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酒蒸黄连炮制品及其制备方法和用途
来源：广搜网
公益为中国网民提供数字化信息
发布日期： 16:06:20
&&&&发明人：赖先荣 孟宪丽 张艺 李佳川郑海杰（摘要：本发明提供了一种酒蒸黄连，本发明还提供了该酒蒸黄连的制备方法和用途。本发明酒蒸黄连作为胰岛素增敏剂及PPARγ 激动剂，具有抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖利用率及降低血脂，改善胰岛素抵抗和糖尿病药物。本发明涉及的酒蒸黄连及其提取浸膏，制备，具有抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖利用率或降低血脂功能及在改善胰岛素抵抗或糖尿病药物中的用途，具有明确的药效，药效优于盐酸小檗碱和生品黄连及其提取浸膏，安全性明显优于生品黄连。(66)本国优先权数据）
用黄酒或白酒40 份拌匀，闷润6 小时，加热蒸制8 小时，取出，干燥。2. 一种制备权利要求1 所述的黄连炮制品的方法，其特征在于：所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每100 份黄连，用酒40 份拌匀，闷润6 小时，加热蒸制8 小时，取出，干燥。3. 权利要求1 所述的酒蒸黄连炮制品在制备PPARγ 激动剂的药物中的用途。4. 根据权利要求3 所述的用途，其特征在于：所述的药物是抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖利用率的药物或胰岛素增敏剂。5. 根据权利要求３或４所述的用途，其特征在于：所述的药物是降低血脂功能、改善胰岛素抵抗，降低糖异生的药物。6. 根据权利要求３或４所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗糖尿病及其并发症的药物。7. 权利要求1 所述的酒蒸黄连炮制品在制备α- 葡萄糖苷酶抑制剂的药物中用途。8. 一种具有抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖利用率的药物组合物，其特征在于：它是由下述方法制备而成：取权利要求1 所述的酒蒸黄连，加水煎煮3 次，每次3 小时，每次加水量为10 倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备用，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。9. 根据权利要求8 所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是口服制剂。酒蒸黄连炮制品及其制备方法和用途技术领域[0001] 本发明涉及一种酒蒸黄连，本发明还提供了该酒蒸黄连的制备方法和用途。背景技术[0002] 据世界卫生组织《2008 年世界卫生报告》：城市化、老龄化和全球性的生活方式变化三者结合，使糖尿病等慢性非传染性疾病成为越来越主要的疾病和死亡原因。据中华医学会糖尿病学分会《中国2 型糖尿病防治指南(2007 版)》：中国糖尿病患病人群中，以2 型糖尿病为主( 占93.7％ )，2025 年预计将达到5500 万人。糖尿病属于中医“消渴”病范畴，中医药理论认为“消渴”的病机：因恣食肥甘，或情志过极、房事不节、热病之后等，郁热内蕴，气化失常，津液精微不能正常输布而下泄，阴虚燥热(GB/T 7 中医临床诊疗术语疾病部分)。“凡积久饮酒，未有不成消渴。”( 唐代《千金方》)[0003] 黄连为常用中药，中医很早就认识到“治消渴”的用途，历代本草及名医验案多有记载，梁代《名医别录》记载“止消渴”；唐代《新修本草》记载“黄连，疗渴为最”。明代《玉机微义》记载“酒蒸黄连丸，治消渴，饮水无度至二三升，小便五七十次，发热瘦弱，口干，食已如饥，此名消瘅。今用味苦无毒，除热正气，消渴厚肠。消渴之人，脾胃恶湿，黄连为对。黄连净，半斤，酒一升，汤重蒸。伏时晒干用，右末，滴水丸，梧子大，每五十丸食前温水下”；明代《本草纲目》记载“治消渴，用酒蒸黄连”；朝鲜医籍《东医宝鉴》引明代《医学纲目》“治消渴要药，酒浸蒸，晒干为末，蜜丸，白汤下五七十丸”；清代《本草备要》记载“单用能治消渴”。[0004] 中药黄连也为治疗消渴病( 糖尿病) 的中成药处方中常用药味，2006 年国内医院糖尿病用药分析结果表明，在排名前十位的产品中，糖脉康颗粒( 含黄连，市场分额22.1％，约1 亿元)、金芪降糖片( 含黄连，市场分额11.6％，约5000 万元)，分列第2、4 位，在中医临床中广泛应用。[0005] 但本草医籍对治消渴宜用的黄连饮片( 炮制品)，或语焉不详，或统而概之，现代研究中也缺少对黄连不同炮制品在“治消渴”用途上的实验证据，导致在中医临床实践中甚至提出“黄连不是治疗消渴病( 糖尿病) 的主药”。[0006] 目前黄连治疗消渴病( 糖尿病) 的研究主要集中在生品黄连及单一有效成分( 小檗碱) 及生品黄连中提取的黄连总碱上，[ 黄笑夏，欧阳钦. 黄连免煎颗粒治疗肝原性糖尿病临床观察. 天津药学.) ：41-42] 等报道，在临床单独使用胰岛素及黄连素免煎颗粒与胰岛素联合应用均能有效降低血糖，但黄连素免煎颗粒与胰岛素联合应用效果更好，且黄连素免煎颗粒与胰岛素联合应用组血糖值控制得更为稳定。[Li-Qin Tang，Wei Wei，Li-MingChen，et al.Effects of berberine on diabetes induced by alloxananda high-fat/high-cholesterol diet in rats.Journal ofEthnopharmacology.2006，108(1) ：109 ～ 115] 报道，对饮食诱导的糖尿病高脂血症大鼠模型( 高脂/ 高胆固醇/ 四氧嘧啶)，小檗碱抑制了糖尿病进程，作用机制可能与降血糖、调节血脂代谢等作用相关。[ 朱红卫，唐礼可. 黄连总碱对小鼠降糖作用研究. 云南中医中药杂志.) ：59 ～ 60]报道，黄连总碱具有显著降血糖作用，对正常小鼠的血糖水平没有影响。