesy of Dr. Andrew Shaw，Genencor International）图13.4 观察空间构像，在379位，用丝氨酸代替丙氨酸，丝氨酸附带的羟基填充了外部孔隙，使变异酶结构更稳定。（与杰能科公司Anthony Day博士提供的变异体模型相一致。）这是一个建立在不同的α—淀粉酶但具有高度同源位点空间结构基础上的策略。由微生物产生的，在一种α—淀粉酶某一位置上的氨基酸残基也可以容纳另一个同源α—淀粉酶分子的相应氨基酸。这个策略是建立在自然界α—淀粉酶的生物多样性的基础上，例如：α—淀粉酶的共有折叠区域中填充氨基酸残基为实施改方案提供了基础。这些填充孔穴的氨基酸残基可以重新插入到B.licheniformis结构中。问题是选择用来作替换的同源氨基酸残基在中温淀粉酶的氨基酸序列中也存在，而这些中温α—淀粉酶的稳定性不如由B.licheniformisα—淀粉酶，并假设这些残基与α—淀粉酶空间构像是完全亲和的。整个筛选替代过程导致形成了最稳定的酶分子变异体。这个过程包括：合理的定向替代、从来自随机诱变和筛选的变异菌株，以及采用上述描述的同源补充替代策略。通常的思路是所有这些酶的多样性都可以作为研究对象，从而可以为如何使酶具有特定的功能以适应特定的应用环境提供可能。综合途径和其它方法关于酶蛋白设计的最新进展是先进的DNA重组技术。该技术通过对微生物工业性状一代又一代数以千计的突变进行直接或间接快速选择从而达到加速生物进化进程的目的——“定向时代”，迄今已有许多运用该手段改进酶功能或稳定性的成功报导，比如Subtilis突变株所产生的酶能在完全不同的非水相体系中发挥作用，这些可能是理论上成功的例子，而实际工业领域所需要的则是筛选或选择具有实际意义的酶的相关性质和作用条件。应用这些技术通常能产生许多性能不断得到改进的变异体，而具有革命性意义的重组DNA技术能使个别氨基酸发生替换。所有的这些技术都有一个共同的特性，探索并发现了同功酶的多样性。我们发现，大量不同的但是同源的DNA编码的酶蛋白具有相同的四级结构和功能。从替代一个氨基酸到在整个分子全面性替代能够使酶产生具有明显差异，但是却具有相同的功能。天然酶这样一种遗传特性通过四级结构的折叠应变来适应许多序列变异而并不改变其功能。生物进化过程产生了众多变异体，给酶结构提供了足够的变化多样性，使生物有机体具有特定的功能，从而能更好地适应所处的特定的生活环境。产酶工程菌株构建传统的诱变传统的诱变是提高微生物产酶能力最有力的技术手段之一。以数十倍、甚至上百倍的幅度来提高微生物的产酶能力也是常见的。传统的诱变技术开始是在制药工业中用来提高抗生素的产量。现在这种技术也同样可以用来提高微生物的产酶能力。传统的诱变处理不同于生物进化过程。相同之处在于：都促使微生物的DNA发生变异，导致其遗传发生特异性改变。生物进化筛选取决于变异是否更有利于生物体的生存发展，而诱变筛选的标准是由实验者自我设计的。对生物细胞和微生物孢子进行诱变处理可以使其变异频率大大高于正常水平。常用的诱变剂包括：紫外线、γ—射线和能与微生物的DNA发生化学反应的化学物质。微生物单菌落与诱变剂发生作用后可以获得含有各种不同变异方向的微生物菌群，然后设计一个标记性状来筛选目的微生物。微生物的产酶能力是一个可以通过诱变发生改变的特性。而在通常情况下，许多变异有损于微生物的生存能力，甚至会对微生物产生致死性的影响。产酶能力得到提高而又不影响微生物生存能力的仅是少数。应用传统的诱变育种方法可以提高枯草杆菌α—淀粉酶的产量。α—淀粉酶可以用来液化淀粉，生产玉米高果糖浆，也用来提高动物饲料中玉米淀粉的消化率。但是，从自然界中分离获得的枯草杆菌只能产生很少量的α—淀粉酶。对野生菌进行诱变筛选，可以获得产量更多，具有商业价值的高产菌株。图13.5是关于生长在淀粉琼脂平板上的野生菌和产酶能力得到提高的变异株淀粉水解圈。与野生株比较，在变异株周围有更大的透明圈表明该菌株分泌了更高产的α—淀粉酶。而在野生菌周围没有明显的透明圈，表明该菌株的α—淀粉酶产量很低，或者不产α—淀粉酶。图13.5 比较二种生长在淀粉琼脂平皿上产α—淀粉酶的枯草杆菌。左边的平皿上生长的菌种是应用传统诱变获得的高效分泌α—淀粉酶的生产菌种，右边的平皿上生长的野生菌。菌落周围的透明圈表明菌落产生的α—淀粉酶水解了其周围不可溶性的淀粉。改进酶蛋白表达的遗传工程遗传工程是指DNA经过体外重组，获得合适的DNA片段，然后放入到适当的宿主细胞内进行表达。