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胰酶消化后，用含血清的培养基终止消化，吹打下来细胞后离心，弃上清再用培养基重悬。我们正常是加4ml左右，就是两吸管培养基终止消化，不过要是为了省培养基的话，可以再少加点，这个有一些培养基就够终止消化的，加的多一点主要是为了好吹打，以及吹打的时候不容易起泡，量太少，一吹就起泡。楼主可以根据自己的情况随意调整。还有一个方法比较省培养基，我们实验室他们都这么做，消化到时间后直接弃胰酶，然后就加培养基吹打细胞，然后分瓶了。这个就是要求要快一点，胰酶消化的时间要再摸索一下，因为弃胰酶再加培养基这个过程也是需要一点时间的，如果开始消化的时间长的话再操作就容易消化过了一点点，摸索几次就好了。这样也省去离心的麻烦。 关于丁香园请问如何去除血浆中的纤维蛋白原使其成为血清?血浆是抗凝血离心后的产物血清是血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体．那么,请问如何去除血浆中的纤维蛋白原呢?（即：如何从血浆中分离出血清.）_百度作业帮 请问如何去除血浆中的纤维蛋白原使其成为血清?血浆是抗凝血离心后的产物血清是血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体．那么,请问如何去除血浆中的纤维蛋白原呢?（即：如何从血浆中分离出血清.） 血浆是抗凝血离心后的产物血清是血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体．那么,请问如何去除血浆中的纤维蛋白原呢?（即：如何从血浆中分离出血清.） 可以加钙制剂然后静置48小时再脱纤即可如果是为了去纤维蛋白原建议硫酸铵盐析 静置，待其分层即可 离心再静置 您可能关注的推广第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法(血浆脂蛋白,离心分离,血清,密度) 11:00:12&&&来源：[]&&&评论：&& [第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法(血浆脂蛋白,离心分离,血清,密度)]《动脉粥样硬化(atherosclerosis)》 > 第十六章　血浆脂蛋白的分离纯化及定量第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法一、超速离心法简介 为了研究，常需要得到脂蛋白纯品并进一步分离纯化载脂蛋白，迄至目前为止，采用密度梯度超速离心分离纯化各种脂蛋白仍是一种很好的方法。超速离心…… [关键词:血浆脂蛋白 离心分离 血清 密度 脂蛋白 血浆 超离心]… 《动脉粥样硬化(atherosclerosis)》 > 第十六章　血浆脂蛋白的分离纯化及定量第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法 一、超速离心法简介 为了研究，常需要得到脂蛋白纯品并进一步分离纯化载脂蛋白，迄至目前为止，采用密度梯度超速离心分离纯化各种脂蛋白仍是一种很好的方法。超速离心法可分为制备型和分析型两种，根据其所用介质密度不同，可以分为等密度离心，密度梯度离心等。根据所用转头的类型不同可以分为角头、甩平头、垂直头和区带头离心法。脂蛋白分离中，采用密度梯度超速离心法较多。离心作用是根据稳定角速度下做圆周运动的任何物质都受到一个外向的离心力F，这种力的大小取决于角速度（以弧度ω表示）和旋转半径r（以cm计算）。F=ω2rF常用地球引力表示，称为相对离心力（RCF）或者常用“数字×g”来表示。RCF=ω2r/980在使用该公式时，这些关系需用“每min转数（r/min）”表示，这是表示离心机转动速度的普通方式。由于（r/min）的数值可转换成弧度，利用ω=π（r/min）/30公式代入上式，得到下述换算式：RCF-（πr/min）2×r/302/980=（1.119×10-5）（r/min）2·r对于在离心转头中旋转的样品，估计其所受到的相对离心力需要考虑样品到旋转中心的固定距离（r）。由于转头的形状设计，离心管中从管顶主管底各点旋转中心的距离是不同的。例如在固定的角式转头中，作用于离心管顶部和底部的离心力的差别接近一倍。为了计算相对离心力的数值可用平均相对离心力（RCF平均）来表示，即同一离心转头顶部和底部所受离心力的平均值。因此，最重要的将是确定半径（r）的数值。形成密度梯度操作，可采用两种方法，一是利用自动形成器，此装置是在一根管道上装有两个容器，各以T型管与此管道相通，两容器分别装入轻液和重液，按比例进入混合器，并用蠕动泵将溶液注入超离心管内，形成不同密度液，加入到超离心管中，使其离心管中液体成密度梯度离心分布。二是采用手工操作，先配成不同密度溶液，人工一层层铺盖到超离心管内，使超离心管中成为不同密度梯度的溶夜。超速离心后样品的收集可根据不同的实验条件采用下述几种方法。（1）切割法：在固定的刀架上，将已离心好的样品管放在所要求的高度（按管内分离区带确定）用刀切断离心管，取出样品。（2）虹吸法：用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐层按区带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区带一管，不能混用。（3）穿剌法：用针头在超速离心管底部穿一小孔，让液体从底部流出，并按区带分部收集。分管收集到的各区带样品，可采用折光仪，测出折光系数，从表中查出相应溶液的水合密度，从而确认各组份的分布样品的水合密度。 二、Hatch-Lee法（同时分离血浆脂蛋白方法） 1．0.5mol/LEDTA（pH8.0）:186g EDTA-Na2加入去离水950ml，用NaOH调准pH值，再加水到1L。溶液①（d=1.006）:NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液，加去离子水1l，EDTA可抑制脂蛋白中脂质的氧化。溶液②（d=1.182）:NaBr24.98g溶于溶液①100ml中。溶液③（d=1.478）:NaBr78.32溶于溶液②100ml中。0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA（pH8.0），再加双蒸水到1L。d=1.019液：1.851gKBr溶于溶液①100ml中。d=1.063液：8.343gKBr溶于溶液①100ml中。d=1.215液：33.496gKBr溶于溶液①100ml中。