[0007] 小檗碱对改善2 型糖尿病患者胰岛素抵抗方面有明确作用，而黄连各种饮片规格都含有小檗碱成分，不同的黄连炮制品的功效也有不同，而且含有小檗碱成分的黄柏、三颗针等中药临床效用也有不同，为中医临床处方用药所困惑，早在清代《修事指南》就指出“炮制不明，药性不确，则汤方无准而病症不验也”，因此本发明发掘本草经验，系统研究了酒蒸黄连“治消渴”用途及其安全性，对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征、糖尿病或并发症具有一定的意义。发明内容[0008] 本发明的技术方案是提供了一种酒蒸黄连炮制品。本发明的另一技术方案是提供了该炮制品的制备方法和用途。[0009] 本发明提供了一种酒蒸黄连炮制品，它是将黄酒或白酒加入生黄连中蒸制而成，制备的黄连炮制品的指纹图谱如图1 所示，主要指标成分包括药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱及其以上生物碱成分的盐酸盐，其中，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为：4-7 ∶ 5-9 ∶ 11-17 ∶ 23-35 ∶ 23-27 ∶ 100。[0010] 进一步优选地，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为：4.7-6.8 ∶ 5.7-8.3 ∶ 11.5-16.7 ∶ 23.9-34.5 ∶ 23.4-26.5 ∶ 100。[0011] 更进一步优选地，所述的药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为：5.6 ∶ 7.1 ∶ 14.8 ∶ 31.0 ∶ 24.5 ∶ 100。[0012] 本发明酒蒸黄连炮制品是由如下方法制备而成：取净黄连，加黄酒或白酒闷润1-6 小时，加热蒸制3 ～ 8 小时，取出，干燥，即得，其中黄连与黄酒或白酒的用量配比为：[0013] 黄连100 份、黄酒或白酒20 ～ 120 份。[0014] 进一步优选地，所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每100 份黄连，用酒40 份拌匀，闷润6 小时，加热蒸制8 小时，取出，干燥。[0015] 本发明还提供了一种制备所述的黄连炮制品的方法，它是由如下方法制备而成：取净黄连，加黄酒闷润1-6 小时，加热蒸制3 ～ 8 小时，取出，干燥，即得，其中黄连与黄酒的用量配比为：[0016] 黄连100 份、黄酒20 ～ 120 份。[0017] 进一步优选地，所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每100 份黄连，用酒40 份拌匀，闷润6 小时，加热蒸制8 小时，取出，干燥。[0018] 本发明还提供了所述的黄连炮制品在制备具有抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高葡萄糖利用率或降低血脂功能的药物中的用途。[0019] 其中，所述的药物是改善胰岛素抵抗，降低糖异生的药物。[0020] 其中，所述的药物是治疗糖尿病及其并发症的药物。[0021] 本发明还提供了该黄连炮制品在制备胰岛素增敏剂及PPARγ 激动剂的药物中的用途。与生品黄连、小檗碱比较，显著增加PPARγ 表达量，可以显著改善胰岛素抵抗，是具有开发前景的胰岛素增敏剂。[0022] 本发明还提供了所述的黄连炮制品在制备α- 葡萄糖苷酶抑制剂的药物中用途。[0023] 本发明还提供了一种具有抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化、提高3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖利用率或降低血脂功能的药物组合物，它是由下述方法制备而成：取权利要求1-4所述的酒蒸黄连，加水煎煮1 ～ 3 次，每次0.5 ～ 3 小时，每次加水量为6 ～ 10 倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备用，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。[0024] 进一步优选地，它是由下述方法制备而成：取酒蒸黄连，加水煎煮3 次，每次3 小时，每次加水量为10 倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备用。[0025] 其中，所述的制剂是口服制剂。[0026] 本发明酒蒸黄连与生品黄连及盐酸小檗碱相比，具有明显的作用，药效明确，为临床提供了一种新的选择。[0027] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明[0028] 图1 酒蒸黄连样品HPLC 图谱( 其中，1- 盐酸药根碱 2- 非洲防己碱 3- 表小檗碱4- 黄连碱 5- 巴马汀 6- 盐酸小檗碱)[0029] 图2 酒蒸黄连给药后大鼠血清HPLC 指纹图谱( 其中，a ：对照品色谱图：b 空白血清色谱图 c ：酒蒸黄连体内色谱图，1- 非洲防己碱 2- 表小檗碱 3- 黄连碱 4- 小檗碱)[0030] 图3 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞模型增殖影响[0031] 图4 显微镜下的3T3-L1 前脂肪细胞及3T3-L1 脂肪细胞(×200)A ：3T3-L1 前脂肪细胞；B ：3T3-L1 脂肪细胞；C ：3T3-L1 脂肪细胞( 油红O 染色)[0032] 图5 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞株分化的影响[0033] 图6 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 脂肪细胞IR 模型葡萄糖利用的影响[0034] 图7 酒蒸黄连对PPARγ 表达的影响(Western blot 法)具体实施方式[0035] 实施例1 本发明酒蒸黄连炮制品的制备[0036] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒0.2kg)，置锅内，闷润2 小时，加热蒸制5 小时，取出，干燥。