通过改变基因的遗传元件和调节元件，从而可以使酶的表达发生变化。典型的用来产酶的细菌和真菌有2—10000个相关的基因。枯草杆菌编码蛋白的基因位于一条含有4.2百万个碱基对的染色体DNA长链上。真菌黑曲霉含有大约35百万个编码酶蛋白的碱基对，分布在8条染色体DNA长链上。一个基因决定一种蛋白质的氨基酸组成和特定的氨基酸序列。典型的编码细菌产生的酶蛋白的基因片段长度约为1000个核苷酸，编码300多个氨基酸单位。除了编码基因的DNA片段之外，还有一个控制基因表达的DNA片段称为启动子。一个生物体的基因只有一小部分始终处于表达状态。启动元件控制着相应基因片段的协调表达，这些DNA启动子片断功能可以比拟为灯光的开关，控制相应结构基因的启动、表达和终止。20世纪70年代，由于核酸限制性内切酶和连接酶的发现，使得基因工程的定向改造成为可能。限制性内切酶能在DNA长链特定的位点精确地切开DNA分子，作用效果类似分子手术刀。DNA连接酶能够把具有特定粘性末端的DNA片段连接起来，作用效果类似分子“粘合剂”。依靠这二种酶，可以把特定的基因片段（DNA片段）从染色体上切割分离出来，进行人工定向重组。基因工程还需要把重组的DNA转移到适当的宿主细胞内，这一过程称为“转化”。大肠杆菌和枯草杆菌是比较容易被转化的细菌。用氯化钙处理菌体制备感受态细胞，以利于吸收外源DNA。当经过改造的DNA片段加入到处于感受态细胞溶液中时，DNA片段就被吸附在菌体细胞壁表面，然后传递到菌体细胞内。尽管转化真菌比较复杂，但是80年代早期发现了一种转化Aspergillus nidulans（Balance etal，1983）的方法。随后，在这种方法的基础上进行适当改进，成功地进行了黑曲霉和里氏木霉（A.niger 和Trichoderma reesei）的转化，目前经常用这二种菌表达和生产异源酶。为了能使酶蛋白得到高效表达，目的基因片段可以插入高效表达的载体中。该高效表达的载体是一个特定的DNA序列，当它进入到一个合适的宿主细胞后，能使特定的酶蛋白以高于正常的水平表达。构建一个合适的载体需要几个DNA元件。生产阿魏酸酯酶A的载体是一个比较典型的能高效表达的载体，宿主细胞是黑曲霉（酶简称为FAEA，编码该酶的目的基因简称为faeA）。FAEA能够裂解存在于许多饲料原料中的阿魏酸和阿拉伯糖之间的连接键（de Vries et al）。要构建一个能高效表达的载体（参见图13.6），需要构建4种成分：一个强glaA启动子，faeA编码基因，glaA的终止子和pyrG选择性标记。glaA启动子调控faeA基因。已知glaA启动子调控其后基因高水平表达，由于这个原因，它经常被用来构建载体。当能高效表达的载体（描绘在图13.6）转化到黑曲霉宿主细胞内，FAEA酶蛋白的产量会大幅度地提高。图13.6阿魏酸酯酶A（faeA）的黑曲霉表达载体。这个载体显示组成一个高效的表达载体需要的组分：一个强启动子glaA、结构基因faeA和一个选择性标记pyrG。选择性标记基因可以用来鉴别载体DNA转化宿主细胞是否成功。以黑曲霉（A.niger）作为宿主细胞，在被转化之前，需要经过基因突变使pyrG基因失去活性。pyrG基因编码一种酶蛋白，这种酶蛋白对于合成DNA的原料——嘧啶是必需的。如果嘧啶缺乏，细胞就不能合成DNA分子，从而也就丧失细胞生存繁殖的可能性。宿主细胞经过载体转化处理后，细胞被稀释涂布在缺乏嘧啶的选择性营养培养基上，细胞为了生长，必须吸收转化既能高效表达FAEA又含有pyrG基因的载体。那些整合了这些载体的细胞能合成嘧啶和DNA，也就能生存和繁殖。采用基因工程手段删除酶的基因使用经过转基因定向改造的能高效表达的载体并不能阻止微生物合成不必要的酶蛋白。理想的状况是微生物尽可能高效表达目的酶而减少合成不相关的或者是有负面作用的酶蛋白，例如蛋白酶和对实际应用产生干扰的酶。为了阻止细胞合成具有----作用的酶蛋白，可以采用删除相应的编码这些酶蛋白的基因的方法。里氏木霉（T.reesei）是一种丝状真菌，生长在温暖湿润中的-------。分离获得的出发菌株（单菌落）经过传统的系列诱变筛选可以使其产酶能力得到很大提高。但是，里氏木霉产生的纤维素酶是一种复合酶，至少含有6种不同组分，而且每种组分都有独特的活性。另外，这些酶组分产生的比例也不相同。混合物中含大约40—60%的纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHⅠ）CBHⅡ、内切葡聚塘酶Ⅰ（EGⅠ）和EGⅡ，各自含量分别在5—20%之间。