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手把手教你设计引物（图文并茂）
手把手教你设计引物（图文并茂）
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不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。
引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。
就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。
以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站 http://asia.ensembl.org/index.html
1. 输入目的基因，进入
2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入
3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA
4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容
5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS
6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断
下载后打开的WORD
7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。选取并复制第6和第7外显子序列
8. 登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物
9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到
相关实验方法
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real-time RT-PCR
[url=]/bbs/thread/1315321CEA [/url]
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鼠(mouse/rat)
real-time RT-PCR兔（rabbit） 猕猴猪(pig)real-time RT-PCR牛
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SARS病毒禽流感鸡real-time RT-PCR鹅鸭
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斑马鱼zebrafish
金鱼草中国对虾，中华绒螯蟹，鹰爪虾 ，对虾
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真菌幽门螺杆菌日本血吸虫病毒水稻矮缩病毒芜菁花叶病毒Xenopus laevis (African clawed frog)昆虫 拟南芥（arabidopsis）或maize C. elegansmaizesweetpotato
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丁香园中级站友
主任辛苦了，应加5分才是啊！:):)
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急切恳求TGF-bata受体1，受体2的引物谢谢
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丁香园中级站友
鼠FHIT基因引物 1F 5'-TTT GAA GCC CAG CAA AGA AGG GA-3' 1R 5'-GCC TTG GGA ATC GTT TGA GTT AC-3' 2F 5'-AAT CCA CTG AGA AGA GTC AGG AA-3'
2R 5'-TAC TCT CAG GCC TGA AAG TAG AC-3' 本人及师兄实验证实
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yeang 鼠FHIT基因引物 1F 5'-TTT GAA GCC CAG CAA AGA AGG GA-3' 1R 5'-GCC TTG GGA ATC GTT TGA GTT AC-3' 2F 5'-AAT CCA CTG AGA AGA GTC AGG AA-3'
2R 5'-TAC TCT CAG GCC TGA AAG TAG AC-3' 本人及师兄实验证实请到下面的链接按格式提交：
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急求HIF-1alpha(hypoxia inducible factor 1alpha 引物)email:.cn
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急需罗氏沼虾的mtDBA基因组序列.以及ND5、ND6和CTY-B基因的引物。
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急求L-pyruvate kinase 引物
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怎么没有小鼠（mouse）的beta-actin呢？很经典的，怎么没有人提交呢？我就等这个呢！！
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主任，急切恳求人hMLH1基因的甲基化、非甲基化引物，谢谢！
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内参的引物和用于RT-PCR的引物有什么区别吗？
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急寻小鼠IL-4、IFN-gammaRT-PCR的引物，不知哪位仁兄不吝相告，在下不胜感激！！！Email:
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急需小鼠IL-4 RT-PCR引物序列,不知谁有,不胜感激.beyond_
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请问有没有鹅的MHC的引物？不胜感激！！！
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1.物种：人2.基因名称：IL-243.模板：cDNA4.PCR类型及目的：RT-PCR5.forward primer(5’-3’): GGC CCA GGG CCA AGA Areverse primer(5’-3’)：GAT GTT ATC CTG AGC TTG CAT AGT GT6.probe :tgg gaa gcc ttc tgg gct gtg aaa7.产物长度（bp）:261 bp8.退火温度：60℃9提交者ID：wj0101wj10参考文献:international immunopharmacology 1(2
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wj0101wj 1.物种：人2.基因名称：IL-243.模板：cDNA4.PCR类型及目的：RT-PCR5.forward primer(5’-3’): GGC CCA GGG CCA AGA Areverse primer(5’-3’)：GAT GTT ATC CTG AGC TTG CAT AGT GT6.probe :tgg gaa gcc ttc tgg gct gtg aaa7.产物长度（bp）:261 bp8.退火温度：60℃9提交者ID：wj0101wj10参考文献:international immunopharmacology 1(2提交引物请到下面的链接－建立丁香园引物库
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急求小鼠（mouse）的beta-actin引物（做内参用）！上面香园引物库中有内参beta-actin(人或鼠) ，难道人和小鼠的beta-actin引物相同？.cn
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lishuixian 急求小鼠（mouse）的beta-actin引物（做内参用）！上面香园引物库中有内参beta-actin(人或鼠) ，难道人和小鼠的beta-actin引物相同？.cn保守区引物可以通用，非保守区则具有特异性！
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本人通过实验已经验证。1.物种：rattus2.基因名称：GAP-433.模板：cDNA4.PCR类型及目的：RT-PCR 5.forward primer(5’-3’): ACAAGGAAAAAGCTCAAAG