[0037] 实施例2 本发明酒蒸黄连炮制品的制备[0038] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒0.4kg)，置锅内，闷润4 小时，加热蒸制8 小时，取出，干燥。[0039] 实施例3 本发明酒蒸黄连炮制品的制备[0040] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒0.6kg)，置锅内，闷润6 小时，加热蒸制4 小时，取出，干燥。[0041] 实施例4 本发明酒蒸黄连炮制品的制备[0042] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒0.8kg)，置锅内，闷润1 小时，加热蒸制7 小时，取出，干燥。[0043] 实施例5 本发明酒蒸黄连炮制品的制备[0044] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒1kg)，置锅内，闷润3 小时，加热蒸制3 小时，取出，干燥。[0045] 实施例6 本发明酒蒸黄连炮制品的炮制工艺优选[0046] 取净黄连，加酒拌匀( 每1kg 净药材，用黄酒或白酒1.2kg)，置锅内，闷润5 小时，加热蒸制6 小时，取出，干燥。[0047] 以上6 个试验例制备的酒蒸黄连炮制品，测定总生物碱含量，同时进行薄层色谱分析。[0048] 总生物碱测定方法：取黄连粉末约0.8g，精密称定. 置索氏提取器中，用盐酸- 甲醇(1 ∶ 100) 适量。加热回流提取，至提取液无色为止，将提取液转移至25mL 量瓶中，用盐酸- 甲醇(1 ∶ 100) 少量洗涤容器，洗液并人提取液中，并加至刻度。照柱色谱法( 附录VIC) 试验，精密量取5mL，加于已处理好的氧化铝柱( 内径约9mm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇约30mL 预洗) 上，用乙醇35mL 分次洗脱，置50mL 量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL，置50mL 量瓶中，用硫酸溶液(0.05mol/L) 稀释至刻度，摇匀，照分光光度法以硫酸溶液(0.05mol/L) 为空白，在345nm 波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱(C20H18ClNO4) 的吸收系数为728 计算其含量。[0049] 表1 酒蒸黄连炮制工艺均匀设计试验表与结果[0050][0051] 含量综合评分＝Σ ( 表2 中各生物碱含量/ 表3 中各生物碱最高值*100)[0052] 效应综合评分＝Σ ( 表3 中各剂量组葡萄糖利用率/ 表3 中各剂量组葡萄糖利用率最高值*100)[0053] 表2 酒蒸黄连炮制工艺含量测定结果[0054][0055] 表3 酒蒸黄连炮制工艺样品对3T3-L1 细胞模型葡萄糖利用率的影响[0056][0057] (1) 采用统计分析软件对含量综合评分结果进行多元逐步回归分析，得到回归方程：[0058] Y ＝ 570.02-0.41*X1+4.18*X2[0059] P ＝ 0.019，回归方程有显著性意义[0060] (2) 采用统计分析软件对含量综合评分结果进行多元二次逐步回归分析，得到回归方程2 ：[0061] Y ＝ 574.45-0.17*X1-0.08*X3*X3-0.04*X1*X3+0.71*X2*X3[0062] P ＝ 0.0021，回归方程有显著性意义[0063] 最高指标时的因素水平组合：黄酒用量20％、闷润时间6 小时、蒸制时间8 小时。[0064] (3) 采用统计分析软件对特征性成分( 非洲防己碱) 含量进行多元逐步回归分析，得到回归方程3 ：[0065] Y ＝ 0.9*X3[0066] P ＝ 0.055，回归方程无显著性意义[0067] (4) 采用统计分析软件对效应综合评分结果进行多元逐步回归分析，得到回归方程：[0068] Y ＝ 211.69-0.63*X1[0069] P ＝ 0.040，回归方程有显著性意义[0070] (5) 采用统计分析软件对效应综合评分结果进行多元二次逐步回归分析，得到回归方程：[0071] Y ＝ 179.68+0.41*X1-0.01*X1*X1+0.09*X1*X3-0.57*X2*X3[0072] P ＝ 0.049，回归方程有显著性意义[0073] 最高指标时的因素水平组合：黄酒用量60％、闷润时间1 小时、蒸制时间8 小时。[0074] 由方程1、2、3、4、5，结合直观分析及成本效益分析，确定酒蒸黄连的工艺参数为：取净黄连，每100kg 用黄酒或白酒40kg，闷润6 小时，蒸制8 小时，即得。[0075] 根据方程2 的含量综合评分的预测值为584[0076] 根据方程5 的效应综合评分的预测值为182[0077] 以上预测结果表明，在确定的酒蒸黄连的工艺参数下，含量与效应的结果比较理想，也与均匀设计试验号2 的因素水平设置相近。[0078] 因此确定酒蒸黄连的工艺参数为：取净黄连，每100kg 用黄酒或白酒40kg，闷润6小时，蒸制8 小时，即得。[0079] 实施例7 本发明酒蒸黄连的质量控制方法[0080] 酒蒸黄连的质量控制方法[0081] (1) 薄层色谱鉴别[0082] 取本品粉末0.1g，加甲醇50ml，超声处理30min，滤液作为供试品溶液。取盐酸药根碱照品、非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱加甲醇制成每1ml 含0.1mg 的溶液，作为对照品溶液。精密量取各对照品溶液1.5ml 加入同一10ml 量瓶中，以甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。照薄层色谱法( 中国药典2005 年版一部附录VI B) 试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷- 乙酸乙酯- 异丙醇- 甲醇- 氨水- 三乙胺(3 ∶ 3.5 ∶ 1 ∶ 1.5 ∶ 0.5 ∶ 1) 并以氨水预饱和20min 后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[0083] (2) 含量测定[0084] 方法：采用XtimateTM C18(4.6mm×250mm，5μm) 色谱柱，以0.1％三乙胺( 碳酸氢铵，氨水调PH 为10) 为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速：1mL.min-1，柱温：30℃，检测波长270nm。