另外还有不足百分之几的EGⅢ（参见图13.7，B栏）。这些由里氏木霉产生的酶系及其比例对于转化植物纤维成为葡萄糖用作菌体能量来源可能是有利的，但是如果实际工作中仅需要一种或几种酶蛋白十分离纯化就是首要问题。为了调整纤维素酶的组成以符合某些特定的应用要求，对一株里氏木霉进行了基因工程改造，使其不再产生CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅠ和EGⅡ。取消编码那些不必要的纤维素酶蛋白的基因将使酶的组系发生变化。一个典型的删除基因的方法是删除cbhⅠ基因的例子，参见图13.8。删除了cbhⅠ基因的载体DNA进入细胞以后不能独立地进行自我复制，它们必须重组整合到已经存在的染色体上才能进行复制，这种重组是随机发生的。由于相同的DNA分子具有亲和性，经删除处理的载体具有pyr4基因作为选择性标记，它的两翼与cbhⅠDNA片断具有相配对的粘性末端。以pyr4基因作为选择性标记。该载体的cbhⅠ区段与对应的宿主细胞染色体的cbhⅠ片段进行置换重组，导致细胞染色体的cbhⅠ基因被pyr4基因取代。由于删除了cbhⅠ基因，宿主细胞也就不产生对应的CBHⅠ酶蛋白。这样，选择性标记pyr4可以用来分辨那些不含有cbhⅠ基因的菌株了。图13.7基因定向改造T.reesei的过程。SDS—凝胶图片显示从出发菌种开始的一系列工程菌产生的发酵产物。最终的产物来源于EGⅢ高效表达的菌株。A栏：标准蛋白质分子量。B栏：出发菌株的产物。C栏：消除了二个酶蛋白结构基因（cbh1和cbh2）的菌株的发酵产物。D栏：删除了四个酶蛋白结构基因（cbh1、cbh2、eg11和eg12）的菌株的发酵产物。E栏：eg13高效表达菌株（缺少四种结构基因）的产物。图13.8删除T.reesei的纤维二糖水解酶的基因（cbhl）。采用类似的方法，删除其他三种主要的纤维素酶基因：纤维二糖酶Ⅱ基因（cbhⅡ）、内切葡聚塘酶Ⅰ基因（eglⅠ）和内切葡聚塘酶Ⅱ基因（eglⅡ）。经过删除改造的载体可以被进一步用来逐个删除3个基因。参见图13.7，从蛋白凝胶图片上可以看到，基因删除对里氏木产生酶系的影响。蛋白凝胶是根据蛋白质的分子量进行分离的。分析的样品来源于各种经过转基因改造的里氏木霉发酵液。参见图13.7，比较B栏和C栏的酶谱，当cbhⅠ和cbhⅡ基因被删除后，对应的CBHⅠ酶和CBHⅡ酶也随之消失。同样，当eglⅠ和eglⅡ基因被删除后，对应的EGⅠ酶和EGⅡ酶也不再存在（参见图13.7，比较C栏和D栏酶谱）。 经过删除的菌株经过进一步基因改造，应用能高效表达的含有eglⅢ的载体，获得的宿主微生物的内切葡聚塘酶Ⅲ的产量得到进一步增加。这个载体含有cbhⅠ强启动子来调节eglⅢ基因的高效表达。这个载体转入已经删除cbhⅠ、cbhⅡ、eglⅠ和eglⅡ基因的菌株，与前面所有的菌株相比，最后获得的菌株的EGⅢ酶的产量得到了增加。（参见图13.7，比较E栏与B栏、C栏和D栏的酶系）应用传统的诱变和基因工程技术，删除一部分基因和高效表达目的基因，可以使微生物的产酶能力产生显著的变化。应用这些技术也可以使微生物的产酶谱系得到调整以符合特定用途。发酵工艺——设计和发展发酵过程的发展改进旨在尽可能提高产量，降低生产成本。另外，还要求这个过程具有可重复性，必须符合所有的规范要求，健康、安全和质量保证要求。在理想状态下，发酵和生产用菌株的研究应该是一个系统工程。菌种的选用必须同时考虑发酵过程的设计选择和限制因素。而发酵过程的研究也必须考虑菌种的特定要求。发酵设计发酵的生产方式有分批式、补料式和连续式三种。它们是通过跟踪和估测某些特定的参数来进行控制的。这些参数主要有：温度、pH、溶解氧、氧化还原电位、呼吸速率、泡沫形成和物质转化效率。在间歇发酵过程中，发酵产物的生成速率开始增加，随后减少。这通常与菌体细胞的生长状态（包括指数生长期、平衡期和孢子产生期）相关联。在补料发酵过程中，通过对间歇过程和补料培养物的精细设计，调节细胞的生长，从而使产量最大化。在连续培养中，产物量受到连续生长、低产或不生产突变株、反馈抑制以及稀释效应的影响；在一个连续的细胞再循环系统中菌体生长与产物量无关，只是通过最大限度提高细胞密度来提高发酵产物。如果在菌体最低生长量的条件下胞外酶的分泌能持续进行，那么，固定化细胞的发酵罐设计应能满足细胞分离的要求，以获得更高的产量。