以上溶液的密度，必要时用折射仪检测。2．操作取10mlEDTA Na2抗凝（1mg/ml）采血，离心（3000r/min）10min，分离得血浆。取血浆4ml加入容量10ml的超离心管中的底层，上面铺盖2ml溶液①(d=1.006)液，20kr/min(26kXg)离心30min(4℃)，不用制动器让其旋转减速，以防飘浮物与下浮层相混；取出下层4ml混合血浆待用；超离心管中残留2ml，再取溶液①2ml沿管壁加入，仔细混匀分散脂蛋白，又加溶液①2ml铺在表面，20kr/min，4℃，离心1h，取出上层液直至变界处，此即CM组份。再将第一次离心所得的下层4ml混合血浆取出，其上铺2ml溶液①，40kr/min（100k×g），18℃离心17h，取上层1ml液，此即VLDL组份。再取出1ml至交界处，弃去，将管内剩余的4ml混合液移入另一超离心管内，取2ml溶液②（d=1.182）洗出离心管中残余的脂蛋白，加入到装4ml混合液超离心管内，混匀，40kr/min，18℃，离心21h，取出上层（d=1.062）1ml混合液，此即LDL组份。继续将中间层1ml除去，残存的4ml转入到另一超离心管内，用d=1.478（溶液③）2ml洗涤原管，尔后移入4ml残存液管内，仔细混匀，40kr/min，18℃，离心41h，上层（d=1.20）部分吸出，即HDL组份。下层为VHDL（very high density Lipoprotein）与其他血浆脂蛋白。LDL与HDL分别对0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析，4℃保存。 三、从血浆直接分离LDL 用EDTA抗凝血，离心得血浆，可采用大容量（300ml）超离管进行。血浆容量依次要加定量的KBr（Xg），可按下述公式计算：V为血浆容量（ml）数，d1、d2分别为该配制的最初的两种溶液密度，υ为调节密度用的KBr的目的水密度的偏比容。血浆d=1.006。首先调节溶液密度到d2=1.019，离心除去。VLDL，d2=1.019的υ为0.2922，即1ml血浆中应当加KBr0.01851g，溶解后，每管注入约16ml将d=1.019溶液8ml（0.5体积）覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，再除去黄色层以上的上层界面液，测量下层黄色层液ml数，再按上式计算添加0.0644g/mlKBr，以成d=1.063的溶液（υ=0.2982）同样每管（16ml）加8ml的d=1.063溶液覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，取上层黄色区带，并对0.15mol/lNaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0)充分透析，该黄色脂蛋白即LDL，可用作LDL受体的配体。添加KBr量计算式中的偏比溶（υ），d=1.019、1.063、1.125、1.210、1.215的值相应为0.2、0.0、0.3093。 四、硫酸右旋糖苷（DS）沉淀血清脂蛋白法 1．试剂1%DS、10%DS、2mol/L CaCl2、1mol/L K2C2O4、12%NaCl、0.2mol/l Tris-HCl、0.9%NaCl、0.01mol/L EDTA(pH7.4)2.操作混合血清在3000r/min下，离心30min，除去血细胞及其他固体物质，再以2000r/min离心30min（4℃），以除去血清中的CM。取一定体积的上述血清，加1%DS，使血清中的DS浓度为0.05%，加2mol/lCaCl2，使血清中CaCl2的终浓度为0.1mol/L，搅拌后放4℃冰箱过夜，于第二天离心（3750r/min）30min，将离心后的沉淀物溶解在12%NaCl中，而后加0.2mol/l Tris-HCl缓冲液250ml（pH7.4），离心10min,弃去上清，将所得沉淀用0.02mol/l Tris-HCl再洗一次，此步骤要重复3次。将最后得到的VLDL和LDL溶解在7.5～15ml的1mol/L草酸钾中（4℃），3750r/min离心30分钟，去掉沉淀，然后将此溶液在1%NaCl，1%BaCl2溶液中透析48h（4℃）。将透析过的溶液放于中去掉沉淀。把上清液再放入0.02mol/l Tris-HCl缓冲液透析72h，离心，其上清则含有较纯的VLDL和LDL 五、无脂蛋白血清的制备 1．用途：无脂蛋白血清（lipoprotein deficient serum,LPDS）主要用于LDL受体活性测定的。2．操作：常规采血，室温放置1～2h，以3kr/min离心10min，分离得到。向中按每1ml加0.33496g KBr，使其血清密度为d=1.215，或者按等体积加d=1.215的KBr液，按前述两方法铺在血清上面，按40kr/min(100k×g)速度，离心40h。离心完毕，将淡黄色上层脂蛋白与无色的中间层除去，下层液上再铺d=1.215溶液，重复上述离心操作。将下层液，对0.15mol/l NaCl,0.3mmol/L (pH8.0) 溶液透析，用过滤器除菌，尔后分成小包装贮存在-20℃备用。六、其他方法除上述介绍的常用方法外，还有凝胶过滤和高压液相层析法分离血浆脂蛋白的方法，有关参考书很多，在此不一一介绍。 将本文分享到下面的网站： 相关热词搜索： [第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法(血浆脂蛋白,离心分离,血清,密度)]延伸阅读： 频道总排行 频道本月排行中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20?9131??临床论著?不同血清微环境体外培养的 CIK 细胞中 CD4＋/CD8＋和 Th1/Th2 的动态改变