结果：盐酸药根碱在0.848μg.mL-1 ～ 16.96μg.mL-1(r ＝ 0.9997)、非洲防己碱在1.248μg.mL-1 ～ 24.96μg.mL-1(r ＝ 0.9999)、表小檗碱在2.048μg.mL-1 ～40.96μg.mL-1(r ＝ 0.9999)、黄连碱在3.648μg.mL-1 ～ 72.96μg.mL-1(r ＝ 0.9999)、巴马汀在2.88μg.mL-1 ～ 57.6μg.mL-1(r ＝ 0.9998)、盐酸小檗碱在13.248μg.mL-1 ～264.96μg.mL-1，(r ＝ 0.9996) 呈现良好的线性关系。加样回收率及其RSD 分别为：102.4％(RSD 为1.17％ )、101.8％ (RSD 为1.30％ )、100.3％ (RSD 为1.76％ )、100.7％ (RSD 为1.75％ )、101.2％ (RSD 为1.53％ ) 和97.9％ (RSD 为1.97％ )。样品重复性良好，在12h内稳定。结论：方法操作简便、准确性高、稳定性好，可用于酒蒸黄连中6 种生物碱的含量测定。[0085] 表4 酒蒸黄连的含量测定结果[0086][0087] 对以上含量测定数据采用SPSS 统计软件进行进行两样本均数的比较分析(Independent-Samples T Test)，统计分析结果表明酒蒸黄连中非洲防己碱的含量与生品饮片比较有显著性变化(P ＝ 0.017)( 指纹图谱见图1)，同时在血清化学指纹图谱发现的入血成分中非洲防己碱的色谱峰明显，非洲防己碱的可能是酒蒸黄连中与药效生物效应相关的重要成分之一，见图2。[0088] 由实施例6 中酒蒸黄连工艺各实验号测定结果( 表2)，结合实施例7 中各批次酒蒸黄连测定结果( 表4)，合并各结果构成表5[0089] 表5 酒蒸黄连含量测定结果(mg/g)[0090][0091] 表6 酒蒸黄连含量测定结果( 比例含量，以盐酸小檗碱含量为100 计算)[0092][0093] 按统计学意义的99％置信区间( 下限值，上限值)，Uα/2 ＝ 2.56(α ＝ 0.01) ：下限值＝平均值-Uα/2× 标准偏差，上限值＝平均值+Uα/2× 标准偏差[0094] 综上所述，酒蒸黄连中，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为：4.74-6.84∶5.67-8.32∶11.54-16.66∶23.89-34.49∶23.38-26.46∶100 或：4-7 ∶ 5-9 ∶ 11-17 ∶ 23-35 ∶ 23-27 ∶ 100[0095] (3) 化学指纹图谱[0096] 酒蒸黄连化学指纹图谱的主要特征峰包括药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱，还包括以上生物碱成分的盐酸盐( 图1)。[0097] 酒蒸黄连HPLC 指纹图谱的最佳色谱条件为：XtimateTMC18(4.6×250mm，5μm) ；柱温30℃ ；流速1.0ml/min ；检测波长：270nm ；流动相：0.1％三乙胺的水溶液( 碳酸氢铵，氨水调节PH 到10)- 乙腈( 二元梯度洗脱) ；进样量：10ul ；采样时间：45min，洗脱程序如下：[0098] 流动相：A 泵：0.1％三乙胺的水溶液( 碳酸氢铵，氨水调节PH 到10) ；B 泵：乙腈。[0099] 时间程序：0 ～ 15min，A 泵：90％→ 75％ ；B 泵：10％→ 25％[0100] 15 ～ 25min，A 泵：75％→ 70％ ；B 泵：25％→ 30％[0101] 25 ～ 40min，A 泵：70％→ 55％ ；B 泵：30％→ 45％[0102] 40 ～ 50min，A 泵：55％→ 90％ ；B 泵：45％→ 10％[0103] 酒蒸黄连供试品溶液制备方法：取酒蒸黄连粉末0.1g，精密称定，置锥形瓶中，加入盐酸- 甲醇(1 ∶ 100)50ml，超声处理30min，滤过，过0.45um 微孔滤膜，取续滤液，即得。[0104] 酒蒸黄连水提取浸膏供试品溶液制备方法：取酒蒸黄连25g，精密称定，置烧杯中，加水150ml，煎煮3h，煎煮3 次，合并水煎液，浓缩至1g/g 浓缩液。取0.1g 浓缩液，精密称定，置锥形瓶中，加入盐酸- 甲醇(1 ∶ 100)50ml，超声处理30min，滤过，过0.45um 微孔滤膜，取续滤液，即得。[0105] (4) 血清化学指纹图谱[0106] 酒蒸黄连血清化学指纹图谱中的主要特征峰包括非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、小檗碱，还包括以上生物碱成分的盐酸盐( 图2)。[0107] 整体动物模型灌胃样品的制备：取酒蒸黄连100g，加水600ml，煎煮2h，煎煮3 次，合并水煎液，浓缩至1g/ml，即得灌胃样品。[0108] 试验方法：取SD 大鼠5 只。禁食12h( 自由饮水)，称体重，按照5g/kg 灌胃给予酒蒸黄连浓缩液(1g/ml)，给药后180min，股动脉取血，37℃水浴15min，3600rpm 离心15min，分离血清，即为含药血清。取各时间点含药血清1ml 分别置于5ml 带盖离心管中，分别加入乙腈3ml 涡旋3min，3600r/min 离心10min，取上清液，于37℃氮吹仪吹干，加入50％甲醇75μl，涡旋3min，120000r/min 离心10min，即得。[0109] 色谱分析条件同“化学指纹图谱”项下。[0110] (5) 其控制指标[0111]控制指标 水分 总灰分 酸不溶性灰分 醇溶性浸出物平均值(n ＝ 10) 9.10％ 3.13％ 0.81％ 29.63％[0112] 实验例7 本发明酒蒸黄连炮制品提取浸膏的制备工艺优选[0113] 根据均匀设计试验和水煎提取工艺特点，考察加水量、提取时间、提取次数等三个因素，选择混合水平的均匀设计表U6(6×32)。[0114] 称取黄连10g，加水至规定量，水煎提取规定时间，提取规定次数，提取液浓缩至10mL。