当菌体细胞培养在一个含有可以被菌体能快速利用的营养物的培养基中（如含有葡萄糖和氨基酸），许多酶的产生和分泌将受到抑制。这称为代谢物阻遏效应。暂且不考虑细胞内代谢物阻遏效应如何调控。液态发酵生产有二条途径可供选择：菌体必须在碳/氮源存在条件下合成产物或者在碳/氮限量的条件下进行培养。许多酶的最大合成速率出现在对数生长期的后期或停滞期的前期，此时细胞开始产生孢子（Doi，1989）。因此，在工业生产中多应用孢子缺陷型（或产孢子能力差的）菌株作为生产菌种（Priest，1977）。生产实践中通常采用分批或补料的发酵方式，发酵的周期从12小时到300小时不等。通过优化培养基组成、碳源的补加和发酵参数（包括温度、pH值、通风、搅拌和罐压等），可以使菌种的潜力得到充分发挥。目前还不清楚那些因子决定最佳发酵周期，也许还包括其它一些控制体系对它的影响（例如，细胞的繁殖营养饥饿等）。图13.9发酵罐模型图13.10发酵参数发酵过程的设计需要综合运用多学科的知识。只有把有关化学工程和微生物生理学的概念和方法进行有机结合，才能完成发酵过程的放大设计。发酵罐的规模通常是指发酵罐的体积。发酵罐的放大设计和建立一个工业规模的生产体系须以小规模试验获得的数学模型为基础。在实际生产研究中，这个过程涉及发酵罐体积对发酵液物理化学特性和微生物生理代谢的影响。放大效应对好氧发酵（在通风搅拌的发酵罐中进行）的影响要比厌氧发酵大得多（Atkinson和Marituna，1991）。作为一个定律，在好氧发酵罐的放大设计过程中，传氧速率和发酵液的溶氧量应保持不变，热力学和内在的动力学特性参数与发酵体积无关，发酵液的运动、质量和热量传递与发酵体积有关。例如，在10升发酵罐内，搅拌、通风和冷却都可以得到很好的控制，能使罐内各处发酵液的物理化学参数保持一致。但是，当发酵液的体积大于10立方米时，并不是所有的参数都能仍如以上述小规模得到很好控制。另外，放大过程的复杂性还来源于细胞的生长、适应和死亡等方面。 设计创造一个全新的过程或对现有的过程进行改进提高，需要在短时间内对大量的菌种和培养条件进行评价。摇瓶发酵研究的花费比较少，但是摇瓶不能对工艺参数（pH、营养物的添加、通风等）进行控制。这就要求使用附带通风搅拌的实验室发酵罐（约10升）。然而，对于下游处理的放大设计还需要使用发酵罐。实验规模发酵罐所得参数和效果基本上能够在大罐上得到重复，但是对于下游工艺而言，中试规模的发酵往往是必需的。确定发酵工艺绝大多数公开发表的发酵研究信息仅局限于实验室规模的发酵水平。但是商业生产过程的信息资料要比实验室水平的内容丰富得多，关于它们的细节内容通常是不公开的。诱变、基因操作和菌种筛选对于工业发酵生产水平的提高起到了决定性的推动作用。在从摇瓶到生产规模的发酵放大过程中，需要培养应用于工业发酵生产规模的种子。对种子的要求是在发酵前期能使培养液中的起始细胞浓度尽可能高，在不损害菌体生理代谢的条件下，尽量缩短菌体生长的延迟期。下图13.11是一个典型的从保藏的菌种到接种生产用发酵罐的过程。file:///C:/Users/nety/AppData/Local/Temp/ksohtml/wps_clip_image-24248.pngfile:///C:/Users/nety/AppData/Local/Temp/ksohtml/wps_clip_image-30432.pngfile:///C:/Users/nety/AppData/Local/Temp/ksohtml/wps_clip_image-3086.pngfile:///C:/Users/nety/AppData/Local/Temp/ksohtml/wps_clip_image-29379.png保藏的菌种& && & 三角瓶种子& && &一级种子& && & 二级种子& && &&&生产用发酵罐（图13.11）图13.11发酵生产：从保藏的菌种到生产用发酵罐三角瓶种子液是从冷冻、冷冻干燥或平皿保藏的菌种开始制备的。三角摇瓶含有培养液，培养液的组成是按最适于菌体生长进行设计的。首先在三角摇瓶中接种保藏的菌种，然后在摇床上培养4—48小时。接种时间和接种细胞的菌龄醉非常关键的因素。另外，培养种子还必须考虑如何使菌体细胞尽快适应发酵用培养液的生长环境。所以，设计种子液应该以菌体的生理特性为依据。所有的微生物都有一个基本营养需求，例如：水、能源、碳源、氮源、盐、和某些生长因子。目前面临的困难是设计菌体最合适的培养基和培养条件，不仅能满足菌体的基本要求，而且同时又能经济地获得所需要的发酵产品。