电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究--《复旦大学》2012年博士论文
电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究
【摘要】：癌症,仍是人类主要的死亡原因。虽然恶性肿瘤的治疗技术在不断进步,但迄今为止,恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗仍然是治疗恶性肿瘤最有效的手段。从筛选的角度来讲,早期诊断癌症的最有效的方法是通过血液检查,寻找肿瘤标志。随着生物学技术的发展及研究的深入,人们发现许多肿瘤早期标志物的一个最显著的特点是其在血清中浓度非常低。传统的检测肿瘤标记物的方法,如：ELISA、放射免疫和荧光免疫法等,具有操作时间长,辐射及光污染严重,且灵敏度不够高等缺点。近年来发展起来的化学发光免疫检测和电化学发光免疫检测以及蛋白芯片技术则进一步推动了临床检测技术的发展,但它们本身还存在一定的缺点有待于进一步解决。因此,发展高灵敏的免疫分析技术对于肿瘤标志物的检测有着至关重要的意义。生物传感器的崛起使免疫测定技术有了一次大的飞跃,电化学免疫传感器是利用抗原和抗体间的高度特异性结合的原理,将免疫分析法和电化学传感技术相结合构建而成的一项新方法,因为传感器具有灵敏度高、分析速度快、操作简便、低成本、低能耗等特点,被广泛应用于临床诊断领域,并逐渐成为非常有潜力的检测技术之一。现今,基于免疫分析法结合免疫传感器的研制成为检测肿瘤标志物的研究新兴技术。大量研究用于研发操作简便易行的传感器。尽管这个领域的很多技术已经具有很多优势,但是寻求一种更加简便,灵敏度更高,选择性更好的检测方法仍然是现代医学检验和生物医学研究领域的研究热点。本论文以肝癌血清标志物—甲胎蛋白为检测对象,构建了种具有高灵敏性的电化学免疫传感器,并对其临床结果进行了初步评价,主要内容如下：
1.成功构建了一种基于单抗多抗夹心体系的高灵敏、制备简单的便携式多通量电化学免疫传感阵列并用于AFP定量检测。采用物理吸附的方法将捕获探针抗体固定在印刷电极芯片上,用更简单的方法得到了比共价耦联更好的抗体组装效率及抗体组装量。随后在靶蛋白和信号探针及多克隆抗体分别反应后,酶标二抗就可以连接,利用便携式多通道电化学仪检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流就可以实现检测。在此基础上,又引入了Poly-HRP放大技术,将标记有羊抗兔IgG的超分子多聚HRP酶复合物作为信号的载体,可有效增强免疫反应电流响应的信号,提高了传感器的检测灵敏度。实验结果对AFP检测限达到56pg/ml,同时有两个线性范围,低浓度区间为64p-1000p,高浓度区间为1n-250n。该传感器具有灵敏度高、线性范围宽等特点,实现了微量AFP的定量检测。表明该传感器在HCC的诊断及AFP检测方面具有进一步的应用前景。
2.成功构建了一种基于双单抗多抗夹心体系的灵敏度高、制备简单的便携式多通量电化学免疫传感阵列并用于血清中AFP的定量检测。不仅降低了背景,同时进一步提高了检测灵敏度。在此工作中,将捕获探针单抗通过简单的物理吸附固定在印刷电极芯片上,靶蛋白和信号探针及生物素化的单抗分别反应后,链霉亲和素(streptavidin)-HRP通过与生物素亲和连接在印刷电极表面,利用便携式多通道电化学仪检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流就可以进行检测。在此基础上,又再引入了Poly-HRP放大技术,将标记有streptavidin的超分子多聚HRP酶复合物作为信号放大的载体,可有效增强免疫反应电流响应信号,提高传感器的检测灵敏度。对AFP检测限达至34pg/ml,同时有两个线性检测范围,低浓度区间为64p-1000p,高浓度区间为1n-500n.