[0115] 表7 酒蒸黄连水煎提取工艺的影响因素与水平设置[0116][0117] 表8 酒蒸黄连水煎提取工艺的均匀设计试验表和结果[0118][0119] (1) 采用DPS 统计软件对总生物碱含量结果进行多元逐步回归分析，得到回归方程1 ：[0120] Y ＝ 1.9*X1+0.5200*X3[0121] P ＝ 0.0121 ；回归方程有显著性意义[0122] (2) 采用DPS 统计软件对总生物碱含量结果进行多元二次逐步回归分析，得到回归方程2 ：[0123] Y ＝ 2.5*X1*X3+0.[0124] P ＝ 0.0164 ；回归方程有显著性意义[0125] 最高指标时的因素水平组合：加水量为100ml，提取时间为3 小时、提取次数为3次[0126] 由方程1、2 可知，对黄连水煎提取工艺影响的显著因素是提取时间、提取次数，其次是加水量，从确定了酒蒸黄连水煎提取工艺的优化参数为：取净黄连，加水煎煮3 次，每次3 小时，每次加水量为10 倍量，滤过，合并提取液。[.3 验证方法与结果[0128] 按2.3.2 项下确定的优化水煎提取工艺参数，进行验证试验，由表9 可知，酒蒸黄连的水煎提取工艺稳定可行。[0129] 表9 酒蒸黄连水煎提取工艺的验证试验表和结果[0130][0131] 实验例8 本发明酒蒸黄连提取浸膏的制备[0132] 根据实验例6、7 提供的优化工艺，提取制备了酒蒸黄连提取浸膏供药理实验，在总生物碱测定的基础上还测定了总多糖的含量。根据实验例7 提供的优化工艺，还提取制备了生品黄连的提取浸膏供药理实验，在总生物碱测定的基础上还测定了总多糖的含量。[0133] 总生物碱的测定方法：精密称取浸膏0.4g，至25mL 量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，照柱色谱法试验。精密量取5mL，置已处理好的氧化铝柱( 内径约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇30mL 预洗) 上，用乙醇35mL 洗脱，收集洗脱液置50mL 量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取2mL 转置50mL 量瓶中，用0.05mol/l H2SO4 溶液，稀释至刻度，摇匀。按照紫外分光光度法，在345nm 波长处，测定吸收度，按盐酸小檗碱的吸收系数为728计算，即得。[0134] 总多糖的测定方法：精密称取已经提取好的黄炮制品品提取浸膏，置离心管中，加无水乙醇至80％，混匀，离心10min(3000r/min)，弃去上清液，用80％乙醇多次洗涤沉淀，至离心上清液无色，沉淀用沸水分次使溶解，离心，上清液转移置100mL 量瓶中，精密吸取5mL 转移置25mL 量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品。分别吸取供试品溶液、葡萄糖对照品溶液(0.06mg/mL)2mL 至具塞试管中，加入蒽酮试剂8mL，涡旋30s，沸水10min，冷却至室温，在620nm 处测定其吸光度，计算以葡萄糖计算的黄连总多糖的含量。[0135] 表10 酒蒸黄连提取浸膏总生物碱/ 总多糖测定结果[0136][0137] 由上数据可知，酒蒸黄连提取浸膏中总生物碱含量明显低于生品黄连。[0138] 以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。[0139] 试验例1 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞增值的影响[-L1 前脂肪细胞株是小鼠胚胎来源、具有纤维母细胞形态的细胞株，在经典的激素鸡尾酒，即胰岛素、地塞米松和1- 甲基-3- 异丁基黄嘌呤的刺激下，具有分化为成熟脂肪细胞的能力，是目前国际上研究肥胖及体外脂肪细胞增殖和分化的细胞模型。通过干预小鼠前脂肪细胞观察其对该细胞增殖和分化的影响，为肥胖的2 型糖尿病的治疗提供可能的途径。[0141] 方法：将3T3-L1 前脂肪细胞悬液按5×105/ml 的密度接种到48 孔培养板，于含10％小牛血清的DMEM 高糖培养基中，在37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养，2d 换液1 次。待3T3-L1 前脂肪细胞贴壁后，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预，空白对照组培养液中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6 个复孔。在37℃、体积分数5％ CO2 中培养2d。48h 后，PBS 漂洗，加入DMEM 高糖培养液400μl 及5mg/ml MTT 40μl，孵育4h。吸去培养液，并加入溶媒DMSO 300μl，490nm 测定各组的OD 值。计算3T3-L1 前脂肪细胞增殖变化率。[0142] 相对变化率(％ ) ＝ ( 实验组平均OD 值/ 空白对照组平均OD 值-1)×100％[0143] 表11 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞增殖的影响[0144][0145] 增殖率1 ：各剂量组相对空白组的增殖变化率；[0146] 增殖率2 ：酒蒸组相对于同剂量组生品的增殖变化率。[0147] 注：与空白对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 ；[0148] 由表11、图3 可知，酒蒸黄连促进3T3-L1 前脂肪细胞增殖作用优于黄连生品。[0149] 试验例2 酒蒸黄连提取浸膏对对3T3-L1 前脂肪细胞分化的影响[0150] 方法：将3T3-L1 前脂肪细胞悬液按5×105/ml 的密度接种到48 孔培养板，于含10％小牛血清的DMEM 高糖培养基中，在37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养，2d 换液1 次。待3T3-L1 前脂肪细胞达到接触抑制后，用含1μmol/L 的Dex、0.5mmol/L IBMX 及5mg/L 胰岛素的DMEM 完全培养液诱导分化，48h 后撤去Dex 和IBMX，用10mg/L 胰岛素再继续作用48h，换正常完全培养液培养8 ～ 12 天，隔天换液，直至3T3-L1 细胞90％多呈脂肪细胞表型时。