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外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响
摘　要：利用水稻穗离体培养方法,对不同外源磷浓度下水稻籽粒植酸等磷化物含量的差异及其植酸代谢相关功能基因在灌浆过程中的表达特征进行了探讨。结果表明,水稻籽粒中的植酸、无机磷和总磷含量随外源磷处理浓度上升呈增加趋势,但磷处理对千粒重和单位籽粒中植酸积累量的影响因磷浓度水平而异,高磷处理会导致水稻千粒重和籽粒植酸积累绝对量的显著降低;外源磷处理浓度的上升,不仅会引起水稻籽粒中锌和铁元素含量的显著降低,而且会导致锌、铁营养的生物有效性下降;外源磷处理对水稻籽粒植酸含量的影响与不同磷处理下RINO1基因的相对表达量之间存在较密切关系,中磷浓度（3P）处理会诱导RINO1基因的表达,但高磷浓度（12P）会抑制RINO1基因的表达,RINO1是外源磷浓度处理对水稻籽粒植酸合成代谢过程产生调控作用的一个重要功能基因位点,而IPK2基因与水稻在不同磷浓度处理下的植酸含量变化无直接联系。外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响47
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外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响47
://httwww．ricesci．cnp:/D；,():中国水稻科学(ChinJRiceSci)；１５９；外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的；(:)浙江大学农业与生物技术学院,杭州３１００５；苏达王复标雷炳婷王珏潘刚?程方民?；TheResonseofPhticAcidand；??,,WANGF,,WANGJ,SauＧbia；anan１２＠１
://httwww．ricesci．cnp:/DOI１０．３９６９i．ssn．１００１Ｇ７２１６．２０１５．０２．００７j,():中国水稻科学(ChinJRiceSci)２０１５,２９２１５９－１６６１５９外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响(:)浙江大学农业与生物技术学院,杭州３１００５８;?通讯联系人,EＧmailanan１２＠１２６．chenfm＠zu．edu．cnpgggj苏达　王复标　雷炳婷　王珏　潘刚?　程方民?TheResonseofPhticAcidandItsExressionProfilesinRice(Orzasativapypy)L．GrainasInducedbhoshorusSulyPpppy??,,WANGF,,WANGJ,SauＧbiaoLinＧtinuePanCHEanＧminUDEIBANGNGFgggganan１２＠１２６c．chenm＠zue．duc．n)pgggfj?C(ColleeoricultureandBiotechnoloheianniversitanzhou３１００５８,Corresondinuthors,EＧmail:gfAggy,ZjgUy,Hgpga,WAN,,SUDaGFubiaoLEIBintinetal．Theresonseofphticacidanditsexressionprofilesinrice(Orzaggpypy),():sativaL．rainasinducedbhoshorussul．ChinJRiceSci２０１５,２９２１５９Ｇ１６６．gyppppy:()(),AbstractPhticacidPAisthemainstoraeformofphoshorusPincerealgrains．