唐慧 董虹 高建梅 王金丽 王林坪 李丽 左荣霞 华映坤 严新民【摘要】 目的＋ ＋观察不同血清微环境中培养的细胞因子诱导的杀伤细胞 （cytokine induced killer， CIK） 将 3 例不同患者来源的外周血单个核细胞（peripheral bloodCD4 /CD8 和Th1/Th2 的动态改变，探讨最有利于恢复肿瘤患者CD4＋/CD8＋和Th1/Th2 平衡的CIK细胞培养 血清微环境和最适CIK细胞回输时机。方法 mononuclear cell，PBMC）用含 10%肿瘤患者自体抗凝血浆培养基（ZT）在体外诱导培养成CIK细胞，并设 含 10%胎牛血清培养基（FBS）和无血清培养基（GT）作为对照。连续记录CIK细胞在三组血清微环境中 的增殖情况，并分别收集培养第 0、7、14 和 21 天的CIK细胞和细胞培养上清。MTT法检测CIK细胞毒活性。 流式细胞术检测CIK细胞CD3＋、CD4＋和CD8＋免疫表型。ELISA法检测细胞培养上清中Th1 和Th2 优势细胞 因子IFN-γ和IL-13 浓度，二者浓度比即为Th1/Th2 比值。结果 （1）CIK细胞增殖情况：三个血清微环境 组间无显著差异。（2）CIK细胞肿瘤杀伤活性：培养至第 7、14 和 21 天的CIK细胞对K562 的杀伤活性在不 同血清微环境组依次为： ZT： （79.95±12.23） %、 （93.86±2.38） %、 （66.34±7.54） %， FBS： （71.02±14.79） %、 （83.72±5.63）%、（58.37±7.57）%，GT：（40.92±4.66）%、（52.61±8.05）%、（41.43±5.25）%，CIK细 胞肿瘤杀伤活性在同一血清组不同时间点间比较结果为ZT和FBS组在第 14 天均显著高于第 7 天和第 21 天 （P＜0.01）；GT组在不同时间点间无显著差异。在不同血清微环境组相同时间点间比较的结果发现在第 7、 14 和 21 天三个时间点，ZT和FBS组均显著高于GT组（P＜0.01）。 （3）CIK细胞中CD4＋/CD8＋的动态改变： 同一血清组不同时间点间的比较结果显示在第 0 天，肿瘤患者来源的PMBC CD4＋/CD8＋倒置，ZT组CD4＋ /CD8＋在第 7 天升高至 2.25±1.67，显著高于第 0 天（P＜0.05），但随即在第 14 天和第 21 天又恢复倒置现 象；FBS组CD4＋/CD8＋一直维持倒置现象，并在第 21 天降低至 0.04±0.55，极显著低于第 0 天（P＜0.01）； GT组CD4＋/CD8＋亦一直维持倒置现象，且在 4 个时间点间无显著差异。在相同的时间点不同血清微环境组 间比较的结果显示在第 7 天，CD4＋/CD8＋比例在ZT组显著高于FBS和GT组（P＜0.05）；在第 14 天和第 21 天，三组间无显著差异。（4）CIK细胞中Th1/Th2 的动态改变：CIK细胞Th1/Th2 在相同血清组不同时间点 间比较发现ZT和GT组在 4 个时间点一直维持Th1/Th2 倒置，且 4 个时间点间无显著差异；FBS组Th1/Th2 在第 7 天和第 14 天均极显著高于第 0 天（P＜0.01），Th1/Th2 倒置现象被纠正，但在第 21 天又再次出现 Th1/Th2 倒置。 在不同血清微环境组相同时间点间比较发现在第 7 天和第 14 天， FBS组Th1/Th2 极显著高于 ZT和GT组（P＜0.01）。结论 不同血清微环境培养的CIK细胞CD4＋/CD8＋和Th1/Th2 均呈动态改变趋势。 提示在临床进行CIK细胞治疗时，应综合考虑患者的自身免疫状态、所采用的细胞培养血清微环境及CIK细 胞培养过程中CD4＋/CD8＋和Th1/Th2 的动态改变，制定个性化的治疗方案。 【关键词】 CIK 细胞； 血清微环境； 干扰素Ⅱ型； 白细胞介素 13； CD4-CD8 比值； Th1/Th2 Dynamic changes of CD4＋/CD8＋ and Th1/Th2 in CIK cells cultured in different serum microenvironments in vitro TANG Hui, DONG Hong, GAO Jian-mei, WANG Jin-li, WANG Lin-ping, LI Li, ZUO Rong-xia, HUA Ying-kun, YAN Xin-min. Institute of Basic Medical Research, The First Peoples’ Hospital of Yunnan Province (Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology), Medical Engineering Technology Research Center for Tumor Transformation of Yunnan Province, Kunming 650032, China Corresponding author: YAN Xin-min, Email: DOI:10.3877/cma.j.issn.13.20.029 基金项目：云南省肿瘤转化医学工程技术研究中心项目（） ；云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目 （） 作者单位：650032 昆明，云南省第一人民医院（昆明理工大学附属医院）临床基础医学研究所 云南省肿瘤转化医学工程 技术研究中心 通讯作者：严新民，Email: ?9132?中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20【Abstract】ObjectiveDynamic changes of CD4＋/CD8＋ and Th1/Th2 in cytokine induced killer (CIK)cells cultured in vitro in different serum microenvironments were observed, both the optimal cell culture serum microenvironment and the optimum transfusion timepoint of CIK cells will beneficial to reconstruct the balance of CD4＋/CD8＋ and Th1/Th2 in tumor patients were discussed. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from 3 tumor patients were induced into CIK cells in vitro, CIK cells were cultured in medium containing 10% autologous blood plasma derived from tumor patients (ZT), medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and serum free medium (GT) were set as control groups. Proliferation of CIK cells cultured in 3 different serum microenvironments were recorded continuously, CIK cells and cell culture supernatants were collected respectively on D0, D7, D14 and D21. Cytotoxicity of CIK cells were determined by MTT, immune phenotypes of CD3＋, CD4＋ and CD8＋ were detected by flow cytometry. Protein levles of IFN-γ and IL-13 in cell culture supernatants were determined by ELISA, Th1/Th2 was calculated as the concentration ratio of IFN-γ and IL-13. Results (1) CIK cells proliferation: there were no significant differences in 3 serum microenvironment groups. (2) Cytotoxicity of CIK cells: K562 killing activity of CIK cells on D7, D14 and D21 in 3 serum microenvironments were: ZT: (79.95±12.23)%, (93.86±2.38)% and (66.34±7.54)%, FBS: (71.02±14.79)%, (83.72±5.63)% and (58.37±7.57)%, GT: (40.92±4.66)%, (52.61±8.05)% and (41.43±5.25)% respectively. Cytotoxicity of CIK cells were significantly higher on D14 compared to D7 and D21 both in ZT and FBS groups (P＜0.01). While cytotoxicity of CIK cells had significant differences when compared between 3 different serum microenvironments at the same timepoints (including D7, D14 and D21), ZT and FBS group were significantly higher than GT (P＜0.01). (3) Dynamic changes of CD4＋/CD8＋ in cultured CIK cells: Comparison results between different timepoints in the same serogroup displayed CD4＋/CD8＋ inversion on D0, then increased to 2.25±1.67 on D7 in ZT group, which was significantly higher than D0 (P＜0.05), while recovered to CD4＋/CD8＋ inversion status on D14 and D21; In FBS group, CD4＋/CD8＋ maintain inversion status from D0 to D14, then decreased to 0.04±0.55 on D21, which was significantly lower than D0 (P＜0.01); In GT group, CD4＋/CD8＋ also maintain inversion status from D0 to D21, and there was no significant difference between four timepoints. Comparison results between different serum microenvironments at same timepoint showed that CD4＋/CD8＋ in ZT group was significantly higher than both FBS and GT group on D7 (P＜0.05); While there was no significant difference between 3 serogroups both on D14 and D21. (4) Dynamic changes of Th1/Th2 in cultured CIK cells: Comparison results of Th1/Th2 between different timepoints in the same serogroup displayed that Th1/Th2 ratio presented as inversion status on all timepoints, and there was no significant difference bet In FBS group, Th1/Th2 ratio were significantly higher on D7 and D14 than D0 (P＜0.01), while it recovered to inversion status on D21. Comparison results between different serum microenvironments at same timepoint showed that on D7 and D14, Th1/Th2 ratio in FBS group was significantly higher than ZT and GT group (P＜ 0.01). Conclusions CD4＋/CD8＋ and Th1/Th2 of CIK cells cultured in different serum microenvironments presented dynamic changing trends. Personalized CIK cells treatment solution should established based on immune status of individual patient, serum microenvironment used for cell culture, and dynamic changes of CD4＋/CD8＋ and Th1/Th2 during CIK cells culture process. 