而目前多应用的一般ELISA试剂盒检测限仅为ng/ml级别。电化学发光法的检测限也只为605pg/ml。该免疫传感器具有良好的重现性,特异性和稳定性。将该免疫传感器用于人血清中AFP的检测,并与ELISA法的检测结果比较,结果表明该免疫传感器与经典的ELISA法的测定结果具有良好相关性。表明该免疫传感器可较好的应用于人血清中的直接检测。敏感性高、特异性强、检测快速、成本低廉的特点使得该传感器在肿瘤标志物的诊断方面具有很好的应用价值及发展前景。另外该免疫传感器可以同时进行16个血清样本的检测。这种快速、灵敏、省时、高效的检测肿瘤标记物的方法为临床上肿瘤的诊断提供了一个新的平台。
【关键词】：
【学位授予单位】：复旦大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R735.7【目录】：
目录3-4本文涉及的缩略语列表4-6中文摘要6-8Abstract8-10前言10-12第一部分 基于单抗-多抗夹心及羊抗兔IgG-Poly HRP放大体系的多通道酶联电化学免疫传感器研究12-33 前言12-13 材料与方法13-17
一、实验试剂和仪器13-15
二、实验方法15-17 结果17-28 讨论28-32 小结32-33第二部分 基于双单抗夹心及Steptavidin-polyHRP放大体系的多通道酶联电化学免疫传感器构建及其应用评价33-52 前言33-34 材料与方法34-37
一、实验试剂和仪器34-35
二、实验方法35-37 结果37-48 讨论48-50 小结50-52总结与展望52-54参考文献54-57电化学生物传感器在分子检测中的作用57-82 参考文献75-82致谢82-83
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京公网安备74号朱砂的毒性研究--《北京中医药大学》2008年硕士论文
朱砂的毒性研究
【摘要】：
结合朱砂汞长期用药后在肝、肾、脑的蓄积性观察,研究朱砂的肝、肾毒性以及妊娠毒性的特点,提出朱砂安全用药剂量和用药时间建议,为朱砂的临床安全用药提供科学依据。
2.1汞含量测定
参照药典滴定法测定硫化汞(HgS)含量,用原子吸收分光光度计法测定总汞含量以及可溶性汞含量。
2.2急性毒性试验研究
采用小鼠单次灌胃给药法,按照最大灌胃给药浓度和最大给药体积,测定最大耐受量。
2.3朱砂的长期毒性研究
将220只SD大鼠随机分为对照组、朱砂0.025、0.05、0.1、0.4、0.8 g·kg~(-1)·d~(-1)(相当于药典剂量高限的1/2、1、2、8、16倍)。各剂量组均每日灌胃给药1次,连续3个月。于给药后1、2、3个月和停药1个月,测定尿液定性指标、血常规指标和肝、肾功能等血清生化指标,对肝、肾、心、脑等主要脏器进行病理学检查,观察各指标有无与朱砂毒性有关的变化,确定无明显损害作用水平(NOAEL)。
2.4汞在血、肝、肾、脑的蓄积性研究
将30只SD大鼠禁食16h,取4只作为对照组,其余动物均一次性灌胃给予朱砂0.8 g·kg~(-1)·d~(-1),于给药后0.5、1、2、4、8、16、32 h取血、肝、肾、脑,用原子吸收分光光度计法测定血及各脏器中的汞浓度。另将40只大鼠随机分为对照组、朱砂0.1、0.4、0.8 g·kg~(-1)·d~(-1),朱砂每日灌胃给药1次,连续3个月。对照组灌胃给予同体积高纯水。于末次给药前禁食16 h,末次给药后2 h取血、肝、肾、脑,测定汞浓度。
2.4朱砂对四氯化碳肝损伤小鼠的肝肾功能及组织形态学的影响
