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是以siRNA/miRNA产品制造和销售、非编码RNA技术和药物开发为核心的生物高新技术企业。
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&&& miRNA是一类内源性非编码小RNA分子，长约20-23个核苷酸，预测有1/3的人类基因被miRNA调控，并且在物种间有非常高的同源性。研究表明，miRNA参与了几乎所有生命活动，包括细胞增殖和凋亡、器官生成、个体发育、造血、脂肪代谢等。目前，miRNA检测方法包括Biochip，qPCR， Northern Blots',
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今日：16 | 主题：264231
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【求助】如何设计用茎环PCR检测miRNA的引物
血液科(医学生)
【求助】如何设计用茎环PCR检测miRNA的引物
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这个帖子发布于2年零201天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:10
最近在做miRNA的茎环PCR，但是引物设计却是一个大问题，导致实验不能顺利开展，买公司设计好的引物又经费有限，特此向各位战友请教。我收集了一些资料，主要有下面一些说法1.逆转录的茎环引物：在一个茎环结构上添加与microRNA3‘端互补的6个碱基即可，但是也有文献说与目的miRNAme互补的碱基不能低于7个，纠结，还有关于这个茎环结构的选择，有什么讲究吗？比如说下面这两个茎环结构哪个好呢?1)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 2)GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC2.realtime PCR forward primer ：关于这个引物的设计一直在纠结，各有各的说法3.realtime PCR reverse primer 这个是个通用引物，我的理解这个引物是跟第一部分茎环RT引物互补的引物序列，所以是“通用引物”关于miRNA的引物设计，还请战友指点一二，谢谢了！
doctorcck edited on
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doctorcck 最近在做miRNA的茎环PCR，但是引物设计却是一个大问题，导致实验不能顺利开展，买公司设计好的引物又经费有限，特此向各位战友请教。我收集了一些资料，主要有下面一些说法1.逆转录的茎环引物：在一个茎环结构上添加与microRNA3‘端互补的6个碱基即可，但是也有文献说与目的miRNAme互补的碱基不能低于7个，纠结，还有关于这个茎环结构的选择，有什么讲究吗？比如说下面这两个茎环结构哪个好呢?1)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 2)GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC2.realtime PCR forward primer ：关于这个引物的设计一直在纠结，各有各的说法3.realtime PCR reverse primer 这个是个通用引物，我的理解这个引物是跟第一部分茎环RT引物互补的引物序列，所以是“通用引物”关于miRNA的引物设计，还请战友指点一二，谢谢了！1.我们用的一般是6个碱基，基本都能扩出来，有时候参数根据情况也可能增到7-8个，只要不和forward primer 有重合的碱基，茎环好像一般有两种，我们用的是CAGAGCCA这种。2.realtime PCR forward primer 一般取目标序列5‘的前14个碱基，有时可能会减到12个，前面再根据GC含量和Tm高低补6个到8个左右的游离碱基3.你的理解是对的，这个是固定的，取决于你选用的逆转录引物我们参照的就是下面的文献，你可以看看，写的挺清楚的还有这个希望对你有帮助
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miRNA qPCR实验检测流程示例
microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。
迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。
miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程
二：背景资料
检测人脑组织中miRNA的表达。
所选的miRNA及其扩增长度信息如下：
hsmq-0031_01
MIMAT0000069
has-miR-16
hsmq-0032_01
MIMAT0000422
hsa-miR-124
hsmq-0033_01
MIMAT0000443
hsa-miR-125a-5p
hsmq-0034_01
MIMAT0000423
hsa-miR-125b
hsmq-0035_01
MIMAT0000429
hsa-miR-137
hsmq-0036_01
MIMAT0000250
hsa-miR-139-5p
hsmq-0037_01
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hsa-miR-145
hsmq-0038_01
MIMAT0000450
hsa-miR-149
hsmq-0039_01
MIMAT0000439
hsa-miR-153
hsmq-0040_01
MIMAT0000452
hsa-miR-154
hsmq-0041_01
MIMAT0000259
hsa-miR-182
hsmq-0042_01
MIMAT0000261
hsa-miR-183
hsmq-0043_01
MIMAT0000458
hsa-miR-190
hsmq-0044_01
MIMAT0000276
hsa-miR-219-5p
hsmq-0045_01
MIMAT0000077
hsa-miR-22
hsmq-0046_01
MIMAT0000082
hsa-miR-26a
hsmq-0047_01
MIMAT0000100
hsa-miR-29b
hsmq-0048_01