HowevertherelationshiygppbetweenexternalPsulndgrainPAaccumulationhasnotyetbeenfullnderstood．Twojaonicaricecultivarsppyayupwereusedtoinvestiatetheeffectsofphoshorus(P)treatmentsongrainphticacid(PA)anditsrelationtoinositolgpy()hoshateＧrelatedgenesexressionprofilesusincultureofdetachedpanicleofriceOrzasativaL．．Resultsshowedpppgay),thathihPlevelcausedasinificantincreaseingrainPA,inoranicP(PiandtotalPcontents．Howeverraingggg,weihtandPAcontenterrainwerePconcentrationＧdeendentanddecreasedunderhihPtreatment(１２P)．HihPgpgpgg,,sulecreasedgrainZnandFeconcentrationsandtheirbioＧavailabilities．MoreoverPtreatmentalsoinfluencedallppyd/,fourPArelatedgenesexression(RINO１,ITP５６KＧ６,IPK２andIPK１)eseciallorRINO１,arateＧlimitinppyfg,ReneinPAsnthesisandhihlxressedinricegrains．SecificallION１geneexressionwasuＧreulatedatgygyeppyppg(),(),otimumP３PconcentrationbutwassinificantlownＧreulatedunderhihPtreatment１２Pwhichpgydgg,corresondedwiththevariationofgrainPAcontentinricesuestinION１wasakeetabolicgeneinPApgggRym,snthesiswithPsul．IncontrastonlslihtcontributionofIPK２genewasexhibitedinPAsnthesisinducedbyppyyagyyPsul．ppy:;;)KeordshticaciddetachedricepaniclecultureRINO１;rice(OrzasativaL．pyyyw苏达,王复标,雷炳婷,等．外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响．中国水稻科学,２０１５,２９():２１５９Ｇ１６６．摘　要:利用水稻穗离体培养方法,对不同外源磷浓度下水稻籽粒植酸等磷化物含量的差异及其植酸代谢相关功能基因在灌浆过程中的表达特征进行了探讨.结果表明,水稻籽粒中的植酸、无机磷和总磷含量随外源磷处理浓度上升呈增加趋势,但磷处理对千粒重和单位籽粒中植酸积累量的影响因磷浓度水平而异,高磷处理会导致水稻千粒重和籽粒植酸积累绝对量的显著降低;外源磷处理浓度的上升,不仅会引起水稻籽粒中锌和铁元素含量的显著降低,而且会导致锌、铁营养的生物有效性下降;外源磷处理对水稻籽粒植酸含量的影响与不同磷处理下R中磷浓INO１基因的相对表达量之间存在较密切关系,))度(处理会诱导R但高磷浓度(会抑制R３PINO１基因的表达,１２PINO１基因的表达,RINO１是外源磷浓度处理对水稻籽粒植酸合成代谢过程产生调控作用的一个重要功能基因位点,而IPK２基因与水稻在不同磷浓度处理下的植酸含量变化无直接联系.