大菱鲆主要消化酶—蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的研究--《中国海洋大学》2004年博士论文
大菱鲆主要消化酶—蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的研究
【摘要】：本论文从消化酶的角度，研究了大菱鲆体内主要消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的分布和活性，鱼龄、温度、盐度等因素对大菱鲆消化酶活性的影响，并对其主要蛋白酶进行了纯化和理化性质的研究，分析了大菱鲆粗酶液对饲料中常用蛋白质饲料原料的体外消化率，对各种蛋白质饲料原料进行营养评价，最后探讨了植物蛋白替代鱼粉的可行性及外源酶制剂应用的情况。主要研究结论如下：
(1)大菱鲆对蛋白质的消化主要在胃和前肠中进行，对淀粉的消化则主要依靠前肠和幽门盲囊，而脂肪消化主要集中在肠中。
不同消化部位如胃、幽门盲囊、前肠、中肠、后肠的蛋白酶最适作用温度和pH依次为：40℃、pH2.0，40℃、pH8.0，60℃、pH8.0，40℃、pH8.5，60℃、pH8.0；脂肪酶最适温度和pH依次为：40℃、pH6.5，40℃、pH8.0，40℃、pH7.5，50℃、pH7.0，40℃、pH8.0；淀粉酶最适温度和pH依次为：40℃、pH7.5，40℃、pH6.5，40℃、pH7.0，40℃、pH7.5，40℃、pH7.5。另外，各酶均有低温下最适pH升高，及作用时间延长时最适温度降低的特性，适应生理条件下的消化。
(2)大菱鲆生长发育过程中，消化生理和各消化酶分泌机能逐步完善。蛋白酶和脂肪酶活力在整个发育阶段持续增高，淀粉酶活力在幼鱼期呈增大趋势，180天鱼龄后开始下降。整个生长过程中蛋白酶活力处于绝对优势。180天鱼龄是大菱鲆生长发育的一个转折点，可作为大菱鲆配合饲料分阶段研制的一个参考分界点。
(3)环境水温对大菱鲆消化生理有明显的影响作用：随水体温度的提高，大菱鲆消化器官比重呈明显的下降趋势；大菱鲆各消化器官中分泌的酶蛋白量随水体温度的提高持续下降，肠中酶蛋白分泌量降幅最大；各消化器官中总酶活力随水温的升高呈先上升后下降的趋势，其中蛋白酶受影响最大。
(4)水体盐度对大菱鲆消化酶活性影响显著。在0M-0.5M的盐度变化范围内，幽门盲囊蛋白酶、肠蛋白酶随盐度增高被激活，胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶均先被激活后被抑制。脂肪酶受盐度影响最大，蛋白酶最小；消化器官中幽门盲囊受盐度影响最显著，胃和肠次之。在0.2M-0.3M的盐度范围内，各消化部位的
重要消化酶均处于比较活跃的状态。
(5)对大菱坪主要蛋白酶进行了分离纯化，并研究了其理化性质:
采用硫酸钱分级沉淀、DEAE一S即har0Se F.F.阴离子交换层析、Sephadex
G一100凝胶过滤层析、Sephacry1S一200凝胶过滤层析等纯化技术得到三种蛋白
酶电泳纯样品，分别为胃蛋白酶、幽门盲囊蛋白酶、肠蛋白酶I。经电泳检测分
子量依次为39900Dal、66009Dal、86776Dal。纯酶最适反应pH依次为2.0、9.0、
8.5，最适反应温度依次为40℃、30一40℃、50℃;PH稳定范围依次为pHI.0一9.0、
pH6.0一10.0、pH7.0一10.5，40oC以下酶活性较稳定;Mn，‘和Cu，‘激活大菱虾胃
蛋白酶，Fe3+、丝氨酸蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、胃酶抑制剂、琉基蛋白
酶抑制剂显著抑制大菱鲜胃蛋白酶活性;Mn2+、M扩激活幽门盲囊蛋白酶，Cuz+、
Zn2+、琉基蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂抑制其活性;Mnz+激活肠蛋白酶I，Cuz+、
Zn2+、Ag‘、Fe3+、琉基蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂抑制大菱娜肠蛋白酶I活
性。双倒数作图法得大菱坪胃蛋白酶Iha为2.559/L、肠蛋白酶I的Km为2.929/L。
(6)大菱坪不同消化器官粗酶液对饲料原料干物质和蛋白质的体外消化能
力均表明胃、前肠、幽门盲囊为营养物质主要消化部位。十种饲料原料的干物质
体外消化率依次为进口秘鲁鱼粉国产鱼粉虾粉肉粉饲料酵母豆粕
花生粕棉粕麦鼓次粉，蛋白质体外消化率依次为进口秘鲁鱼粉虾粉国
产鱼粉肉粉饲料酵母豆粕花生粕次粉棉粕麦数，动物性饲料原料
的干物质、蛋白质体外消化率明显高于植物性饲料的相应体外消化率。氨基酸指
数EAAI表明，除饲料酵母为良好蛋白源外，其余均为优质蛋白源。
综合分析表明十种饲料原料中动物性饲料以虾粉、肉粉较好，植物性饲料中
则以豆粕最佳。
(7)通过不同豆粕含量及外源酶制剂的六个实验组在18℃下50天的饲喂
实验，结果表明:无外源消化酶饲料配方下的大菱虾对蛋白质和碳水化合物的表
观消化率随饲料中豆粕含量的增加呈下降的趋势。20%豆粕替代组和全鱼粉组实
验鱼的生长状态明显好于40%豆粕替代组及全豆粕组。各实验组大菱虾消化器官
比重随豆粕添加量的增多而增大，以比肝重变化最为显著。不同饲料配方组大菱