在诱导分化的同时，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预，空白对照组培养液中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6 个复孔。药物与分化培养液同步更换至分化结束。诱导分化结束后，吸去培养液，细胞经PBS 清洗3 次后，用4％多聚甲醛溶液固定细胞10min，吸去固定液，PBS 漂洗，加入油红O 染液室温染色15min。弃去油红O 染液，PBS 漂洗3 次除去多余染液；置显微镜下观察，拍片；加入异丙醇，抽提脂肪细胞中油红O，510nm 测定OD 值，计算细胞分化相对变化率。[0151] 分化相对变化率(％ ) ＝ ( 实验组平均OD 值/ 空白对照组平均OD 值-1)×100％[0152] 未分化的3T3-L1 前脂肪细胞呈梭形，胞浆中无脂滴存在，形态与成纤维细胞相似( 图4-A)。3T3-L1 前脂肪细胞在地塞米松、3- 异丁基-1- 甲基黄嘌呤和胰岛素的共同作用下，逐渐诱导分化成为成熟的脂肪细胞，胞浆内出现脂滴，并随着分化程度的加深而积聚增多( 图4-B)。油红O 为脂肪特征性染色剂，染色后胞浆中的脂滴呈红色( 图4-C)。[0153] 表12 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞株分化的影响[0154][0155] 注：与空白对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 ；[0156] 由表12，图5 可知，酒蒸黄连有2 个剂量组明显抑制3T3-L1 前脂肪细胞的分化(P＜ 0.01)，这与阳性药马来酸罗格列酮作用恰好相反；同时，与黄连生品相比较，酒蒸黄连抑制分化率均明显高于黄连生品。[0157] 上述实验结果表明，酒蒸黄连在一定剂量下抑制3T3-L1 前脂肪细胞的分化，提示酒蒸黄连炮制品可能不会引起脂肪的聚集而造成体重增加，这对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征或并发症具有一定的意义，而且其作用优于黄连生品。[0158] 试验例3 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞胰岛素抵抗(IR) 模型葡萄糖利用的影响[0159] 方法：细胞分化完全后，除空白组加入正常培养基，其余各组均加入1μmol/L 的地塞米松、1μmol/L 的胰岛素进行脂肪细胞的胰岛素抵抗，作用3d。待脂肪细胞胰岛素抵抗成立后，换用无酚红DMEM 高糖培养基，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预3d，空白对照组培养液中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6 个复孔，观察药物对胰岛素抵抗的改善作用。72h 后取细胞培养上清液505nm 比色测定葡萄糖的含量，计算细胞葡萄糖利用相对变化率。[0160][0161] 表13 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 脂肪细胞IR 模型葡萄糖利用的影响[0162][0163][0164] 注：与模型对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 ；[0165] 由表13，图6 可知，与空白组比较，3T3-L1 脂肪细胞在地塞米松和胰岛素作用下，模型组对胰岛素的敏感性明显降低，培养液中葡萄糖的摄取明显减少，表明脂肪细胞胰岛素抵抗模型造模成功(P ＜ 0.01)。与模型组比较，酒蒸黄连能明显或部分降低培养液中葡萄糖的含量(P ＜ 0.05 ～ 0.01)，提高脂肪细胞葡萄糖的利用率，改善胰岛素抵抗，作用与阳性药马来酸罗格列酮相似，同时，酒蒸黄连有3 个剂量组的葡萄糖利用相对变化率高于黄连生品。[0166] 试验例4 酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1 前脂肪细胞PPARγ 的影响[0167] 过氧化物酶增殖物活化受体(Peroxisome Proliferator ActivatedReceptors，PPARs)，PPARs 包括PARα、PPARγ 和PPARδ 等三种亚型。PPARγ 则主要在肝脏及脂肪、肌肉组织表达，促进脂肪组织的分化、脂肪酸合成和储存，是脂肪形成的关键物质。PPARγ 与配体或激活物结合后，可进一步激活脂肪细胞分化过程，参与调节脂肪细胞特异基因的表达、脂质贮存和代谢。目前PPARγ 激动剂中的典型药物是罗格列酮，它是人工合成的PPAR配体，它有胰岛素增敏及降血糖作用，可通过激活靶组织中的PPARγ 发挥改善胰岛素抵抗(IR)、降低血糖、抑制血管平滑肌的增殖和迁移、改善内皮功能等多种生物学效应。[0168] 对3T3-L1 前脂肪细胞模型，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预，Western blot 检测PPARγ 表达量，结果表明：与生品比较，酒蒸黄连使PPARγ 的蛋白表达量显著上升，见图7。[0169] 体外培养3T3-L1 前脂肪细胞经小檗碱干预，在3T3-L1 脂肪细胞分化过程中，小檗碱组脂肪细胞的PPARγmRNA 较对照组低48％，蛋白质免疫印迹结果也显示小檗碱抑制PPARγ 的表达[ 周丽斌，杨颖，唐金凤，等. 小檗碱对脂肪细胞糖代谢的影响. 上海第二医科大学学报.) ：412-414]。而PPARγ 表达的增加，可以促进葡萄糖的利用以及胰岛素的增敏[ 成峰，蒋华良，陈凯先，等.PPARγ 激动剂的研究进展. 中国药物化学杂志) ：110-118，124] 刘毅，娄少颖，何燕铭，等. 小檗碱对3T3-L1 前脂肪细胞增殖及分化相关基因PPARγ、C/EBPαmRNA 何蛋白表达的影响. 中国中西医结合杂志.2008，28(11) ：，小檗碱使PPARγ 表达量减少82％。