求大神帮忙ps一下判断一下

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-02-24 16:14 标签： 请帮忙催一下 英文
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标题: 大家帮忙看一下引物(引物,序列,酶切位点)
摘要: [大家帮忙看一下引物(引物,序列,酶切位点)] 大家好！下面是我要RT－PCR的序列，我要的是54－－1070，1 agccacagta ggaagtgggg cagacagaac caggagcctg ggaaggaagc accatgccaa
61 cggggacagt agctagagcc tgggtactgg ttcttgctct gtggggagcc gtagctggtg
121 gtcagaacat cacag 关键词:[引物 序列 酶切位点]……
大家好！下面是我要RT－PCR的序列，我要的是54－－1070，1 agccacagta ggaagtgggg cagacagaac caggagcctg ggaaggaagc accatgccaa
61 cggggacagt agctagagcc tgggtactgg ttcttgctct gtggggagcc gtagctggtg
121 gtcagaacat cacagcccgg atcggagagc cacttatgct gagctgtaag ggggccccta
181 agaagccaac ccagaagcta gaatggaaac tgaacacagg aaggactgaa gcttggaagg
241 tcctctctcc ccagggagac ccctgggaca gtgtggctcg aatcctcccc aatggttcac
301 tcctccttcc agctatcgga attgtcgatg aggggacttt ccggtgtcgg gcaactaaca
361 ggcttgggaa ggaggtcaag tccaactacc gagtccgagt ctaccagatt cctgggaagc
421 cggaaattgt gaatcctgcc tctgaactca cagccaatgt ccctaataag gtggggacgt
481 gtgtgtctga ggggagctac cctgcaggga cccttagctg gcacttggat gggaaacctc
541 tgattcctga tggcaaaggg acagttgtga aggaggagac caggaggcac cctgagacgg
601 gactcttcac gcttcggtca gagctcacag tgaccccagc ccaaggaggg accactccta
661 cctattcctg cagcttcagt ctgggccttc ctcggcgcag acccctgaac acagccccca
721 tccagccccg agtcagggag cccctgcctc cagagggcat tcagctgttg gttgagcctg
781 aaggtggaac agtcgctcct ggtgggaccg tgaccctgac ctgtgccatc tctgcccagc
841 ctccccctca aatccactgg ataaaagatg gcacacccct gccccttgcc cccagccctg
901 tgctgctcct ccctgaggta gggcatgagg atgagggcat ctacagctgc gtggccaccc
961 accctagcca tggacctcag gaaagccctc ctgtcaacat cagggtcaca gaaaccggtg
1021 atgaaggaca agctgcaggc tctgtggatg ggtctgggct gggaacgcta gccctggcct
1081 tagggatcct gggaggcctg ggaatagccg ctctgctcat tggggccatc ctgtggcgaa
1141 aacgacaacc cagactcgag gagaggaagg ccccagaaag ccaggaggac gaggaggaac
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1261 aagagcgccc aggcaaaccc tgtctccttc agcttccgac ctcagctgtg ctggctccag
1321 acgagctccc ccactctacg atcccaattc aacctcgagc cactttcttc tccaaccaga
1381 gcccacatga tccatgctga gtaaacacct gacacatgtt用的引物是国外一篇文献发表过的，我准备在两个引物上分别加一个酶切位点，为SalI和CalI，引物如下：5－TATGTCGACATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3，5－TTTAGCTAGCGTACCCAGCCCAGACTC－3；其中5－CATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3和5-TAGCGTACCCAGCCCAGACTC-3是原来国外文献用过的。大家来看一下到底能不能行的通。
回复几个问题：1、你所提供的是大鼠Ager mRNA序列（NM_053336），其CDS为54-1262。你要扩增的是54-1070，既不象是要扩整个CDS，以用于构建表达载体；也不象是用于检测表达，因为检测表达的时候，上游引物不必从ATG开始，而且也不必扩这么长。只希望表达部分蛋白？2、用国外文献的引物进行blast，结果只能和小鼠Ager的mRNA序列和基因组序列匹配，说明文献上的引物是用于扩增小鼠Ager基因的，根本不能用于大鼠。3、你加酶切位点后的引物是：　上游引物：5－TATGTCGACATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3　下游引物：5－TTTAGCTAGCGTACCCAGCCCAGACTC－3注意黑体部分，上游引物中根本就没有Sal I酶切位点（GTCGAC）；如果国外文献的上游引物是5－ATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3（我想也应该是这样的），那倒是有Sal I酶切位点。有Cal I这个酶切位点吗？如果国外文献的下游引物是5-GTACCCAGCCCAGACTC-3，那倒有个酶切位点Nhe I（GCTAGC）。如果是要扩增大鼠Ager mRNA序列，建议根据所需扩增的片段重新设计引物。如果是要扩增小鼠Ager mRNA序列、且只需扩增从ATG开始的部分CDS，则可用引物设计软件分析后决定是否采用国外文献的引物或根据需要自己设计引物。回复请问二楼，即使文献的上游引物是5－CATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3，楼主在其设计的上游引物中的Sal I酶切位点（GTCGAC）为什么不存在，虽然C不在其增加的碱基中，但该酶切位点恰是G与T之间（G/TCGAC），对于互补链刚好是T与G之间(CAGCT/G），这样对于插入载体的双链转录时模板链是完整的。回复请问二楼，即使文献的上游引物是5－CATGCCAGCGGGGACAGCAGCT－3，楼主在其设计的上游引物中的Sal I酶切位点（GTCGAC）为什么不存在，虽然C不在其增加的碱基中，但该酶切位点恰是G与T之间（G/TCGAC），对于互补链刚好是T与G之间(CAGCT/G），这样对于插入载体的双链转录时模板链是完整的。不好意思！既要分析楼主的基因序列又要分析国外文献提供的引物序列，一时头脑短路了。正如你所说，楼主的上游引物中确实有Sal I酶切位点。不过，楼主的引物还有个问题，只需大概看一下就知道，引物的特异性部分的GC含量可能太高了，相应地引物的Tm值也会比较高。回复谢谢大家！1.我的目的是表达RAGE基因的一部分，非全部的编码区。2.国外那个文献的题目是：Recombinant Advanced Glycation End Product ReceptorPharmacokinetics in Normal and Diabetic Rats
我想应该是大鼠的吧？3.原来那个引物的GC％也有61.9％请赐教！回复AgerOfficial Symbol: Ager and Name: advanced glycosylation end product-specific receptor [Rattus norvegicus] Other Aliases: RGD:69258, RAGE Chromosome: 20; Location: 20p12 GeneID: 81722看看Primer 5.0对国外文献中的引物序列的分析结果吧。上游引物（图1）有2个错配，有1个错配靠近3"末端，GC含量高，Tm值高达73度，其他方面是“全国江山一片红”。下游引物（图2）也有2个错配，其中1个错配就在3"端倒数第二个碱基，GC含量也较高，False Priming比较严重。回复这也正是我疑惑的地方！看来国外的文献也不可尽信啊！
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