用来分离筛选生产菌种的培养基不同于生产用培养基。工业生产设计的培养基要求能为菌体提供碳、氮、磷、钾、硫和其它一些微量营养物。碳源同时提供合成细胞和发酵产物所需要的能源。发酵用培养基设计的目标是尽可能提高目的产物的产量，减少副产物和生产费用，同时确保稳定的产品质量。在通常情况下，生产用发酵培养基是由组分复杂的天然原料组成的，同时根据需求添加适量的无机盐、有机盐、碱和酸。设计一个组分合理、营养平衡的发酵培养基，不仅需要依据微生物生理知识，同时还需要依据实际工作经验。培养基的设计综合了琼脂平板、微量效价测定平板、三角瓶培养和发酵罐试验研究获得的数据。统计分析（Plackett-Burman,Box-Benkhen）可以用来筛选优化培养基（Monaghan和Koyupal，1990）。在从摇瓶扩展到工业大罐发酵的过程中，培养基组成和培养条件往往也会发生变化（Pavlou和Fredrickson，1989；Priest Sharp，1989；Arbige et al.，1993），尽管目前已经有了许多能提供微生物基本生长需求的数学模型。但是，研究工作者经常会选择传统的配方或依据化学计量要求（菌体生长、维持消耗和产物合成）和实验统计设计的改进配方。在为工业生产选择原料时，可以选用许多廉价的营养物，它们能很好地满足菌体细胞的基本营养要求。而且许多天然廉价的原料中还含有促使编码目的基因表达的诱导物。在这些廉价原料中，豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆和酵母和蛋白水解物可以用作氮源。葡萄糖、糖蜜、淀粉、纤维素和碳泥用作碳源。硫酸镁、磷酸钾和磷酸钠以无机盐的方式加入。其它一些微量元素可以微量无机盐的方式分别添加，而事实上许多组分复杂的原料中已经含有足量的微量元素。在这些金属离子中，只有钾和镁的需要量比较大，因为它们是细胞渗透压和能量的主要调节剂，而其它一些微量元素有特定的生理作用（Hughes和Poole，1989）。酵母提取物通常含有所有的菌体生长所需求的金属元素，特别是铜、铁、镁和锌。设计用于合成产物的培养基时，需要考虑许多影响蛋白质表达和分泌的因素。在对生产用宿主微生物进行重组改造时，载体的选择对于决定培养基和生产过程至关重要。另外，在选择碳源时，代谢阻遏的现象也应该予以考虑。还有，氮和磷的代谢调节也是需要考虑的因素。大量实验发现，有些有机氮源和无机氮源对生产胞外蛋白酶有负面影响。而寡肽和蛋白质有诱导作用，盐和游离氨基酸是强烈的抑制剂（Chu et al.，1992）。氨基酸的反馈抑制并不特指某种氨基酸，而是指氨基酸的总浓度达到某一阈值时就会产生抑制作用。酶蛋白的合成同时还受到高浓度碳源的影响。在淀粉酶生产中，培养基的组成对终产物的产量有重大影响。培养液是否含有磷对酶的产量有明显影响（Thirunavukkarasu和Priest，1980）。同时还发现，使用菌体代谢缓慢的碳源，例如：淀粉或乳糖、流加葡萄糖以维持较低的碳源浓度可以明显提高酶的产量。在设计适用于菌体生长和产物合成的培养基时，我们经常会忽视如何清除不必要的代谢副产物。这些副产物来源于二个方面：一是降解原料产生的，二是由菌体代谢产生的。通常由杆菌产生的代谢产物是乙酸、丙酸和丁二醇循环的中间产物。这些酸的形成不仅是碳源的浪费，而且当积累到高浓度时，会抑制菌体的生长，甚至会导致菌体的死亡。设计好用于菌体生长和产物合成的培养基之后，下一步是准备发酵罐。目前已有一些关于发酵罐的专著（Rehm和Reed，1993）。但是，由于基因、酶和微生物代谢研究的发展，研究工作者也考虑使用一些有特殊要求的宿主微生物。选择和调节培养基的组分是否得当，直接影响发酵操作。另一个影响发酵操作的因素是灭菌方式。它是指在发酵开始前采用物理或化学的方法杀灭微生物或消除存在于液态培养液和气相中污染的生物体。除了开始需要灭菌外，在发酵过程中也要确保严格的纯培养。影响或造成发酵微生物污染的因素有如下几个方面：温度、pH值、糖浓度、培养物的组成、氧气、罐压、渗透强度和培养液中是否含有抗生素（Bader，1986）。典型的发酵培养基有利于霉菌、酵母和杆菌等杂菌的生长。但是在通常情况下，发酵过程更容易受到能形成孢子的杆菌和噬菌体的侵染对营养细胞核细胞孢子所要求的灭菌机理差异很大，同样干热灭菌合湿热灭菌的动力学差异也很大。起始的污染程度低，清除污染的方法特异性强，灭菌的效果也越明显。保持良好室内清洁有助于减少污染物，也有利于消除难以灭菌的死角。