[0170] 按BandScan5.0，默认值：[0171]编号 酒蒸黄连 生品黄连PPARγ 表达 内参表达 校正PPARγ 表达 4.22 0.25相对空白的校正PPARγ 表达 0.68 0.04相对生品的校正PPARγ 表达 17.02 1.00[0172] 经内参校正后结果表明，与生品黄连比较，酒蒸黄连使PPARγ 表达量增加17.02倍。[0173] 以上文献与试验的结果表明：与生品黄连、小檗碱不同，酒蒸黄连明显增加PPARγ 的表达，可以促进葡萄糖的利用以及胰岛素的增敏，有希望成为一类2 型糖尿病治疗药物。[0174] 该试验说明，本发明萸炙黄连可作为胰岛素增敏剂使用，胰岛素增敏剂是指噻唑烷二酮(TZDs) 衍生物，又称罗格列酮。1982 年研究其降脂作用，同时发现还有减肥降低血糖作用。其主要通过结合和活化过氧化物酶增殖物激活受体PPARγ 起作用，PPARγ 受体被激活后通过诱导脂肪生成酶和与糖代谢调节相关蛋白的表达，促进脂肪细胞和其他细胞的分化，并提高细胞对胰岛素作用的敏感性，减轻胰岛素抵抗，故被称为胰岛素增敏剂。( 张文，治疗糖尿病药物的发展历史，《中国执业药师》，2008 年2 期) 胰岛素增敏剂除了包含胰岛素增敏剂激动剂外，还包括维甲酸受体激动剂，β3 受体激动剂等( 蔡小花，等，胰岛素增敏剂类糖尿病药物研究进展，怀化医专学报，)。[0175] 上述试验结果表明，酒蒸黄连具有改善3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗，增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上具有改善胰岛素抵抗的作用；同时，酒蒸黄连在一定剂量下抑制3T3-L1 前脂肪细胞的分化，提示酒蒸黄连在增加细胞对葡萄糖摄取的同时不会引起脂肪的聚集而造成体重增加，这对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征或并发症具有一定的意义。[0176] 试验例5 酒蒸黄连提取浸膏对糖尿病整体动物模型的影响[0177] 表14 整体动物试验的设计剂量[0178][0179] 1 对小鼠正常血糖的影响[0180] (1) 试验方法[0181] 取ICR 小鼠70 只，雌雄各半，体质量18 ～ 22g。按体质量分层随机分成7 组，每组12 只，即正常对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低剂量组。各组小鼠按表14 设计剂量灌胃给药( 每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，连续7 天。末次给药后45min( 禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min 离心10min，分离血清，按试剂盒测定说明书测定小鼠空腹血糖(FBG)。[0182] (2) 试验结果[0183] 由表15 结果可知，酒蒸黄连各剂量组均对正常小鼠空腹血糖(FBG) 无明显影响(P ＞0.05)。[0184] 表15 对正常小鼠FBG 的影响[0185][0186] 2 对高浓度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影响[0187] (1) 试验方法[0188] 取ICR 小鼠80 只，雌雄各半，体质量18 ～ 22g。按体质量分层随机分成8 组，每组12 只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低剂量组。各组小鼠按表14 设计剂量灌胃给药( 每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，连续7 天。第7 天末次给药后10min( 禁食不禁水8h)，小鼠腹腔注射高浓度葡萄糖注射液2g/kg(0.1ml/ 只) 复制模型，空白组给予等容积的生理盐水。测定造模后120min 的血糖(Glu)。[0189] (2) 试验结果[0190] 由表16 可知，与空白组相比较，模型组小鼠腹腔注射高浓度葡萄糖后立即引起空腹血糖急性升高。[0191] 与模型组相比较，酒蒸黄连高、中剂量组均能明显降低高浓葡萄糖引起的小鼠血糖升高(P ＜ 0.01) ；同时，与黄连生品相比较，酒蒸黄连的降糖作用明显优于黄连生品，且作用优于盐酸小檗碱。[0192] 表16 对高浓度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影响[0193][0194] 3 对正常小鼠α- 葡萄糖苷酶的抑制作用[0195] (1) 试验方法[0196] 取ICR 小鼠80 只，雌雄各半，体质量18 ～ 22g。按体质量分层随机分成8 组，每组12 只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低剂量组。各组小鼠按表14 设计剂量灌胃给药( 每只小鼠定量0.3ml)，每日1次，连续7 天。第7 天，动物禁食8h，测定小鼠空腹血糖(0min)，测定后各组小鼠给药1 次，并立即灌服蔗糖溶液5g/kg(50g-100ml，0.3ml/ 只) 复制模型，空白组给予等容积的生理盐水。测定灌胃前(0min) 及灌胃后30，60 及120min 血糖，计算各时间点血糖的变化率，采用近似梯形的计算公式计算曲线下面积(AUC)。[0197] (2) 试验结果[0198] 表17 对正常小鼠α- 葡萄糖苷酶的影响[0199][0200] 由表17 结果可知，酒蒸黄连高剂量组和盐酸小檗碱组能明显抑制灌服蔗糖引起的血糖升高(P ＜ 0.05-0.01)，作用与阿卡波糖相似，表明药物对α- 葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，可能与抑制淀粉类碳水化合物的吸收，降低餐后血糖相关，其作用可能是酒蒸黄连治消渴的途径之一。[0201] 4 对四氧嘧啶致糖尿病小鼠糖异生的影响[0202] (1) 试验方法[0203] 取ICR 小鼠80 只，雌雄各半，体质量18 ～ 22g。按体质量分层随机分成8 组，每组10 只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低剂量组。试验前小鼠禁食18h( 建议前1 日下午3 点禁食，第2 日早晨9 点造模)。