将50只小鼠随机分为对照组、CCl_4组、CCl_4+朱砂0.16 g·kg~(-1)·d~(-1)、0.08 g·kg~(-1)·d~(-1)、0.04 g·kg~(-1)·d~(-1)。朱砂各剂量组每日灌胃给药1次,连续7天。对照组和CCl_4组灌胃给予同体积蒸馏水。于第4天和第6天,除了正常对照组动物外,其余各组分别皮下注射1%CCl_4 10ml·kg-1。末次注射CCl_4后,将各组动物禁食18 h后,测定血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌苷(Cr),并进行肝、肾病理学观察。
2.5妊娠毒性研究
妊娠中晚期用药的妊娠毒性研究:将适龄雌性小鼠与雄鼠以2:1比例合笼进行交配,次日晨查出有阴栓者确定为交配成功。将交配成功的雌性小鼠随机分为对照组、朱砂0.08、0.4、4 g·kg~(-1)·d~(-1)组,每组孕鼠20只。于孕后6～19d每日灌胃给药1次。
交配前14d至孕后19d用药的妊娠毒性研究:将80只雌性小鼠随机分为对照组、朱砂0.08、0.4、4 g·kg-1·d-1组。于交配前14d开始雌鼠灌胃给予朱砂,每日1次×14d,雄鼠不给药。给药14d后,各组雌鼠开始与雄鼠交配。交配成功后,雌鼠继续给予原剂量药物,直至孕19d。
二批试验观察指标相同。均于给药期间观察母鼠的毒性反应和流产情况。于孕后20d行剖腹产,观察胎儿数目、体重和外观有无畸形,吸收胎和死胎数量。将每窝1/3胎仔用Bouin染液处理,用于进行内脏检查;每窝2/3胎仔用茜素红染液进行骨骼染色,用于骨骼检查。
3.1朱砂中的HgS、总汞、可溶性汞含量
朱砂中HgS含量为98.1%;总汞含量为87%;可溶性汞含量为21.5μg·g-1。
3.2朱砂的急性毒性
给小鼠按照最高可灌胃浓度和最大可耐受体积单次灌胃给予朱砂,剂量达到24 g·kg-1(相当于摄入可溶性汞516μg·kg-1),未见明显毒性反应,说明朱砂单次用药是安全的。这一剂量相当于按体表面积折算为人日用量的约300倍。
3.3朱砂的长期毒性和汞在肝、肾、脑中的蓄积
朱砂超过一定剂量长期用药达到1个月以上,肾脏和肝脏均可见与朱砂毒性有关的病理改变,其中,肾脏对朱砂更为敏感。0.4 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量用药1个月即可造成肾脏病变(累积摄入可溶性汞258μg·kg-1),而造成肝脏病变的剂量提高为0.8 g·kg~(-1)·d~(-1)(累积摄入可溶性汞258μg·kg-1和516μg·kg-1)。而用药时间≥2个月时,朱砂在更低的剂量水平(0.1 g·kg~(-1)·d~(-1))即可造成肝脏和肾脏病理性改变。除了肝、肾以外,其他主要脏器均未见明显的病理学改变。在多次给药后主要脏器汞蓄积研究中发现,大鼠灌胃给予朱砂0.1、0.4、0.8 g·kg~(-1)·d~(-1) 3个月,肝脏、肾脏、脑组织均有不同程度的汞蓄积。以正常对照组的各脏器汞含量为基础值,计算朱砂给药后各脏器中汞含量相当于对照组同脏器汞含量的倍数值(汞蓄积倍数),从高到低的顺序为:肾脑肝脏血液。其中朱砂高剂量0.8 g·kg~(-1)·d~(-1)组肾、脑、肝的汞蓄积倍数为71.16、27.45和1.83倍。该研究结果可以解释长期毒性试验中肾脏病变早于肝脏病变的原因。另外脑组织汞的高水平蓄积表明汞能够透过血脑屏障,这与临床上朱砂慢性中毒可出现神经系统损害是一致的。但是在大鼠长期毒性试验中脑组织未见病理性改变,其原因有待将来进一步研究。根据长期毒性研究结果认为,大鼠灌胃朱砂1个月和3个月的无明显毒性剂量(NOAEL)分别为0.1 g·kg~(-1)·d~(-1)、0.05g·kg-1·d-(1相当于累积摄入可溶性汞64.5μg·kg-1和96.76μg·kg~(-1))。按照安全系数为60计算出人服用朱砂的日允许摄入量ADI(acceptable daily intake)约为0.7 g·kg~(-1)·d~(-1),相当于60kg人日用剂量为0.05～0.1 g,此剂量认为是朱砂的安全剂量。根据大鼠肝肾毒性出现的时间,考虑到大鼠与人生命周期的差异,建议在朱砂可溶性汞含量≤21μg·g-1的条件下,朱砂的用药剂量不超过0.05～0.1 g,用药时间不超过2周。