关键词:植酸;稻穗离体培养;三磷酸肌醇合成酶;水稻()中图分类号:Q文章编号:７８６;Q９４５??１２;S５１１??０１　　　　　　　文献标识码:A　　　１００１Ｇ７２１６２０１５０２Ｇ０１５９Ｇ０８]１,２,栽培措施之一[但对于增施磷肥对作物籽粒磷　　磷是作物生长发育过程中一种重要的营养元素,是构成生物大分子及多种重要化合物的组分,参与植物体内的各种代谢,并能提高作物的抗逆性和适应能力,因此,合理施磷是作物高产、优质的重要收稿日期:２０１４Ｇ０８Ｇ０５;修改稿收到日期:２０１４Ｇ０９Ｇ０８.积累及其组分形态的影响,迄今尚缺乏较明确的认识.六磷酸肌醇)是　　植酸(Phticacid,CP６H１８O２４６,y).基金项目:国家自然科学基金资助项目(３１０７１３６６和３１２７１６５５１６０禾谷类和豆科作物籽粒中磷的最主要贮存形式,通常占籽粒总磷含量的同蛋白质结合沉积在种子中６０％~９０％[３]的发育过程中合成,.植酸在种子[４]在生理.(吸收利用的植酸盐如钙、p铁和锌等H条件下),络合植酸可以和一些金属营养元素,进而影响对这些必需矿质营养,形成不能被人和非反刍动物元素的吸收,因此,植酸被认为是一种“抗营养因子”,通过育种、栽培等途径降低作物种子中的植酸含量是作物营养品质改良工作的一个重要目标[３,５]响,以及籽粒植酸积累量变化与锌.但针对增施磷肥对作物籽粒植酸含量的影、铁矿质元素含量间的关系,目前尚存在较大争议[６Ｇ１２]采用稻穗离体培养方法,通过设计在常规大田栽培.为此,本研究和水培试验条件下难以实现的极端磷浓度处理(包括０mmol/L磷浓度和６mmol/L以上的高磷浓度),对不同外源磷浓度处理水稻籽粒植酸含量、植酸/锌和植酸/铁摩尔比变化及其植酸合成代谢路径主要功能基因的表达差异进行了分析,旨在通过极端磷浓度的试验处理设计,阐明磷营养供应与籽粒植酸合成积累之间的相互关系及其有关代谢生理基础,为水稻营养品质方面的栽培措施研究提供相关理论依据.．　材料与方法１　试验材料试验于进行.供试２水０１稻２－品２种０１３年在浙江大学紫金港校区为粳稻品种秀水０９和秀水至大田１０,单季稻种植,大田常规水作管理,５月中旬播种、.在齐穗期６月中旬单本插栽,选择长势、长相和生育进程一致的单茎挂牌标记.在水稻挂牌后的第７天,剪取挂牌标记的稻穗单茎,带回实验室进行稻穗离体培养和磷处理.与此同时,对齐穗期挂牌标记的部分稻穗(/约占挂牌标记稻穗总数量的４左右),采用田间动态取样方法,分别在水稻抽穗开花后灌浆籽粒样品进行有关指标测定７、１４、２１和２８d,取其大田生长条件下的.．２　水稻穗离体培养方法与试验处理水稻穗离体培养参照本课题组已授权的发明专利(专利授权号:序如下:CN１０３３５５１６９B)[１３].主要操作程斜切剪断１),田间取样快速置于静水中且避光保存,将花期标记的水稻单茎从基部;处理,保留完整的穗和)穗茎节以下两个完整节间５cm长的剑叶剑叶鞘２离体穗预;３)()离体穗消毒,穗茎节以以及中国水稻科学(ChinJRiceSci)　第２９卷第２期(２０１５年３月)下部位依次用脂棉包裹５min,４快速固定于已灭菌的培养液中初７０代％乙醇和培养,消毒１％次氯酸钠消毒和１;)后的离体穗(用含无菌滤无４菌５s脱膜过滤的０．０７５％亚硫酸),穗器官外露.养,将装有离体稻穗的培养瓶置于冷水浴中,穗层温度由室内控温控湿装置调控１℃~２５℃)分层培的浅层,温度２３４养基００℃~m,m２更换时重复以上灭菌步骤o６l/℃(,m湿２??度s)７５;６％)继代培养,光照１６h.,每/离体培养６d黑暗更换８h２１,光次培强(０d后是花后,由于同一稻穗上水稻开花２７d)水稻籽粒基本停止时灌间浆大.约值持得续一提的右,因此本研究中稻穗离体培养的起始时间选在水７d左稻开花后的第７天,以保证稻穗上多数颖花的开花受精过程不受影响,且稻穗上中部一次枝梗上的籽粒(取样分析部位的籽粒)正处于籽粒灌浆的启始阶段.