【Key words】 CIK Se Interferon type Ⅱ; Interleukin-13; CD4-CD8 Th1/Th2细胞因子诱导的杀伤细胞 （cytokine induced killer， CIK ） 是 将 人 外 周 血 单 个 核 细 胞 （ peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在体外经多种细胞因子（如 抗 CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α 等）联合诱导产生的 ＋ ＋ ＋ ＋ 以 CD3 CD56 的 NKT 细胞为主，并包括 CD3 CD8 的 ＋ ＋ 细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cells，Tc）和 CD3 CD4 的辅助性 T 细胞 （helper T cells， Th） 等的异质细胞群， 兼具有 T 淋巴细胞的抗瘤活性和 NK 细胞的非主要组 织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC ）限制性杀瘤优点，故又被称为自然杀伤细胞（nature killer，NK）样 T 淋巴细胞（NK-T cells）。CIK 细胞具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强、对化 疗耐药的肿瘤细胞亦有杀伤作用等优点，并在清除 肿瘤微小残留病灶中具有明确疗效。被认为是新一 代抗肿瘤过继性细胞免疫治疗的首选细胞，在国内 被普遍应用于临床[1-3]。 目前，在临床进行 CIK 细胞治疗时，对如何控制 CIK 细胞在体外的培养时间，如何把控 CIK 细胞数量 和活力的最佳平衡，以及如何把握最适的 CIK 细胞回 输时机使得输注后机体抗肿瘤免疫功能能维持在较好中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20?9133?的水平等一些问题尚缺少统一的标准，各研究组的报 道不尽相同，通常采用在体外活化培养第 7～14 天不 等的 CIK 细胞，细胞回输最佳时机的判断往往是依据 ＋ CIK 细胞在体外培养体系中的增殖和生长情况、CD3 ＋ CD56 细胞比例及 CIK 细胞毒活性等因素来决定[4-7]， ＋ ＋ 而对于在 CIK 细胞中占有相当比例的 CD4 和 CD8 T 细胞，及其 Th1/Th2 的状态却极少涉及，缺少一些客 ＋ ＋ 观的实验依据。CD4 /CD8 和 Th1/Th2 是用来评价机 体免疫状态的重要指标，纠正肿瘤患者体内既已存在 ＋ ＋ 的 CD4 /CD8 、Th1/Th2 倒置现象，恢复和重建肿瘤 ＋ ＋ 患者的 CD4 /CD8 、Th1/Th2 平衡是肿瘤免疫治疗的 主要策略之一。而经体外活化培养的 CIK 细胞，其中 ＋ ＋ 的 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 水平将直接影响 CIK 细胞回 输后患者的免疫状态[8]。 本研究对比分析了在肿瘤患者自身抗凝血浆、胎 牛血清及无血清环境这三种血清微环境下培养活化的 CIK 细胞在培养过程中不同的时间点，CIK 细胞的增 ＋ ＋ 殖能力、肿瘤细胞杀伤活性及 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 的动态改变，旨在为临床进行 CIK 细胞治疗时，如何 在选用特定的血清微环境进行 CIK 细胞培养时选择最 佳的 CIK 细胞回输时机提供一些实验依据。 资料与方法 一、一般资料 选取云南省第一人民医院 2012 年 6～8 月经手术 治疗和术后病检确诊为恶性实体瘤患者 3 例。其中， 病例 1，男，28 岁，鼻咽癌术后；病例 2，女，69 岁， 结肠癌术后；病例 3，女，49 岁，子宫内膜癌术后。3 例患者均有明确的病理学诊断， 术前未经抗肿瘤治疗， 无自身免疫性疾病。该研究获得云南省第一人民医院 伦理委员会的批准，所有患者均知情同意，于 2012 年 8 月接受自体 CIK 细胞治疗。 Hyclone RPMI-1640 购自赛默飞世尔生物化学制 品（北京）有限公司。Bioind 胎牛血清购自赛默飞世 尔生物化学制品（北京）有限公司。无血清培养基 （GT-T551）购自宝生物工程（大连）有限公司。注射 用肝素钠（Heparin Sodium）购自江苏万邦生化医药股 份有限公司。 注射用重组人白细胞介素-2 （recombinant human interleukin-2， rhIL-2） 购自北京四环生物制药有 限公司。注射用重组人干扰素 -γ （ recombinat human interferon γ，rhIFN-γ）购自上海凯茂生物医药有限公 司。 注射用抗人 T 细胞 CD3 鼠单克隆抗体 （monoclonal antibody CD3，WuT3）购自武汉生物制品研究所。人 淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。PC5 标记的 CD3、FITC 标记的 CD4、ECD 标记的 CD8 均购自贝克曼公司。人干扰素 -γ （ interferon-gamma ， IFN-γ ） ELISA 试剂盒购自 R&D ，人白细胞介素 -13 （interleukin-13，IL-13）ELISA 试剂盒购自欣博盛生物 技术有限公司。 细胞培养瓶、 培养板均为 Corning 公司 （美国）产品。CO2 培养箱（Forma Therapeutics Inc， 美国）。倒置显微镜（ Nikon ，日本）。流式细胞仪 （Beckman Culter，MoFlo）。酶联免疫检测仪（Sigma 960，美国）。细胞培养操作均在达到药品生产质量管 理规范（GMP）的 CIK 细胞操作间进行。 二、方法 1. 外周血单个核细胞的采集：在 COM TEC 型血 细胞分离机（费森尤期卡比中国投资有限公司）上用 淋巴细胞采集程序采集 3 例肿瘤术后患者 50～100 ml 的 PBMC 血浆悬液，细胞总数为（5～10）×107。 