MIMAT0000244
hsa-miR-30c
hsmq-0049_01
MIMAT0000441
hsmq-0050_01
MIMAT0000689
hsa-miR-99b
hsnRNA-U6_01
三：实验内容
RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析
四：实验主要仪器和试剂
主要实验仪器
冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System
主要实验试剂
TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、
miRNA qRT-PCR Detection Kit：GeneCopoeia (Cat. No. AOMD-Q050 )
五：实验操作
为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行
利用miRNA qRT-PCR Detection Kit进行实验检测的流程示意图
图1：miRNA qPCR Detection流程示意图
Total RNA抽提
取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。
（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。
室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。
小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。
去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。
风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。
RNA浓度测定
吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。
Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）
RNA电泳检测
7.1&变性胶制备
取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2&电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中
7.3&RNA样品处理
取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4&RNA电泳
先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。
RNA抽提结果
8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：
RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD260/OD280
miRNA 3’端进行加“Poly A”处理
融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL
2.5U/μLPolyA Polymerase
10×PolyA Polymerase Buffer
10×rATP Solution
ddH2O(RNase/DNase free)
在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。
混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。
Poly A化的RNA进行反转录反应
融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
RNA-Primer Mix 的配制反应
在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL
PolyA反应液
25×Oligo dT Adaptor
ddH2O(RNase/DNasfree)
Final Volume
混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。
配制反转录反应液
在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。
RNA-Primer
5×RT Reaction
25U/μL RNase
200U/μL M-MLV RTase
(RNase H free)
ddH2O(RNase/DNase free)
Final Volume
反转录反应
混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。
所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。
qPCR 检测miRNA.
miRNA检测引物设计
miRNA qRT-PCR Detection Kit中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。
miRNA qPCR Forward Primer 设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：
在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如下图所示：
miRNA Database：
则其Forward 检测引物可为：
tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）
融解2×AllinOneTM qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）
2×AllinOneTM qPCR Mix
qPCR Forward Primer（2μM）
Universal Adaptor PCR （2μM）
1st strand cDNA（diluted 1:5）
Final Volume
2×AllinOneTM qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
Rox Reference Dye 使用在需要用Rox 校正的Real-Time
PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