试验以NaH２PO４和１２mmo??２H２O为磷源,设０、１、３、６０P、１P、３P、l.浓除度磷梯处度理处水理(６/L５个磷平差分异别外标,培记养为基的其他成分不变P、１２P:)大量元素和微量元素含量参照LMK;S大培养基,量元素碳源为蔗糖,.１．５０mmol/其中蔗糖LCaCl２、１１３．１５０．４７mmmmolo/l/L０L２S(NOH４、４０)．２７S５mmO４、２７ol．/９９LmmMgSolO/４L??K７NHO２O、３;３微量元素．５１mmo,l５/．μ０μmol/LKI、１００．２７μmol/７mLCHo２l/LMnSO４??uOS、O１??/４H２O、２９．９１LμmHo３lB/LO３Z、n１S０O０４．０??０/４０３盐μ??,７４H５２．２７??O;μ有m５μoHmolLNa２l机/２OL、成N０分a．１２１,E５DμM５５Tmo．AoOl/４??２H２O、０．１０μmol０６、４L５μ．m９C９oColμl/Lm２o??l肌/６LFH２O醇、e４S;．O铁０６４盐酸吡哆素mol/L烟酸、、１．３　籽粒理化指标的测定５.０??２５６９．６μ４mμolm/oLl/盐酸硫胺素L甘氨酸、１.．４培养基８μmol/L设为５．pH离体稻穗在培养２０d后,对不同磷处理水平的稻穗,分别选化指标的测定１５株单穗,取其上中部的籽粒进行理,籽粒样品于考种后人工去壳,于研钵中６０手℃烘干工研磨４８h至恒重,、过筛(mm０．２５量,并同时测定锌)后测定糙米米(粉酸含量的测定参照Z)中、的植)酸、无机磷和总磷含照[Lniu等铁[(１４F]e;Zn含量、Fe.含量的测定参其中,籽粒植coxW等ei等１５][５].每个处;无机理磷设和３总次磷重含复量.的采测用定S参PS照S１W１il．０Ｇ１１１１１苏达等:外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响１６１１．４　植酸合成代谢关键基因表达的RTＧPCR和RTＧPCR检测q固定穗位取样,取样部位为穗中上部一次枝梗处的()对应花后１的３个有代表性的磷水１４d４和２１d、、平处理:无磷对照(适磷(高磷(处理０P)３P)１２P)RNA,DNaseⅠ消化后合成cDNA第１链.选取与籽粒植酸合成代谢密切相关的４个基因:RINO１、.提取和纯化水稻籽粒总固定穗位取样(同上)发育籽粒.同时,对离体稻穗(秀水０培养７d和９)供试品种秀水０９于花后７、１４、２１和２８d田间软件进行方差分析,以LSD法检测差异显著性.理则会引起其千粒重的显著下降,供试两个品种的表现基本一致,仅在适合其千粒重提高的外源磷处/理水平上略有差异.其中,秀水０９在６mmolL浓/水１其１０在１２mmolL浓度的外源磷处理水平下,千粒重才有所降低.这一现象说明,籽粒植酸浓度随外源磷浓度处理增加而升高的趋势,在很大程度上与其千粒重在高磷浓度水平下的下降有关,而单/粒)位水稻籽粒中的植酸积累量(绝对量,在高mg/磷浓度水平(下的降低,则反映出过高１２mmolL)的显著降低.,量的测定结果表明(表２)水稻籽粒中的锌和铁含量随外源磷浓度的上升均呈较明显的下降趋势,但下降幅度因外源磷处理的浓度区间和品种差异而有所不同.其中,秀水０９籽粒中的锌和铁含量对外源[/[])也随外源磷处理浓度的上升而上升,尤PA]Fe//其是在高磷浓度(处理＞６mmolL或１２mmolL)/[/[]下,水稻籽粒中的[和[几乎比PA]Zn]PA]Fe其对照处理提高了２倍以上,上升幅度非常明显.[/[]水稻籽粒中的植酸与锌、铁的摩尔比(和PA]Zn磷处理浓度变化的响应相对大于秀水１１０.此外,对不同外源磷水平处理下水稻籽粒中锌和铁含的外源磷浓度处理会导致籽粒植酸合成及其积累量度的外源磷处理下,其千粒重就出现显著下降,而秀/,表１)对其在转录水ITP５６KＧ６、IPK２和IPK１(平上进行半定量和实时定量PCR分析.