2. 肝素抗凝自体血清的分离和制备：将单个核细 胞血浆悬液转移到数个 50 ml Falcon 离心管中， 2000～ 2500 r/min 离心 5～10 min，此时，单个核细胞血浆悬 液分为分界明显的上下两层，上层为血浆层，下层为 单个核细胞层。首先吸取上层的血浆，并添加终浓度 为（1.0～2.0）×105 U/L 的肝素钠，轻摇混匀，置于 －20 ℃冰箱放置 30～60 min 后， 将含肝素钠的血浆转 入数个 50 ml Falcon 离心管中， r/min 离心 5～10 min 后，弃去离心管底的絮状冷凝沉积物（主要 为纤维蛋白和纤维蛋白原），吸取上层肝素抗凝自体 血浆，置于 4 ℃冰箱保存备用。 3. CIK 细胞的培养和传代：在下层的单个核细胞层 中加入 20～40 ml 的 0.9%生理盐水重悬单个核细胞， 用淋巴细胞分离液（比重为 1.077±0.001 ）经 Ficoll 密度梯度离心法离心并收集得到界面层的 PBMC。用 0.9%生理盐水、 RPMI-1640 培养基洗涤细胞各 1 次后， 将细胞总数为 1×107 个 PBMC 按 2×106/ml 数量悬浮 于三组培养基中：（1）自体抗凝血浆组（ZT）：含 10% 患者自体肝素抗凝血浆的 RPMI-1640 完全培养 基；（ 2 ）胎牛血清组（ FBS ）：含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养基；（3）无血清组（GT）：无 血清培养基（GT-T551）。三组培养基均添加终浓度为 1.5×106 U/L 的 rhIFN-γ，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱 中培养。 24 h 后均加入 WuT3 100 μg/L 和 rhIL-2 5.0×105 U/L，当日即培养第 0 天（D0）。之后每 2～ 3 d 添加新鲜培养液 1 次， 并补加 rhIL-2 5.0×105 U/L， 根据细胞数量适当分瓶。分别在 D0、第 7 天（D7）、 第 14 天（D14）和第 21 天（D21）收集 3 ml 细胞培养 上清，置于－80 ℃冰箱保存备用。 4. CIK 细胞计数和生长曲线的绘制：分别于培养 计算活细胞数， 描绘细胞 后每隔 3 d 按台盼蓝拒染法，?9134?中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20×107。CIK 细胞在三组血清微环境中呈现类似的增殖 增殖曲线。细胞的增殖数是通过计数每一次添加新鲜 培养液传代后所获得的活细胞数后由下列公式计算而 趋势，无显著差异（P＞0.05）。 得：细胞增殖数＝本代细胞收获数×上代细胞总数/种 2. CIK 细胞的细胞毒活性（图 2）：（1）CIK 细 瓶细胞数。 胞的细胞毒活性在相同血清组不同时间点间比较： 5. CIK 细胞体外杀瘤活性的测定： 将培养至对数 ZT 组培养至 D7 、 D14 和 D21 的 CIK 细胞对 K562 5 的杀伤活性依次为（ 79.95 ± 12.23 ） % 、（ 93.86 ± 生长期的 K562 作为靶细胞（ 1×10 /ml）， CIK 细胞 6 作为效应细胞（ 1×10 /ml）。采用效靶比 10U 1，各 2.38 ） %和（ 66.34 ±7.54） %，FBS 组依次为（ 71.02 100 μl 在 96 孔板中混合培养，各 3 复孔，置于 37 ℃、 ±14.79）%、（ 83.72±5.63）%、（ 58.37±7.57）% ， 分别在每孔中加入终浓 5% CO2 培养箱中培养 24 h 后， GT 组依次为（ 40.92±4.66） %、（ 52.61±8.05） %、 度为 5 mg/ml 的 MTT，继续孵育 3 h 后在每孔中加入 （ 41.43±5.25） %，ZT 和 FBS 组在 D14 均显著高于 终浓度为 10 mg/ml 的酸性 SDS 100 μl，蓝色结晶充分 D7 和 D21（P＜0.01）；GT 组在不同时间点的 CIK 细 溶解后用酶联免疫检测仪以 490 nm 光波测定光吸收值 胞毒活性则无显著差异（P＞0.05）。（2）CIK 细胞 （ A）。杀伤活性（ %）计算公式为：[1－（ A 实验组 － 的细胞毒活性在不同血清微环境组相同时间点间比 A 效应细胞组）/A 靶细胞组]×100%。 较：在 D7、D14 和 D21 这三个时间点的三个不同血清 6. CIK 细胞免疫表型的检测：用平衡液洗涤 CIK 微环境组中均存在显著差异，ZT 和 FBS 组显著高于 细胞后用 PC5 标记的 CD3、FITC 标记的 CD4、ECD GT 组（P＜0.01）。 ＋ ＋ 标记的 CD8 避光孵育细胞，30 min，4 ℃。洗去多余 3. CIK 细胞中 CD4 /CD8 的动态改变（表 1）： （1）相同血清组不同时间点间比较：D0，肿瘤患者来 的抗体后，用流式细胞仪检测 CIK 细胞免疫表型。结 ＋ ＋ 源的 PMBC 中 CD4 /CD8 为 0.93±0.86，反映了肿瘤 果分析使用 Kaluza v1.1 软件。 患者较低的免疫水平。 ZT 组， 在 D7 升高至 2.25±1.67， 7. CIK 细胞培养上清中 Th1 和 Th2 的优势细胞因 但随即在 D14 和 D21 又分别下降至 0.31±1.42、 0.39± 子 IFN-γ 和 IL-13 的 ELISA 检测：待测细胞培养上清 ＋ ＋ 0.24，其中，D7 CD4 /CD8 显著高于 D0（P＜0.05）； 经室温冻融后，10 000 r/min 离心 5 min，取上清用于 FBS 组，在 D0，D7 和 D14 基本维持相同水平，但在 检测。 每个待测样本均做 2 个复孔。 操作按照各 ELISA D21 急剧降低至 0.04±0.55， 极显著低于 D0 （P＜0.01） ； 试剂盒说明书要求进行，反应终止后用酶联免疫检测 而在 GT 组，4 个时间点间无显著差异（P＞0.05）。 仪测量 OD 值。结果分析使用 Curve Expert 1.4 软件， ＋ （2）相同时间点不同血清微环境组间比较：在 D7，CD4 根据蛋白标准品浓度与 OD 值用指数曲线拟合法拟合 ＋ /CD8 比例在 ZT 组均显著高于 FBS 和 GT 组（P＜ 出最优标准曲线和对应回归方程式。将各待测样品的 0.05） ； 在 D14 和 D21， 三组间均无显著差异 （P＞0.05） 。 实测 OD 值分别代入对应方程式，计算出样品浓度， 4. CIK 细胞 Th1/Th2 的动态改变：（1）ELISA 标 再乘以样品稀释倍数，即得各待测样品的实际浓度。 