蒸汽灭菌相对于干热灭菌有优越性。蒸汽的传热速度快，能使细胞蛋白质很快变性，从而可以快速杀死细胞。作为一个定律，在生产中，所有需要杀菌的物料和与物料接触的管道表面都要与饱和蒸汽（但不是过热蒸汽）充分接触。在121℃保持10—60分钟，就足以杀死所有的耐热细菌和孢子。另外，采用萌发孢子再进行巴氏消毒（加热到63℃，保持30分钟；或者加热到80℃，保持15秒种），同样也可以杀死耐热的细菌孢子。但是，噬菌体污染很难得到控制，噬菌体可以在很短的时间内快速传遍整个生产车间。防止噬菌体污染的唯一有效方法是选育抗噬菌体的菌种。除了消毒灭菌以外，在接种培养液以前，还需要加入酶或酸对含有固形物的培养液进行预处理，以防止在接种大罐前发生培养基质传递障碍。因为微量元素营养盐只有以溶于水的离子形式存在时才能被菌体细胞吸收利用。随着培养基中的组分不断被细胞利用，发酵液的流变学特性也在发生变化。CO2产生了，形成了泡沫，需要使用消泡剂。除了对所有的液体和与物料接触的表面进行消毒灭菌以外，对通入的空气也要进行无菌消毒。空气被压缩到100psi，此时温度可上升到260℃左右。压缩空气产生的热可以大大减少空气中的微生物。但是在通常情况下，仅仅依靠压缩空气产生的热是不能达到消毒杀菌的要求的。所以，过滤除菌是目前被认为消除空气中杂菌的最好方法。标准的内流式过滤器是以膜为基础的。这种过滤膜能滤除孢子和细胞，同时在高温蒸汽杀菌的条件下也不会损坏滤器。一旦完成了培养基的配制和发酵罐的灭菌；操作过程的参数得到了优化；在控制的环境条件下生产用菌种的性能也得到了充分的深入研究。那么此时，生产的最终目的是获得最大的生物量或是在最短的时间内获得最大的底物转化量。优化菌体生长而且同时确保细胞的活力，是获得整个生产成功的关键。避免营养物和氧气的缺乏和减少副产物的形成，也有助于获得最大的目的产物的产量，而且同时也可以尽量减少对菌体细胞的应激。下游工艺与酶制剂形成整个下游加工处理和制剂制造的主要目的获得尽可能高的目的产物得率、纯度和浓度，制成一个稳定的、安全的、便于实际使用的制剂。目前可用的分离技术很多，可供选择的范围也很广。几种常规的必须考虑的因素限制了实际设计过程的选择（Becker，1995）；分离提取胞内酶或与细胞膜结合的酶相对于胞外酶来说要困难得多，这种工艺要处理从各种粘性的结合的物质，例如核酸和细胞壁物质中分离酶的挑战，需要运用多种物理化学的破壁手段。值得幸运的是木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和植酸酶，实际上都是当今主要的商业饲料用酶，都是胞外酶，从而使第一步的澄清分离成为可能。绝大多数微生物发酵是批式的或补料发酵式的，通常一直等到细胞物质、酶或其它固形物的浓度达到相当高以后才结束发酵，进行收集分离处理。一般情况下，需要对获得的收集液进行适当稀释，以防止粘结损失。同时可以还防止后续操作过程中液体流动困难。在通常情况下，饲料和食品用酶并不需要像人用的蛋白那样的高纯度。在另一方面，生产用原料必须是食品级的，或者是安全无毒的、合适的。新的酶制剂必须经过毒性检验，以确保使用是安全的。最后，经济上的考虑限制了原料和加工工艺的使用范围。在加工制造治疗人用蛋白制品时，通常需要经过多次色谱分离纯化。但是很少有饲料用或食品用酶采用，哪怕是一次色谱分离纯化。如果需要的话，正如下述的情况，通常是采用比较廉价的技术，例如萃取和结晶等工艺。发酵液的收集和细胞分离在通常情况下，发酵结束数小时内应立即进行菌体分离以防止细胞自溶。分离菌体细胞后获得的上清液一般都比较稳定，可以冷冻存放数天。在发酵液收集以前，有时需要对发酵液进行冷却、调节pH、加入某些稳定剂以尽可能减少酶的降解。对于活力强，化学性质易变的酶，例如蛋白酶，在整个回收过程中控制pH、温度、氧化剂、抑制剂和激活剂是很重要的。例如，在提取液中保持一定的浓度的钙离子（相对于酶蛋白适当过量的水平），可以确保某些含有钙离子结合位点的杆菌蛋白酶和淀粉酶的热稳定性（Cloyr et al，1970；Letton and Yunker，1982）。如果在分离提取的过程中不能从菌体中去除少量的蛋白酶和其它有活性的酶，在操作分离的早期，采用适当的办法去除或中和它们的活力是十分必须的。菌体细胞的分离收集通常采用深层过滤或离心。真菌发酵，例如木霉和曲霉发酵，采用真空转筒式过滤器进行深层过滤能起到很好的效果。通常转筒刮刀的作用可以很容易将由真菌菌丝体组成的滤饼层刮得很薄，使得滤饼层不断更新，保持一个较高的过滤速度。