２　结果与分析植酸２．１　不同磷处理水平下水稻籽粒植酸积累量、浓度、锌/铁含量及其营养有效性的差异在稻穗离体培养条件下,水稻籽粒中的植酸浓度、无机磷和总磷含量随外源磷处理浓度上升呈上升趋势,而籽粒植物积累量与外源磷处理间的关系/表现为在０~６mm籽粒植olL外源磷浓度范围内,/籽粒植酸含量mmolL浓度的外源磷浓度处理下,).则有所下降(表２关.由表２可见,外源磷处理对千粒重的影响存在的外源磷处理有利于提高水稻籽粒的千粒重,但L)//高磷浓度(的外源磷处＞６mmolL或１２mmolL)表１植酸合成代谢相关基因的PCR扩增引物Table１．SeuenceofprimersforphticacidsnthesisＧrelatedgenes．qyy基因基因登录号Accessionno．X１６２８０酸含量随外源磷处理浓度升高而增加,但在１２籽粒植酸浓度和植酸积累量(植酸含量)在高磷２．２　不同磷处理水平下水稻籽粒植酸合成相关基因的表达差异,关键酶基因的表达量检测结果表明(图１)外源磷处理会诱导R但同时使INO１基因的转录表达,尤其是在IPK１基因的表达量受到一定程度抑制,外源高磷浓度(处理下,１２P)IPK１基因表达的下不同磷处理浓度下籽粒植酸合成代谢途径几个浓度处理下的差异与外源磷处理对千粒重的影响有/较明显的磷梯度水平差异,中低浓度(１~３mmol引物序列F:TGCGACGTGGATATTAGGAAR:TGCCAGGGAACATAGTGGTAF:CCGTGGCATGTGGCAAAGAGR:TGCATAGCCCGATAAGAGTCF:ATTTGCATACAGGCGACAACR:ATGTTCATCGCAAGCAGTTCF:GGAGCAAACCCTGTACCACTR:ACCAGCTTCACCCTTACACC)C３Primerpairs(５′′产物大小/Productsizebp８３１５１１２７１１４１３８ACTINRINO１GeneAK１０３５０１AK１０２５７１AK０７２２９６AK１０２８４２/ITP５６KＧ６IPK２IPK１F:GCTGGAAAGAATGTGCTTGAR:TGCTATGCAACTGCTTCCTC１６２中国水稻科学(ChinJRiceSci)　第２９卷第２期(２０１５年３月)表２　外源磷浓度处理对水稻籽粒植酸、无机磷、总磷和主要矿质元素含量的影响(,,Table２．DifferencesinphticacidPA)inoranicP,totalPandgrainZnFecontentsatvariousexternalPlevels．yg品种与参数秀水０９Xiushui０９Varietndparameterya０１８．０４±０．４８b－１１/(??L－１)磷浓度Plevelmmol３６１２１５．７２±０．６３c/　千粒重１０００Ｇrainweihtggg/％　植酸浓度PAconcentration/(??g　植酸含量PAcontentmrain)g－１/(??g)　无机磷InoranicPmgg－１/(??g)　总磷TotalPmg－１０．０７７±０．００６d０．１８±０．０２d１．６６±０．１２d０．４３±０．０４d２０．０３±０．７２a０．１２１±０．００６c０．１８±０．０２d２．２５±０．０２c０．６０±０．０１c２０．１２±０．３６a０．１７４±０．００２a０．４８±０．０２c３．５１±０．０６b０．８７±０．０２b１７．４６±０．５７b０．１６６±０．００１ab０．７９±０．０１b４．１９±０．１１a０．９５±０．０３a０．１５１±０．０１２b１．０１±０．０６a４．５１±０．２２a０．９６±０．０５a/(??k　锌含量Zncontentmgg)－１/(??k　铁含量Fecontentmgg)/[]　植酸锌摩尔比[PA]Zn/[]　植酸铁摩尔比[PA]Fe秀水１１０Xiushui１１０２１．９３±１．０２a２８．