reverse primer(5’-3’)：GACGGGGAGTTATACGTGG6.产物长度（bp）:292 bp7.引物浓度：20pmol/L8.退火温度：58℃9提交者ID：rucy197610参考文献:Leung MS, Wong CC. Expressions of putative neurotransmitters and neuronal growth related genes in Merkel cell-neurite complexes of the rats. Life Science, ):1481-911.提交者联系方式（可选项）：
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急需人的heme oxygenase-1(HSP32) RT-PCR引物序列,最好是可以扩全部功能mRNA的,不知谁有?非常感谢!我的E-MAIL:QQ:
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1.物种：rattus2.基因名称：insulin13.模板：cDNA4.PCR类型及目的：RT-PCR 5.forward primer(5’-3’): 5’-CCG TCG TGA AGT GGA G-3’reverse primer(5’-3’)：5’-CAG TTG GTA GAG GGA GCA G-3’6.产物长度（bp）:154 bp7.参考文献:董凌燕等，南京医科大学学报，23（4）：3188、大鼠胰岛素基因（insulin1 gene）定位于1号染色体的第 - 号碱基，全长333base，上述克隆序列位于第162～315号base，全长154base。
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需要大鼠的BCL-2以及P53的RT-PCR引物，有哪位仁兄帮忙一下谢谢
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急需果蝇方面的引物！谢谢
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本人急需非洲爪蟾的蛋白激酶ι，λ，μ，θ，η;这几种亚型的引物（最好能区分开这几种亚型）。多谢。
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哪位做过四膜虫吗?我想做一种纤毛虫的基因克隆,RT-PCR找不到内参,想用四膜虫或者其他纤毛虫的actin试试,可惜找了很久没有找到.请大家帮忙!多谢!
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各位有没有P－gp的RT－PCR引物啊？多谢！
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拜托各位高手：有没有p53基因5～8外显子、K-ras第1外显子引物，用于检测碱基突变，急盼！！
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急需TLR3的引物!!!请指教一二!!!谢谢!
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主任：我急需贝类rDNA 18s and ITS1(500bp)引物。谢谢！！
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请问哪位做过柯萨奇病毒CVB3的PCR，可以提供引物序列参考？
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关于丁香园细胞库/细胞培养
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一步步教你利用Blast分析验证引物序列
一步步教你利用Blast分析验证引物序列
来源：互联网
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引物设计完成之后，需要用软件
进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。
先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种
的一些c-jun mRNA序列。
文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件
分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：
1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）
　（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
　（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
　（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列
注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。
3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。
4. 结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。
如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件
分析分析到底引物好不好。
1、进入网页：http://www.NCBI
.nlm.nih.gov/BLAST/
2、点击Search for short, nearly exact matches
3、 在search栏中输入引物系列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
(1)输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物 空格 输入下游引物
B、输入上游引物 回车 输入下游引物
4、 在options for advanced blasting中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字改为10
5、在format中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字填上0 10
6、 点击网页中最下面的“BLAST!”
7、 出现新的网页，点击Format!
8、 等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
(1)图形格式：
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配
通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
(2)结果信息概要：
从左到右分别为：
A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息
B、系列的简单描述
C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基×2+0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。
D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了
E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：
U代表：Unigene数据库
E代表：GEO profiles数据库
G代表：Gene数据库
(3)结果详细信息：
①圈出来的部分代表序列的信息
②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：
共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2+0.1=42.1】，E值为0.020
上游引物与序列的位点匹配
③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：
共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2+0.1=40.1】，E值为0.077。
下游引物与该序列的2位点互补
①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。
②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?
A、 为同一个基因来源的不同的mRNA片段
B、 为该基因的DNA系列
C、 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。
结果判断：
①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用
②检测该引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反应的非特异扩增。如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分数非常高。这种结果表明所设计的引物序列特异性不高，最好重新设计引物，否则会得到非特异扩增的PCR产物。
相关实验方法
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