准曲线的拟合和结果的计算 （表 2） ： 应用 Curve Expert 三、统计学分析 1.4 软件拟合出的最优标准曲线对应的回归方程式和 实验数据以均数±标准差（ x ± s ）表示，组间比 较采用 t 检验及方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学 相 应 的 标 准误 差 （ Standard error ， S ） 和 相 关 系数 意义。统计处理分析采用 SPSS 11.0 软件完成。 （Correlation coefficient，R）。各待测样品实测 OD 值 分别代入对应方程式，计算出样品浓度，再乘以样品 结 果 稀释倍数，即得 2 种待测蛋白的实际浓度（pg/ml）。 （2）相同血清组不同时间点间比较（图 3）：培养上清 1. CIK 细胞的增殖情况（图 1）：在培养的 D0～ 中 Th1 和 Th2 的优势细胞因子 IFN-γ 和 IL-13 的浓度 D4，CIK 细胞在三组血清微环境中细胞数量无明显增 （pg/ml）比即为 Th1/Th2。ZT 组，D0 Th1/Th2 倒置， 长。之后，细胞数量呈非线形增长，从 D5～D6 后细 仅为 0.610，从 D7 后逐渐升高，D7，D14 和 D21 分别 胞开始逐渐增殖，细胞呈集落样生长。在培养 D7 ～ 为 0.973，1.170 和 1.174，但 4 个时间点间无显著差异 D11，CIK 细胞数量明显增多，集落样细胞团块更大， （P＞0.05）；FBS 组，D0 Th1/Th2 倒置，仅为 0.610， 悬浮于培养基中。至培养 D14～D21，CIK 细胞在三组 D7 开始升高，D7 和 D14 分别为 1.775 和 2.078，均极 血清微环境中均进入快速增殖期。 在 D21， 在 ZT， FBS 显著高于 D0（P＜0.01），但 D21 又再次出现 Th1/Th2 和 GT 组中培养获得的 CIK 细胞数 （个） 依次为 （138.03 7 7 降低至 0.862； GT 组， D0 Th1/Th2 倒置， 为 0.850， （179.37±55.15） ×10 、 （170.37±42.18） 倒置， ±49.48） ×10 、中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20?9135?表1三组血清微环境培养的 CIK 细胞中 CD3＋、CD4＋和 CD8＋细胞亚群分布情况及 CD4＋/CD8＋（ x ± s ，n＝3）CD3 (%)＋CD4 (%) D14 D21 92.97±4.76 98.88±0.68 97.26±1.87 D21 30.09±11.20 89.82±3.45 69.16±18.47 0.93±0.86 29.40±12.63 D0 D0 D7 48.13±24.61 38.47±21.27 41.57±19.94 D7 2.25±1.67 0.66±0.81bc 0.77±0.69c＋组别 ZT 组 FBS 组 GT 组 组别D0D7 76.56±24.78 94.07±3.33D14 47.01±12.82 33.79±14.15 39.97±11.82＋ ＋D21 62.81±19.04 3.38±1.89 28.88±12.96 D21 0.39±0.24a 0.04±0.55 0.42±0.2491.52±7.05 92.25±5.76 98.45±0.4067.65±12.33 D094.05±3.04＋CD8 (%) D7 21.41±1.39 58.45±16.42 31.44±14.72 53.71±18.77 D14 47.42±12.73 60.44±14.28 55.76±18.53CD4 /CD8D14 0.31±1.42a 0.56±0.49b 0.72±0.56ZT 组 FBS 组 GT 组注：与 D7 比较，aP＜0.05，与 D21 比较，bP＜0.05。与 ZT 组比较，cP＜0.05表2项目 IFN-γ IL-13 方程 y＝a＋bx＋cx2＋dx3＋ex4 y＝a＋bx＋cx2＋dx3 a用指数曲线拟合法计算出的回归方程式b 233.367 493.377 c 348.419 －14.105 d －214.121 74.060 e 49.220 S 3.521 18.944＋R 0.999 994 5 0.999 956 4＋－4.639 －22.626并且在 D7，D14 和 D21 一直维持 Th1/Th2 倒置， Th1/Th2 分别为 0.616，0.551 和 0.466，4 个时间点间 Th1/Th2 无显著差异（P＞0.05）。（3）在相同时间点 不同血清微环境组间比较（图 3）：D7 和 D14，ZT 组 极显著高于 FBS 组和 GT 组（P＜0.01）。 讨 论机体的抗肿瘤免疫监视过程中，细胞免疫、体液 免疫以及有别于两者的 NK 细胞分别担负不同作用。 CIK 细胞是包括 NKT、Tc 和 Th 等细胞的一个异质细 胞群[9]。其中，NKT 和 Tc 通过 CTL 效应在清除肿瘤 细胞中发挥直接作用，是构成 CIK 细胞强大杀瘤活性 的主要效应细胞，Th 则主要通过分泌细胞因子发挥间 接的溶瘤和免疫调节效应。肿瘤患者，尤其是晚期肿 瘤患者，免疫功能常处于抑制状态，机体不能有效地 进行免疫防御反应[10-11]。主要表现为 T 细胞亚群分布 ＋ ＋ 百分率异常，CD4 /CD8 比值降低。其原因可能与肿 瘤 组 织 释 放 包 括 如 转 化 生 长 因 子 -β （ transforming growth factor-β ， TGF-β ） [12] 、 IDO[13] 、环氧合酶 -2 （Cyclooxygenase-2，COX-2）[14]等一些免疫抑制因子 有关。这些物质经血循环进入胸腺后抑制 T 细胞分化 成熟， 并诱导 T 细胞向有利于抑制性 T 细胞方向分化， ＋ ＋ ＋ 从而造成 T 细胞亚群 CD4 下降，CD8 升高，CD4 ＋ /CD8 比值变小，最终导致细胞免疫功能低下。而经 CIK 细胞回输后，可以使肿瘤患者外周血中 NKT、Tc ＋ 和 Th 细胞的绝对数升高，并扭转患者体内的 CD4 ＋ /CD8 倒置现象。 我们的研究结果显示肿瘤患者来源的 ＋ ＋ PMBC 在培养前 CD4 /CD8 倒置，反映了肿瘤患者较 低的免疫水平。经体外培养活化至 D7 的 CIK 细胞， ＋ ＋ ZT 组 CD4 /CD8 恢复平衡，但随即在 D14 到 D21 又恢复为比例倒置；而 FBS 和 GT 组，CD4 /CD8 一直 ＋ ＋ 维持倒置现象。