８０±２．２３a１２．６７±２．０６e１７．８６±０．５４c－１２１．７０±１．１０a２７．６０±１．２３c１９．２６±１．５１d２４．４９±０．６５b２０．９２±０．８６d１９．０２±０．９３b０．１１０±０．００７c０．２３±０．０１d２．２３±０．１２d０．５８±０．０４c１７．９５±０．１３b２１．４４±１．１５b４７．９１±１．５０b３４．４２±２．６７c１７．９７±０．６６b１７．５１±０．６２c５２．３９±３．０３ab４６．０３±２．６３b２０．７１±０．１３a０．２０１±０．００６a０．７３±０．００b４．１８±０．１１b０．９７±０．０３a１６．７４±０．１１b１４．１９±０．０７d５６．７９±２．３１a５７．４０±２．９６a１８．６３±１．０６bc０．１９２±０．０１８ab１．１０±０．０３a４．６８±０．１３a０．９８±０．０４a/　千粒重１０００Ｇrainweihtggg/％　植酸浓度PAconcentration/(??g　植酸含量PAcontentmrain)g－１/(??g)　无机磷InoranicPmgg－１/(??g)　总磷TotalPmg－１０．１００±０．００６c０．２０±０．０４d２．１２±０．０６d０．５６±０．０２c１９．５３±０．２３b０．１６６±０．００６b０．３４±０．００c３．２８±０．０８c０．８５±０．０２b/(??k　锌含量Zncontentmgg)－１/(??k　铁含量Fecontentmgg)/[]　植酸锌摩尔比[PA]Zn/[]　植酸铁摩尔比[PA]Fe２１．８７±０．３０b２１．３７±０．５９a２５．４３±１．１５c２２．３０±１．３２c２２．７８±０．４８b２０．７０±０．１１a２５．２６±１．９８c２３．７８±１．６４c２４．５９±１．２６a２０．５６±０．１４ab３４．３４±１．４８b３５．１１±０．８５b１９．４２±０．０２c１９．６５±０．４３bc４９．４２±１．７７a４１．８１±１．２０a１８．０９±０．２１c１８．９６±０．１６c５３．４８±２．１１a４３．６８±１．７６a　　同一行数字后相同小写字母表示差异未达到５％显著水平.,m,Valueseansofthreerelicatesfollowedbhesameletterwithinarowarenotsinificantlifferentatthe０．０５level．pytgyd/;/.０P－无磷对照;３P－适磷(３mmolL)１２P－高磷(１２mmolL);(/;(/０P,NoPadded３P,OtimumPconcentration３mmolL)１２P,HihPconcentration１２mmolL)．pg图１　不同磷浓度处理下水稻籽粒植酸合成代谢基因的转录表达差异Fi．１．DifferenceintheexressionsofPAＧrelatedgenestoexternalPconcentrationsinricegrain．gp苏达等:外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响１６３图２　植酸代谢相关基因在灌浆水稻籽粒中表达量的变化动态ig．２．TemporalpatternsoftranscriptionalexpressionsofvariousgenesinvolvinginphyticacidbiosynthesispathwayinriceendoＧspermduringgrainfilling．调幅度较明显.不同磷浓度处理相比,RINO１基因在高磷浓度处理(磷对照(与籽粒植酸积累量在不同磷浓度处理下的差异变化０P),但却显１２著P低)下的表达量虽略高于其无于中磷浓度处理(３P),这趋势基本相似,说明RINO１是外源磷浓度处理对水稻籽粒植酸合成及其积累过程产生影响的一个重要调控基因.与之相比,ITP５/６KＧ６和IPK２基因对外源磷浓度异.