高处理量的过滤器（板框过滤器）也是一个很好选择。细菌发酵液通常可以采用过滤或离心。但是由于细菌的体积 电荷的细胞表面结合而使细胞凝集成大颗粒。从而提高了沉降速度、过滤的流量和上清液的澄清度。絮凝剂及其剂量的选择要考虑在分离质量、常量、费用和尽可能减少产物中絮凝物残留之间达到一种精巧的平衡。-离心经常遇到的难题是寻找合适的凝絮剂和离心分离条件，已是细胞和菌泥能够轻易地离心装置中脱离或剥离出来。当细胞浓度很高时可以利用离心分离手段，当培养物中以悬浮固形物为主时应运用过滤分离方法，一免引进对下一步浓缩或纯化步骤中的干扰。另一方面，发酵液中高浓度的固形物或粘多糖在没有助滤剂的帮助下会降低过滤速度，而凝絮剂和助滤剂的应用又往往会提高分离成本。微滤-----运用经向流动膜的过滤方式可以截留下悬浮固体而让酶液渗透过去，这是一种有前途的分离方法，它无需使凝絮剂和助滤剂，但是由于滤膜渐进式淤塞而使得该方法效率不高。设备和滤膜更新成本往往高于透支和过滤运行成本，也比等量发酵液的离心分离成本高，用于澄清滤液或浓缩液的水太多以至还需渠道多余水分才能用于饲料之中。浓缩工业生产的浓缩方法，例如：蒸发和溶剂萃取，由于可能存在酶热变性或化学变性，所以不适于用来进行酶发酵液的脱水。蒸发需要消耗大量的能量。在通常情况下，色谱分离浓缩饲用酶是不经济的。原因如下：如今在工业生产中最常用的浓缩技术是超滤。应用疏水性的经向流动膜，分子量的截留范围是10000——100000Da。超滤的流量和生产能力可以通过上游处理过程中除去一些潜在的膜的粘结物，例如某些多糖和消泡剂，得到明显加强和提高。沉淀、结晶和萃取同样也可以用来进行浓缩操作。但是工业生产最常用的纯化技术特在以下讨论。纯化、脱色和精制对于饲用酶制剂来说，纯度的主要含义不是分离蛋白杂质。但是需要确证其中只有食品级的原料、不产生有毒产品的微生物。在某些情况下，一些不需要的活性物质必须通过某种方法来除去，特别是某些不能通过改变基因的方法得以消除的附带的活性成分。有时宿主细胞存在少量的蛋白酶，在加工过程中也不会引起产生目的酶的明显降解。但是在产品加工以后储存的数个月时间内，将会对终产品造成极大的破坏。在某些情况下，额外的活性物质必须除去，因为它们会对最终的应用产生干扰。尽管色谱分离提供了最有效果的分离分配机制，但是，由于它高昂的操作成本和较低的蛋白吸附能力，对于制备饲料酶来说是不经济的。而且它操作复杂，重复性也较差。纯化可以通过已知的2种成熟的纯化技术组合完成；分级沉淀和结晶。当混合物中含有多种蛋白，但是需要分离纯化的酶蛋白只有一种时，分级沉淀是最常用的手段。降低水分活度的盐，例如；硫酸铵；或者是亲水性（与水相结合）的多聚体，例如：聚乙二醇。以浓度逐步加大的方式添加到含酶浓缩溶液中，分别收集分级沉淀，可以得到较为理想的纯度和酶产量。如果想从分级沉淀物中获得更纯净的产品，结晶是比较理想诱人的方法。即使对于那些不熟悉结晶技术的人而言，同样也会惊奇地发现结晶是没有放大效应、重复性好、费用合理的分离纯化技术。（Becker和Lawlis 1991；Visuri 1992）获得的产品纯度可以比得上多级色谱分离。这项技术面临得问题（困难）耗费大量时间筛选沉淀剂、优化结晶所需温度、PH值和溶液想变特性的定位。一旦完成了这些工作，操作过程可以线性放大。但是，应该注意，某些高度纯化的蛋白酶和其它酶蛋白在某些情况下不如低纯度形式的稳定性好，不纯物常含有起稳定作用的多肽和其它一些抑制酶降解的物质。在最近10—20年时间内，水溶液的二相萃取技术已逐步成为吸引人的浓缩技术。它提供了传统溶液的萃取选择性而不会产生蛋白变性。采用二种不相容的多聚体或多聚体——盐的组合，调节pH值和离子强度来进行。应用这项技术很成功的例子是分离纯化通过基因改造的凝乳酶。这种凝乳酶是真菌宿主细胞产生的，含有多种其它活性成分（Heinsohn et al，1992）。脱色在某些情况下是有好处的，主要是为了美观。减少颜色可以通过选择合适的培养基组分和控制灭菌，以尽可能减少氮源和碳源之间的生色反应。也可以通过活性炭吸附、使用抗氧化剂和膜渗析来降低颜色。“完成”是指在下游处理的最后一步或几步过滤，以达到清除或降低产品中的微生物。绝大多数固形物可以采用压滤或涂有其它助滤剂的过滤网予以除去。获得的滤液经过亚微米级过滤器处理，可以滤除微生物，达到所需的无菌要求。液态制剂大部分饲用酶是以浓缩液的形式出售的。浓缩液可以进一步加工成最后使用的稳定的液体或固体产品适用于终端用户。