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南京碧波生物科技有限公司
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产品详细描述
2PCR Mix一、产品简介
2PCR Mix2Taq DNA Polymerase2PCR Buffer2dNTPPCRPCRPCRPCRPCR
2PCR MixPCRPCR
反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
过程中每循环的出错几率约为2.2×10-5，对于大于1kb的DNA片断的克隆推荐使用出错几率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase。对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检测，Taq DNA polymerase是最佳选择。
2000rpm20s
0.2ml PCR50 μL
DNA0.1-1&gDNA10-100ngDNA0.1-10ng
(Vortex)2000rpm20s
& Step1()&&& 943min
Step2()&&&&&&& 9430sec
Step3()&&&&&&& 456530sec
Step4()&&&&&&& 721min
Step5() &&&&&&&Go To Step2 for 2535 cycles
Step6() &&&7210min
StepP6() &&4forever
PCRPCRGCPCR
Step4()PCRkb1PCR1kb1PCR2kb2
PCRPCR35PCRPCR
反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
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今日：5 | 主题：263984
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请问，退火温度怎么确定？
请问，退火温度怎么确定？
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这个帖子发布于10年零201天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
PCR的引物Tm分别是61度，69度，怎么设计退火温度？比Tm值小3-10度，是按61度算，还是69度？3x
回复：请问，退火温度怎么确定？
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1.理论上讲退火温度应该低于Tm1-5度,按61度算2.如果这样结果不理想如没有扩出目的片段,可以用更低的温度如50或47等这样可能出现非特异扩增,但如果有目的片段,则提高退火温度直到仅有目的片段3.你的退火温度最高可以用到60或61度
回复：请问，退火温度怎么确定？
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肯定是按小的61算
回复：请问，退火温度怎么确定？
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我的意见是用降落PCR来确定其它条件，然后再做温度梯度PCR来确定退火温度。多数书本上说的退火温度=Tm-（5~10），好象不大好用。我有一对引物，Tm是58度，开始我用53度，P不出。后面做了梯度，发觉最佳退火温度竟然是60度左右。
回复：请问，退火温度怎么确定？
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summerjiangshan 战友:你好!上面的战友已经说的很详细了,我再补充一下:PCR反应条件中温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
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梯度PCR退火温度
上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+)：68.2
Tm(50mM Na+)：46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+)：66.2
Tm(50mM Na+)：44.6
顺便问下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么区别啊?
我该选择哪个Tm啊？
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)&&括号里面的表示盐浓度，盐浓度越高，Tm越高，不过还是根据自己的实际PCR情况而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作参考... : Originally posted by shangrila911 at
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)&&括号里面的表示盐浓度，盐浓度越高，Tm越高，不过还是根据自己的实际PCR情况而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作参考... 我是新手，由于要做梯度PCR摸退火温度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的话，退火温度是不是太低了 : Originally posted by duke188 at
我是新手，由于要做梯度PCR摸退火温度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的话，退火温度是不是太低了... 一般PCR时的退火温度很少选在50°C以下。从你的引物大概是20nt，GC含量在50%左右，退火温度一般在55-60°C。你可以根据这个设计你的温度梯度。 根据你的序列，感觉你正向引物3端GC含量有点高，不过应该没有多大关系，直接做个50， 48,46的TD pcr就没问题！Good luck！ eurofins给出你的引物Tm分别为57.3和55.3，所以我建议你用52 - 55°。我通常都是这么整的，应该没问题的 PCR退火温度做梯度的话，一般采取从高于TM值10℃的温度开始，比如你的TM值是55℃那么你从65℃开始做梯度。另外可以坐下touch down试试，每个循环降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的条带，我是这么做的，供你参考下 : Originally posted by xz at
eurofins给出你的引物Tm分别为57.3和55.3，所以我建议你用52 - 55°。我通常都是这么整的，应该没问题的 谢谢！DNA合成说明书上给的那些Tm没有用么 : Originally posted by hyc_charles at
PCR退火温度做梯度的话，一般采取从高于TM值10℃的温度开始，比如你的TM值是55℃那么你从65℃开始做梯度。另外可以坐下touch down试试，每个循环降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的条带，我是这么做的，供你参考下 谢谢！我们要摸出退火温度做定量PCR 应该有用，但是我之前我用的公司的合成引物没有这个信息，所以我也不知道你这个对退火温度的选择有什么作用 : Originally posted by xz at
应该有用，但是我之前我用的公司的合成引物没有这个信息，所以我也不知道你这个对退火温度的选择有什么作用 嗯，说明书上给的Tm不适合实验，不知道为什么 : Originally posted by xz at
应该有用，但是我之前我用的公司的合成引物没有这个信息，所以我也不知道你这个对退火温度的选择有什么作用 嗯，说明书上给的Tm不适合实验，不知道为什么&& 查看话题
PCR中退火温度的选择
在合成的报告单中写着
Tm（1M Na+） 64.9
Tm（50nM Na+） 43.3
Tm（1M Na+） 66.8
Tm（50nM Na+） 45.2
软件推荐的是 55.3
我应该怎么选择退火温度
引物合成单上普遍偏高，而且要看你有没有加酶切位点，如果加了，肯定偏高，你先试一下55吧，或者直接做Touchdown Tm（50nM Na+） 45.2
上调十度左右左PCR合适，个人觉得有时候没必要去纠结这么多，直接做吧，能做出来就好。
各种软件计算Tm的方式有点小差异，要找到的根本才能更好的分析吧 为什么不做一个退火温度的梯度？我们用的是伯乐PCR仪，里面自带退火温度梯度选择功能，就是你设定一个温度范围，比如说53~63°C，然后系统自动给出一个8个梯度的不同温度，然后你可以全做，也可以选择几个你大概推测合适的温度做PCR，这样结果出来不是更准确么？ 上下游tm值的平均数减去5就是最佳tm值。 做个退货温度的梯度 还是做个梯度PCR摸索一个适合的温度吧~ 我也做过，一般订回来的引物那就是在上下游tm值的平均数减去5就是最佳tm值，这个值上做个梯度左右波动！！看看选择最佳的退火温度 同意楼上观点。我也是这么做的。 做TDPCR。。。在TM-5°后，做TDPCR...我们一般都这样做的，pcr退火温度是根据什么原则设计的_百度作业帮
pcr退火温度是根据什么原则设计的
pcr退火温度是根据什么原则设计的
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,这就使PCR后期的过程成为可能.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃.设定Tm有几种公式.有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物.有的是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法.这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性.大部分计算机程序使用近邻分析法.Tm值除了用软件之外,还可以这个公式：2（A+T）+4（C+G）,然后减5—10度根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大.因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点.可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成.为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值.引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃ 或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环.这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.另外,由于PCR仪的不同,注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围,所以你的梯度范围尽可能设置宽一点,争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度.具体从多少度到多少度,要看你这对引物的Tm值,如果两个引物Tm值不高,可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等,则可以设置53-65的梯度范围,具体情况灵活掌握.传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的,需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的,尤其是第2、3孔与第1孔接近,第10、11孔与第12孔接近.可以舍弃第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品,孔间温度变化几乎呈真正的梯度状.
DNA在高温时可以发生变性解链，温度降低后又可以复性成为双链。退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。然后是延伸，DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。...