其中,ITP５/处理的表达响应却因取样时期而６K期Ｇ６基因在培养在高磷浓度处７d时的表达量相对较高,且该时理下(达量显著下调,在培养化不敏感.而IPK２基因则相反１４d时对外源磷处理浓度变１２P)的表,其表达量在培养与培养缺磷和高磷４d时的相对水平较高(浓度处理下(７d时相比),且在调表达(图利用田间动态取样对上述几个关键酶基因在籽１).０P和１２P)呈较明显的上粒灌浆过程中表达量变化进行检测(图基因在水稻籽粒的相对表达量远高于I２T)P,R５PK２等基因的表达水平,这与上述基因在稻穗/INO１６KＧ６和I离体培养条件下相对表达量变化的荧光定量检测结果一致.不同灌浆时期相比,RINO１PC和RPK１基因在籽粒灌浆过程的表达量呈逐渐升高的趋势,其相对表达量在籽粒灌浆的前期略低,而在籽粒灌浆的中后期呈相对较高的表达水平.与之相反,ITP５水平逐渐降低/６KＧ６基因在水稻籽粒灌浆过程的表达,在籽粒灌浆前期的表达量相对稍高,而在籽粒灌浆中后期(花后PK２基因的总２体１d左右)的表达量显著降低;而I表达量均较低,仅在花后条带存在２１d少量表达,灌浆末期几乎检测不出其表达.３　讨论作物籽粒植酸含量受品种基因型和环境生态因素的共同影响[１４]与作物籽粒植酸积累间的关系倍受人们关注.在栽培环境因素中,磷肥施用量.但由于施入土壤中的磷肥往往会与土壤中的２＋３＋和肥利用效率的充分发挥Fe２＋等离子结合形成难溶性的磷酸盐C,a影响其磷、Fe[１１]磷活性以及有效磷含量受其他环境因素.同时磷酸盐的稳定性(如土壤水、分、有机质和温度等)的影响也较大[１６]规大田试验研究施磷水平与籽粒植酸含量间关系往,因此利用常往会受多种生态因素的“干扰”,从而影响了人们对有关问题取得较明确认识.温室水培试验虽然在一定程度上克服常规大田试验的这些缺陷,可较精准地对培养液中的磷供应进行量化,但由于在研究外源磷营养供应与籽粒植酸积累间的关系时,也会受到植株根部磷营养吸收、茎鞘器官转运和再分配等生理环节的影响[１]育的磷营养供给需要,加之维持水稻基本营养生长,这在很大程度上制约了水培发试验条件下磷处理浓度的梯度范围,尤其通过极端磷浓度处理水培对磷营养供应与籽粒植酸及主要矿质元素(如锌、铁)间的关系探讨.稻穗离体培养方法则不受上述因素制约,且磷营养的器官转运与再分配等过程被“剔除”,因而更有利于取得对水稻籽粒植酸含量受外源磷处理的影响规律及其有关生理代谢特征的较明确认识.本课题组建立的水稻长周期穗离体培养方法,在梁建生等[１７]离体培养基础上,培养时间延长至调节的重要技术手段,在同化物运输和分配及其相２０多d,是研究源/５库生理天的关代谢机制和作物品质形成的生理研究等方面具有一定优势.３．１　外源磷处理对水稻籽粒植酸含量和锌/铁营养元素有效性的影响在本研究中,水稻籽粒中的植酸、无机磷和总磷含量随外源磷处理浓度增加总体呈上升趋势,但在高磷浓度下籽粒植酸含量的上升幅度不明显,且水稻籽粒中植酸积累的绝对量在高磷浓度处理下显著F１I包含各类专业文献、幼儿教育、小学教育、生活休闲娱乐、外语学习资料、高等教育、各类资格考试、应用写作文书、外源磷处理对水稻籽粒植酸含量及相关代谢基因表达的影响47等内容。　
　交替灌溉对籽粒蛋白质含量不同的转基因水稻的 生理...含有机质23.2g/kg,有效氮95.2 mg/kg,速效磷22...以往研究表 明,通过对穗部或根系喷施适当浓度外源... 　转基因植酸酶玉有什么作用? 植酸酶可以降解玉米,大豆中大量含有的植酸磷,释放可...植酸酶广泛存在于玉米,小麦,水稻,大豆等许多粮油作物中,人类或动物 对植酸酶有... 　植酸酶对肉鸡生产性能及饲料养分利用率的影响_畜牧兽医_农林牧渔_专业资料。主要...各组基础日粮成分和养分含量相同(除有效磷) 处理1不添加外源磷(负对照组),...《蜂蜜中外源性γ-淀粉酶残留量的测定》,蜂蜜真假测定液,淀粉酶,血淀粉酶,血..