醉蛋白酶、淀粉酶活力随豆粕含量的增多而升高，脂肪酶无明显变化。添加外源
酶制剂组相比于未添加组生长状态及消化生理有明显改善。
实验结果表明，饲料中以豆粕替代鱼粉量功%对大菱虾生长无负面影响，在
添加外源酶制剂的情况下豆粕替代量可增加到100k仍能保证大菱坪的正常生长。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国海洋大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2004【分类号】：S917【目录】：
中文摘要7-10
AbstraCt10-13
第一节 鱼类消化酶研究进展13-21
第二节 大菱鲆及其养殖、研究发展情况21-24
第三节 大菱鲆营养需求与饲料研究进展24-41
实验部分41-119
1 大菱鲆蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的分布及活性研究41-59
1.1 实验材料与方法41-43
1.1.1 实验材料41
1.1.2 实验仪器41-42
1.1.3 实验方法42-43
1.2 结果与讨论43-57
1.2.1 大菱鲆消化道指数43-44
1.2.2 大菱鲆各消化部位自然pH44
1.2.3 大菱鲆蛋白酶分布及活力研究44-49
1.2.4 大菱鲆淀粉酶分布和活性研究49-53
1.2.5 大菱鲆脂肪酶分布和活性研究53-57
1.3 小结57-59
2 不同生长阶段大菱鲆体内消化酶的变化59-64
2.1 实验材料与方法59
2.1.1 实验材料59
2.1.2 实验方法59
2.2 实验结果与讨论59-63
2.2.1 不同生长阶段大菱鲆体重、体长及消化道指数59-60
2.2.2 不同生长阶段大菱鲆各消化器官蛋白酶活力的变化60-61
2.2.3 不同生长阶段大菱鲆各消化器官淀粉酶活力的变化61-62
2.2.4 不同生长阶段大菱鲆各消化器官脂肪酶活力的变化62-63
2.3 小结63-64
3 水体温度对大菱鲆消化酶的影响64-69
3.1 实验材料与方法64
3.1.1 实验鱼的饲养64
3.1.2 样品的制备及分析64
3.2 实验结果与讨论64-67
3.2.1 不同温度条件下大菱鲆各消化器官比重的变化64-65
3.2.2 不同水体温度下大菱鲆各消化器官的酶蛋白含量65-66
3.2.3 不同水体温度下大菱鲆各酶活力的变化66-67
3.3 小结67-69
4 盐度对大菱鲆重要消化酶活力的影响69-74
4.1 实验材料与方法69
4.2 实验结果与讨论69-73
4.2.1 盐度变化对大菱鲆各部位蛋白酶活力的影响69-70
4.2.2 盐度对大菱鲆各部位淀粉酶活力的影响70-71
4.2.3 盐度对大菱鲆各部位脂肪酶活性的影响71-73
4.3 小结73-74
5 大菱鲆蛋白酶纯化及理化性质的研究74-102
5.1 实验材料与方法74-79
5.1.1 实验材料74
5.1.2 实验仪器74-75
5.1.3 实验方法75-79
5.2 结果与讨论79-99
5.2.1 大菱鲆胃蛋白酶的纯化及性质研究79-87
5.2.2 大菱鲆幽门盲囊蛋白酶的纯化及性质研究87-93
5.2.3 大菱鲆肠蛋白酶的纯化及性质研究93-99
5.3 小结99-102
6 大菱鲆消化器官对十种蛋白质饲料的离体消化率及蛋白质营养价值评价的研究102-110
6.1 实验材料和方法102-104
6.1.1 实验用鱼102
6.1.2 饲料原料102
6.1.3 粗酶液提取102-103
6.1.4 离体消化率的测定103
6.1.5 样品分析103-104
6.1.6 离体消化率的计算104
6.1.7 必需氨基酸指数EAAI的计算和饲料评价标准104
6.2 结果与分析104-108
6.2.1 大菱鲆消化器官对饲料原料干物质的离体消化率104-105
6.2.2 大菱鲆消化器官对饲料原料蛋白质的离体消化率105-106
6.2.3 十种饲料原料的营养评价106-108
6.3 小结108-110
7 大菱鲆饲料中植物蛋白替代鱼粉的可行性研究及饲用微生物酶制剂在大菱鲆饲料中的应用110-118
7.1 实验材料与方法110-112
7.1.1 实验用鱼及饲料110-111
7.1.2 实验条件和方法111
7.1.3 样品生化分析111-112
7.1.4 实验参数计算112
7.2 实验结果112-116
7.2.1 大菱鲆对六种配方饲料蛋白质和碳水化合物的消化率112-113
7.2.2 六种配方饲料饲喂大菱鲆生长状况和饲料利用效率113-114
7.2.3 各实验组大菱鲆消化道指数114
7.2.4 各实验组大菱鲆消化酶活性114-116
7.3 小结116-118
8 结语118-119
致谢119-120
欢迎：、、)
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金勇;[D];浙江大学;2006年
石永芝;[D];山东大学;2005年
嵇冶;[D];吉林大学;2006年
唐玲;[D];华中科技大学;2008年
冯雷刚;[D];天津科技大学;2004年
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