第2 日早晨小鼠尾静脉注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg 造模，注射后4h 模型小鼠灌胃50％葡萄糖，0.4ml/ 只。造模次日，除空白组和模型组外，其余各组按表14 剂量灌胃给药( 每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，连续7 天。第7 天末次给药后45min( 禁食不禁水8h)，腹腔注射L- 丙氨酸(2g/kg)，测定注射前(0min) 及注射后60 及120min 血糖，采用近似梯形的计算公式计算AUC。[0204] (2) 试验结果[0205] 由表18 可知，与空白组比较，模型组小鼠尾静脉注射四氧嘧啶72h 后，均出现多食、多饮、多尿等症状，模型组空腹血糖含量明显升高，表明四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型造模成功，模型组腹腔注射L- 丙氨酸后，血糖立即升高，模型组糖异生异常明显(P ＜ 0.01)。[0206] 与模型组比较，酒蒸黄连炮制品能明显降低小鼠腹腔注射L- 丙氨酸引起的血糖升高(P ＜ 0.01)，表明药物能减轻糖异生的异常，可能是酒蒸黄连治消渴的途径之一。[0207] 5 对四氧嘧啶致糖尿病模型小鼠的影响[0208] (1) 试验方法[0209] 取ICR 小鼠80 只，雌雄各半，体质量18 ～ 22g。按体质量分层随机分成8 组，每组10 只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低剂量组。试验前小鼠禁食18h( 建议前1 日下午3 点禁食，第2 日早晨9 点造模)。第2 日早晨小鼠尾静脉注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg 造模，注射后4h 模型小鼠灌胃50％葡萄糖，0.4ml/ 只。造模次日，除空白组和模型组外，其余各组按表14 剂量灌胃给药( 每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，连续9 天。[0210] (2) 观察指标[0211] 1) 对小鼠葡萄糖糖耐量(OGTT) 的影响[0212] 第7 天，动物禁食8h，末次给药后10 分钟，灌胃葡萄糖(3g/kg，10ml/kg)，测定灌胃前(0min) 及灌胃后30，60 及120min 血糖，计算各时间点血糖的变化率，采用近似梯形的计算公式计算曲线下面积(AUC)。[0213] 2) 对小鼠血液生化的影响[0214] 第9 天末次给药后120min( 禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min 离心10min，分离血清，按试剂盒测定说明书分别测定小鼠糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清胆固醇(TC) 和甘油三酯(TG) 的含量。[0215] 3) 对小鼠肝组织肝糖原的影响[0216] 小鼠处死后，迅速取出肝组织，称重，转移致液氮中冻存备用。按肝糖原试剂盒说明书制备肝组织匀浆，测定小鼠肝糖原的含量。[0217] (3) 试验结果[0218] 1) 对小鼠葡萄糖糖耐量(OGTT) 的影响[0219] 由表19 可知，与空白组比较，模型组小鼠尾静脉注射四氧嘧啶72h 后，均出现多食、多饮、多尿等症状，模型组小鼠糖化血红蛋白含量和空腹血糖含量明显升高，表明四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型造模成功(P ＜ 0.01)。[0220] 与模型组比较，酒蒸黄连炮制品能明显降低小鼠糖耐量的异常(P ＜ 0.01)，且随给药时间的延长表现出一定的时效性。[0221] 2) 对小鼠血液生化的影响[0222] 由表20 可知，与空白组相比较，模型组小鼠糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清胆固醇(TC) 和甘油三酯(TG) 的含量明显升高。与模型组相比较，酒蒸黄连能明显或部分降低GHb、GSP、FBG、LD、TC 和TG 的含量(P＜ 0.05-0.01)，改善糖尿病小鼠血液生化的异常。尤其酒蒸黄连能明显降低模型小鼠血清乳酸的异常，与阳性药二甲双胍增加血乳酸的作用相反，提示酒蒸黄连在降糖的同时不会引起酮中毒的副作用。[0223] 综上所述，酒蒸黄连能通过减弱四氧嘧啶对胰岛β 细胞的损伤或改善受损伤的β 细胞的功能来发挥降血糖作用。[0224] 小结：酒蒸黄连具有明显的改善糖尿病的作用，但对正常血糖无明显影响，其作用与改善胰岛素抵抗，降低糖异生，抑制α- 葡萄糖苷酶作用相关。[0225] 试验例6 酒蒸黄连提取浸膏对急性毒性试验[0226] 表21 药物的分组及剂量设计[0227][0228] ICR 小鼠180 只，雌雄各半，按体质量分层随机分为18 组，分组及给药剂量按表21设计，每只小鼠均按20ml/kg 给药( 禁食不禁水8h)，分别观察小鼠给药后14 天内出现的中毒症状，死亡情况及死亡时间、体重变化及进食情况，对死亡小鼠立即解剖，肉眼观察记录主要损害的器官及病理变化情况，并将主要脏器保存于10％甲醛溶液中。最后清点各组动物的死亡数，计算出各药物的LD50。[0229] (3) 试验结果[0230] 急性毒性试验结果表明，生品黄连的LD50 为4.4679g/kg，依据《中国药典2005 版》黄连人体临床使用推荐最大量5g/ 天( 人体质量按60kg) 计算，即0.0833g/kg·d，相当于人体用药剂量的53.6 倍；酒蒸黄连的LD50 为7.5475g/kg，相当于人体用药剂量的90.6 倍，接近于临床安全剂量( 相当于人体的100 倍)，黄连酒蒸炮制后毒性明显降低。[0231] 以上研究结果表明，生品黄连中总生物碱含量和总多糖含量高于醋炙黄连。但在药效试验中，酒蒸黄连在离体细胞模型、整体动物模型两个层次上的研究结果表明其作用优于生品黄连，说明中医临床中宜用酒蒸黄连来治疗“消渴病”( 糖尿病)，体现了“随症炮制”的中医临床用药特色，为临床选择适宜炮制品提供了实验依据。[0232][0233]
发明人：赖先荣 孟宪丽 张艺 李佳川郑海杰
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