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摘要：本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术,优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。现有技术外源豆血红蛋白基因hemH和lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达效率低,影响莱茵衣藻产氢量的提高。本发明公开了一种对豆血红蛋白基因hemH和lba的密码子偏向性分别优化的方法,并将密码子优化后的hemHc和lbac基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达。本发明的优点是:显著提高了外源重组蛋白的表达量,外源豆血红蛋白hemH和Lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达量提高6.8倍;莱茵衣藻产氢量比转未优化密码子的hemH和lba基因的莱茵衣藻提高22%;本发明适用于具有密码偏向性的更多物种的外源基因表达调控。
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发明(设计)人：
主分类号：
&发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N
1/12申请公布日:
&实质审查的生效IPC(主分类):C12N
1/12申请日:
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&一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下：(1)莱茵衣藻培养：A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种：(a)正常培养条件：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒；50～100ml？TAP培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量：分子筛5×1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；(2)豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因的密码子优化和合成：A、从GenBank中调取序列号为M92427的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆lba基因序列；B、将豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位碱基对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；将优化后的基因命名为hemHc和lbac；分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶SacII的酶切位点序列；在lbac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma？I和Sac？I的酶切位点序列；C、将优化后的hemHc基因和lbac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；(3)hemHc基因和lbac基因的扩增：A、以步骤(2)C合成的hemHc基因和lbac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反应，分别扩增hemHc基因和lbac基因；反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，hemHc基因58℃，lbac基因59℃；退火30s，72℃延伸1.5min；30个循环；72℃延伸15min；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和lbac基因转录表达检测的特异性引物：hemHc基因的特异性引物为：hemHc？P1：5’？atgtcaacagcagctccaaatgaa？3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；hemHc？P2：5’？tatatccaaccttgaagttcacgta？3’，斜体表示SacII酶切位点序列；lbac基因的特异性引物为：Lbac？P1：5’？c？ttatgcttttttaatagctgctgc？3’，斜体表示SmaI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；Lbac？P2：5’？tcc？atggttgcttttactgaaaaacaa？3’，斜体表示SacI酶切位点序列；(4)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：A、将步骤(3)PCR扩增并纯化回收的hemHc基因片段和lbac基因片段分别用限制性内切酶SacII酶切和用SmaI和SacI酶切；将纯化的lbac基因片段通过上述酶切位点用T4DNA连接酶连接质粒cg401？1中的aadA基因之后，形成aadA？lbac融合基因，得到载体cg401？1？lbac；用SacII酶切位点将hemHc基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401？1？lbac中aadA基因之后和lbac基因之前，形成aadA？hemHc？lbac融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401？1？hemHc？lbac；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃，3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒，25土1℃条件下培养24小时；基因抢轰击转化；真空度9.4Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.6Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401？1？hemHc？lbac？DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，25±1℃，100微摩尔光量子/平方米·秒连续光照，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；(5)分析转基因莱茵衣藻中hemHc？lbac基因的整合及其表达：A、hemHc？lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：a、hemHc基因和lbac基因同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为5254bp；未整合的PCR产物是3732bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA？P1：5’？aacatgctaagtttacaagcccgaag？3’；cpDNA？P2：5’？gtctttatgagccgtccccgaag？3’；b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl？DNA提取液0.1mol/L氯化钠，50mmol/L乙二胺四乙酸，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷？盐酸，pH？8.0，，重悬沉淀；加入25μl？10mg/ml的蛋白酶K及25μl？20％十二烷基硫酸钠，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl？5mol/L醋酸钾，静置离心；上清液中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl三羟甲基氨基甲烷？乙二胺四乙酸缓冲液；B、转基因莱茵衣藻中hemHc基因和lbac基因转录的检测：取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemHc基因和lbac基因的特异性引物和扩增hemHc基因和lbac基因所述的PCR条件扩增，进行hemHc基因和lbac基因转录水平的检测；C、转基因莱茵衣藻中重组蛋白hemH和Lba表达量的检测：a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液：50mM三羟甲基氨基甲烷？盐酸pH？8.3含1％曲拉通；上样缓冲液：0.25M三羟甲基氨基甲烷？盐酸，pH？8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸钠；0.25mg？ml？1溴酚兰；12.5％β？巯基乙醇；b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，室温，3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl？β？巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转聚偏氟乙烯膜；分别用抗hemH多克隆抗体和抗Lba多克隆抗体做免疫杂交检测，再对HRP标记的抗体进行化学发光检测；(6)分析重组豆血红蛋白hemH？Lba对莱茵衣藻生长的影响：A、双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃，12000rpm离心10min；取上清，测定665纳米吸光度值及649纳米吸光度值的吸光值；C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L：叶绿素Chl？mg/L＝20.04×OD649+6.10×OD665；(7)分析重组豆血红蛋白hemH？Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：A、黑暗呼吸耗氧和缺硫培养基中耗氧量以及产氢量的检测：B、快速充氩气耗氧和缺硫培养基中产氢量的检测。FSA00021.tif,FSA00022.tif,FSA00023.tif,FSA00024.tif,FSA00025.tif,FSA00026.tif
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