3.4朱砂对CCl_4肝损伤小鼠的毒性
在CCl_4造成小鼠急性肝损伤的同时,联合使用朱砂0.04、0.08、0.16 g·kg~(-1)·d~(-1)(按照人与小鼠体表面积折算,相当于药典剂量的1/2、1、2倍)连续7天,与CCl_4单独组相比较,联合朱砂用药组的肝损伤病变未见加重。
3.5朱砂的妊娠毒性
朱砂0.08、0.4、4.0 g·kg~(-1)·d~(-1)(相当于临床1、5、50倍)于小鼠妊娠中晚期(孕6～19d)灌胃给药,尽管高剂量组远远高于临床剂量,但对孕鼠和胚胎均未见明显毒性。然而,当雌鼠于交配前2周开始灌胃朱砂直至孕期结束,在剂量0.08 g·kg~(-1)·d~(-1)及以上水平均造成了一定数量的胚胎骨骼畸形,随剂量增大畸形率有增高趋势。结果表明,妊娠前以及妊娠早期暴露于朱砂,更容易造成胚胎毒性,而妊娠中晚期对朱砂的敏感性较低。
-朱砂单次用药较安全。
-长期用药可造成肝、肾损害,故应限制用药剂量和用药时间。建议朱砂用法用量为:在朱砂中的可溶性汞盐含量≤21μg·g~(-1)的情况下,朱砂的用药剂量不超过0.05～0.1 g,用药时间不超过2周。
-朱砂能造成胚胎毒性,尤其是妊娠前和妊娠早期暴露对胚胎的毒性更为明显。建议除了妊娠期间禁止服用朱砂以外,孕前至少2个月内也应禁用朱砂。
-在CCl_4造成的急性肝损伤模型上,朱砂对CCl_4造成的肝损伤没有加重。
-朱砂汞在肾脏、脑、肝脏均有明显的蓄积性,尤其在肾脏和脑中蓄积性更为明显,其对神经系统的毒性作用将来值得进一步研究
-本研究仅对朱砂单味药进行了相关的毒理学研究。由于朱砂的汞化合物在复方中可能与其他药物成分形成络合物,而影响其毒性。因此,朱砂在复方中的毒性特点及其机理尚需将来进一步研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：北京中医药大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：R285.5【目录】：
中文摘要4-8
英文摘要8-13
第一部分 文献综述13-26
1. 矿物药的现状和问题13-17
2. 朱砂的毒性研究概况17-22
3. 朱砂的不良反应22-26
第二部分 实验研究26-85
1. 试验材料26-28
2. 试验方法28-33
2.1 朱砂中硫化汞(HgS)、总汞、可溶性汞含量测定28
2.2 朱砂对小鼠灌胃给药的急性毒性试验28-29
2.3 朱砂的长期毒性试验29-30
2.4 朱砂汞的体内蓄积性研究30-31
2.5 朱砂对四氯化碳肝损伤小鼠的肝肾功能及组织形态学的影响31
2.6 朱砂的妊娠毒性研究31-33
3. 计算和统计分析33-34
4. 结果34-80
4.1 朱砂中的 HgS、总汞、可溶性汞含量34
4.2 朱砂的急性毒性34-35
4.3 大鼠长期灌胃朱砂的量－时-毒关系研究35-59
4.3.1 高于药典剂量给药的量－时-毒关系研究35-56
4.3.2 药典剂量的量－时-毒关系研究56-59
4.4 朱砂在小鼠病理条件下对肝、肾功能的影响59-61
4.5 朱砂的生殖毒性研究61-74
4.5.1 朱砂于小鼠妊娠中晚期(孕6～19d)用药的生殖毒性61-65
4.5.2 朱砂于交配前14d～孕后19d 给药的胚胎毒性65-74
4.6 朱砂灌胃给药后在体内汞的分布和汞蓄积研究74-80
4.6.1 朱砂单次用药后血液和主要脏器汞浓度74-78
4.6.2 朱砂长期给药后汞在大鼠体内的蓄积性研究78-80
5 小结与讨论80-84
6 结论84-85
参考文献85-88
个人简历88-90
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