1st Strand
cDNA 通常需要稀释后再使用 ，防止反转录体系对qPCR体系的影响。
充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）
对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）
70℃～95℃
2×AllinOneTM qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。
进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。
以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器，如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。
六:结果分析
20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果
融解曲线图
扩增曲线图
20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值
hsmq-0031_01
has-miR-16
hsmq-0032_01
hsa-miR-124
hsmq-0033_01
hsa-miR-125a-5p
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hsa-miR-99b
hsnRNA-U6_01
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miRNA作为一种重要的基因表达调控因子，其研究可从三方面入手：miRNA表达谱检测，miRNA靶点分析，miRNA功能筛选。
图1& miRNA研究的主要方法及切入点 &
miRNA研究领域特点
※miRNA功能研究（miRNA-靶点-细胞表型）
※miRNA与信号通路的关系（miRNA-靶点-信号通路）
※miRNA与重要基因的关系（靶基因-miRNA）
※miRNA与干细胞（miRNA-靶点-干细胞维持及分化）
※miRNA与肿瘤（肿瘤-miRNA-靶点）
※miRNA与白血病（白血病-miRNA-靶点）
※miRNA与生物的遗传发育（miRNA-靶点-遗传发育）
a)&& &miRNA表达检测
●&& &miRNA 的qRT-PCR检测
准确检测细胞或实验动物组织中miRNA的表达对研究者来说至关重要， 可帮助研究者更快地切入miRNA的功能研究，在病理组织或血液中的miRNA表达谱检测有助于分析miRNA与疾病的相关性，为开发miRNA作为疾病诊断及治疗生物标志物，和miRNA为基础的药物开发奠定基础。锐博生物针对miRBase19.0数据库中人、小鼠、大鼠所有的miRNA，设计 Bulge-Loop? miRNA qRT-PCR 引物套装，提供对细胞、组织或血液中的miRNA的qRT-PCR全套技术服务。
●&& &miRNA表达谱芯片检测
miRNA芯片检测服务是检测总RNA样品中miRNA的表达谱。利用miRNA芯片以及总RNA (Total RNA) 为样品，进行一连串实验操作与资料分析，即可检测出数千miRNA表达谱，分析表达谱数据中出现差异与共表达的miRNA。
●&& &miRNA深度测序
采用新一代测序技术平台，能够直接对样本中指定长度的miRNA分子进行高通量测序，可以在无需任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA的表达谱，并发现和鉴定新的miRNA分子，提供更加全面的miRNA表达研究方法，加速新miRNA的发现，是当前miRNA表达研究的有力工具。
b)&& &靶点分析
●&& &miRNA靶基因3'UTR载体
使用报告基因检测系统专门用来检测miRNA与靶基因的结合活性。报告系统包含SV40启动子驱动的报告荧光(hRluc)，其下游构建了靶基因3'UTR区域，通过对该荧光的监测，即可验证miRNA对该靶标是否有调控作用。
pmiR-RB-Report?报告基因检测系统专门用来检测miRNA与靶基因存在调控作用的可能性，该报告系统报告荧光(hRluc)，其下游构建了靶基因3'UTR区域，通过对该荧光的监测，即可验证miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光(hluc) 作为稳定内参，用于监测质粒表达效率。目前pmiR-RB-Report?报告基因检测系统覆盖人源的数百个基因。
●&& &miRNA靶基因验证
将miRNA模拟物(miRNA mimic)与pmiR-RB-Report?报告基因质粒载体共转目的细胞系，通过萤火虫荧光素酶的活性分析，即可获得miRNA对潜在靶基因的调控作用的验证数据。
c)&& &miRNA功能筛选
●&& &miRNA表达载体构建
miRNA质粒表达载体是将发卡结构的pre-miRNA或者pri-miRNA构建在含特殊启动子的质粒表达载体，该载体转入细胞后可利用细胞内的miRNA加工成熟机制获得成熟的miRNA并发挥作用。
●&& &miRNA功能研究
miRNA功能研究通常在细胞内或体内进行，并与细胞表型(如细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等)和基因表达分析相结合。
●&& &miRNA的生物信息学分析
miRNA参与复杂的基因调控，生物信息学工具可以在表达谱芯片数据分析与深度挖掘、高通量测序数据分析、靶基因预测、调控网络构建等方面取得快速高效的分析结果。 表1&miRNA生物信息研究策略
靶基因预测
生物芯片荟萃分析；
多种算法软件预测
发现靶基因
靶基因功能
靶基因GO（功能富集）分析
发现生物功能
靶基因生物通路研究
pathway生物通路分析：挖掘靶基因可能参与的生物通路
发现miRNA参与的生物通路和功能
miRNA调控靶基因网络
miRNA调控网络构建
寻找miRNA作用的关键基因
miRNA的表达
miRNA芯片表达分析
miRNA表达水平
miRNA及其靶基因的作用分析
miRNA芯片表达差异
上调/下调的靶基因
& &&&& 图2多个数据库预测的miRNA靶基因的Venn图（from RIBOBIO CO.，LTD） & &&&&&&&& 图3 miRNA调控网络（from RIBOBIO CO.，LTD） & 锐博生物提供miRNA研究的全套产品和服务： &
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