并且 CD4 /CD8 在不同血清微环境组 ＋ 相同时间点间进行比较的结果亦显示在 D7 ， CD4 ＋ /CD8 在 ZT 组显著高于 FBS 和 GT 组（P＜0.05）， 提示采用 ZT 血清微环境培养 7 d 的 CIK 细胞回输至肿 ＋ ＋ 瘤患者体内对纠正 CD4 /CD8 倒置，恢复免疫平衡最 为有利。 Th 细胞根据其所分泌的细胞因子分为 Th1 和 Th2 两个亚群[15]。Th1 类细胞因子的主要作用为增强机体 的细胞免疫功能，包括 IL-2、TNF-α、IFN-γ，Th2 类 细胞因子则主要对体液免疫起作用，包括 IL-4、IL-5、 IL-7 、 IL-9 和 IL-13。IFN-γ 是 Th1 细胞的优势细胞因 子，能促进 Th 细胞向 Th1 转化而抑制向 Th2 转化， 从而介导细胞免疫反应[16]，在肿瘤免疫中发挥重要作 用。其可通过：（1）促进 MHC Ⅰ 类和Ⅱ类分子表达， ＋ 增强包括 NK、 Tc 和 TCRγδ T 细胞的杀瘤活性和巨噬 细胞的抗原呈递能力；（2）抑制 Th2 细胞分泌 IL-4、 IL-5、IL-7 、IL-9 和 IL-13 等细胞因子，下调体液免疫 功能；（3）诱导血管内皮细胞表达黏附分子、分泌炎 性因子促进炎症反应等多条途径介导多种免疫调节作 用，发挥直接或间接的抗肿瘤免疫效应[17]。IL-13 则是 Th2 细胞的优势细胞因子，其功能与 IL-4 类似[18-20]， 能促进 Th 细胞向 Th2 极化而抑制向 Th1 极化，从而介 导体液免疫反应， 促进 B 淋巴细胞增殖和抗体分泌[21-22]。 肿瘤患者的免疫功能低下，常出现 Th1/Th2 倒置。对 肿瘤患者而言，要使其保持良好的抗肿瘤免疫状态， 其体内的 Th 细胞亚群须以 Th1 为主， 一旦发生漂移形 成大量 Th2 细胞，肿瘤细胞就有可能发生免疫逃逸， 因此， 如何恢复 最终导致肿瘤的发生或转移复发[23-24]。 和重建肿瘤患者体内 Th1 和 Th2 细胞亚群间平衡亦是肿?9136?中华临床医师杂志(电子版)2013 年 10 月第 7 卷第 20 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),October 15,2013,Vol.7,No.20瘤治疗的主要策略之一。研究表明，CIK 细胞中 CD4 细胞是一典型的免疫调节细胞，具有显著的“Th1 优 势”。大量回输 CIK 细胞，可迅速重新调节宿主体内 各种免疫效应细胞间的平衡，纠正恶性实体瘤患者体 内较明显的“Th2 优势”，即 Th1/Th2 倒置现象和由 此产生的免疫抑制状态， 而诱导外周血中 Th 细胞发生 “Th1 漂移”，恢复 Th1/Th2 平衡，推动整个抗肿瘤免 疫反应朝正向发展[4,25]。 本研究动态监测了在 3 种不同血清微环境中活化 培养的 CIK 细胞 Th1/Th2 的改变趋势，发现在 ZT 和 GT 组其改变趋势完全相反，ZT 组 Th1/Th2 呈逐渐升 高趋势，而 GT 组则逐渐降低、持续 Th1/Th2 倒置现 象，FBS 组 Th1/Th2 在 D7~D14 急剧升高，极显著高 于 D0（P＜0.01），Th1/Th2 倒置现象被纠正，但在 D21 又再次出现 Th1/Th2 倒置。研究结果提示，较之 GT 组， ZT 和 FBS 血清微环境培养的 CIK 细胞在活化 D7 ～ D14 时进行回输有利于提高肿瘤患者外周血中 Th1 类细胞因子水平，有利于推动“Th1 漂移”，从而 部分纠正肿瘤患者体内既已存在的 Th1/Th2 倒置现象， 推动抗肿瘤免疫反应朝正向发展。而对不同血清微环 境组相同时间点 Th1/Th2 比较后发现，在 D7 和 D14 这两个时间点，Th1/Th2 在 FBS 组极显著高于 ZT 和 GT 组（P＜0.01），提示我们，CIK 细胞在体外培养 相同时间（7 或 14 d），在 FBS 血清微环境中培养获 得的 CIK 细胞较之 ZT 和 GT 组更有利于纠正肿瘤患者 的 Th1/Th2 倒置现象。 ＋ ＋ 综合分析 CIK 细胞培养过程中 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 的动态改变和 CIK 细胞增殖情况、细胞毒活 性等结果，提示我们，采用 ZT 或 FBS 血清微环境培 养的 CIK 细胞，在培养 D7～D14 是进行 CIK 细胞回 输治疗的最佳时段，这时的 CIK 细胞不但处于对数增 殖期、具有较高细胞毒活性，而且还有利于纠正肿瘤 ＋ ＋ 患者体内既已存在的 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 倒置现 ＋ ＋ 象，恢复 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 平衡，有效提高 T 淋＋巴细胞免疫功能，推动整个抗肿瘤免疫反应朝正向发 展。而在 GT 血清微环境中培养的 CIK 细胞，在培养 ＋ ＋ 的整个过程中，CD4 /CD8 和 Th1/Th2 一直维持倒置 现象，细胞毒活性也较之 ZT 和 FBS 组低。究其原因 是由于肿瘤患者自身抗凝血浆可能本身就含有诸如 MHC 分子、集落刺激因子、生长因子等免疫原性更适 合于自身 T 细胞生长的刺激因子，从而使细胞内基因 表达、蛋白合成、信号转导等过程更紧密顺利，促进 了细胞增殖及细胞系的维持。再就是这种培养方法所 获取的抗凝血浆来源新鲜，在一定程度上避免了商品 血清在运输储存过程中蛋白的降解破坏，即随之而来 产生的细胞毒物质对细胞的损害。 综上所述，在不同血清微环境中培养活化的 CIK ＋ ＋ 细胞，CD4 /CD8 和 Th1/Th2 呈现不同的动态改变趋 势，因此，在临床进行 CIK 细胞治疗时，应根据患者 ＋ ＋ 本身的 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 水平，综合考虑所采用 的细胞培养血清微环境，并在细胞培养过程中，除去 监测细胞增殖、细胞毒活性、各免疫表型的细胞亚群 ＋ ＋ 分布等常规项目外，还应监测 CD4 /CD8 和 Th1/Th2 的动态改变。同时，还应综合考虑患者的肿瘤负荷状 态、是否处于放化疗等可引起免疫功能低下的疗程等 实际情况来制定个体化的 CIK 细胞培养及回输方案。参[1]考文献＋ ＋Lu PH, Negrin RS. 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