对液态制剂的要求是酶的稳定性和防止微生物的污染。在有些情况下，影响酶稳定性的因素不是来源于酶分子本身，但是对于一种结构易变的蛋白质来说，通过调整配方来提高稳定性也是很难的。因此建议在开始筛选菌种的时候就应该把酶的稳定性作为一个重要指标。绝大部分饲料用酶是水解酶，它们主要有三种失活形式：变性或构像变异、催化活性位点失活和自裂（Becker et al 1997）。减少变性的最好形式是控制温度和pH、避免接触化学变性剂；通过添加足够量的辅酶，通常是金属离子，可以防止催化活性位点的失活；添加抗氧化剂可以防止活性位点的氧化。另外，通过酶蛋白的基因工程改造也可以防止活性位点的氧化失活。最后是自裂——酶蛋白的自我降解消化。例如蛋白酶，通过上游除去蛋白酶，使用脱水剂，使水的活度降低；或添加抑制剂，使自裂降低到最低限度。比较有用的脱水剂包括糖和其它多羟基化合物，例如葡萄糖、甘油、山梨醇和丙二醇。有效的抑制剂包括底物类似物，例如多肽和酸盐。通过添加食品级的防菌制剂，如：苯甲酸钠、甲基对羟基苯甲酸酯和各种商业制剂，可以相当方便地防止微生物污染。防止沉淀和浑浊的方法通常是一些经验性的手段。不同的酶有不同特定的方法、特定的处理原料。建议处理原料采用溶解性好的组分、寻找有效的配制方法，延长在高温和低温条件下的储存时间。固体制剂绝大多数饲料酶都是以液态制剂作为终端用户的使用形式，其原因是因为液态制剂使用方便。而绝大多数酶的预混剂是以固态的形式出售给饲料厂的。固态制剂具有明显的优点。例如：加强稳定性、延长和控制释放；防止在某些极端运用状态时失活。关于后者的一个例子是使用颗粒制剂，包埋酶以防止在蒸汽制粒过程中失活。使用有效的稳定剂和包被可以防止或延缓酶蛋白与高温高湿环境的接触，从而有利于随后的饲料加工和实际应用。干燥的酶制剂，在绝大多数工业生产中，通常是以包被颗粒的形式提供的，以满足工业生产对于粉尘控制的严格要求。酶蛋白颗粒化的主要技术包括造粒、挤压和圆整成形；高剪切制粒和流化床喷雾干燥。后二种技术对于生产低粉尘颗粒有较大的优越性。采用流化床干燥方法的优越性在于整个造粒过程可以在一个设备容器种进行。另外，在本方法种涉及的喷雾包被过程可以对包被层的厚度、组分进行调整，操作的弹性很大。立法和环境因素除了拥有发酵、回收和产品复配技术外，还必须拥有可靠的质量控制手段和分析方法。它们是确保产品质量的有力保障。在全世界有各种与饲料酶立法有关的机构。在美国，所有饲料用的组分，包括青储制剂，都必须在AAFCO手册上登记。（AAFCO：美国饲料质量控制官方委员会）在销售所在的州注册，并给当地的州政府交纳税费。没有在AAFCO手册上列出的酶需要经过安全性和有效性评价。评估由FDA中心进行。由兽药中心推荐决定是否列入AAFCO。在欧洲，所有的酶产品都必须提交一个完整的记录文件和相应的商业名称的证明材料。尽管各个国家的立法方式各不相同，但是绝大多数都需要以下内容：① 应用充分了解的，无毒害的非致病性微生物。② 完整的GMP记录，安全、重复性好的发酵回收生产过程；所用的原料也是经过充分检验的。③ 没有毒素和病原菌。④ 重金属和其它微生物的含量尽可能低。不仅对基因工程菌的生理代谢充分了解，而且能确保在外界可控制条件下基因工程菌是没有生存竞争力的。（也就是说要达到这样一个目标，在工业化规模的生产中，纯培养的基因工程菌可以很好地生长，而在外界条件下基因工程菌是不能存活的。这样就可以最大限度地保证安全，即使基因工程菌泄漏到外界也不会对外界地生物安全性造成影响。）与传统的技术相比，现代生物技术有优势，例如，由基因工程菌发酵生产获得的酶产量较高，从而可以有效地降低单位产品的原材料消耗。结论& & 在过去的几十年内，生物技术的发展对医疗、制药和保健行业，以及在工业生产、食品和饲料加工等领域都产生了重大影响。重组DNA技术已经被证明是提高酶制剂产量的一个有效方法，包括外源或微量的酶组分，生产含有设定酶组分的产品以满足各种用途。近年来在筛选方法和基因组学研究方面的突破，使得更快更多获得特定的酶成为可能，出发菌株可以是可培养的、也可以是不可培养的。采用基因改造的方法给自然存在的酶额外的特性以及加速微生物的定向变异进化过程给设计特定的酶提供了一些路径，这些特定的酶有些特定的用途。这些技术，结合充分了解的宿主微生物和优化的可以控制的发酵回收和复配方法，为获安全、稳定和经济合理的发酵产物提供了可靠保证。
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