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狂犬病毒反向遗传学技术的研究及应用进展
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——关于反向遗传构建A组轮状病毒重配毒株的研究
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——关于反向遗传构建A组轮状病毒重配毒株的研究
官方公共微信1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立--《南方医科大学》2012年博士论文
1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立
【摘要】：研究背景和目的
丙型肝炎病毒(HCV)引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻微到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后将进展为肝硬化甚至肝癌。目前全球约有一亿八千万人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性化率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防。丙型肝炎治疗的关键是抗病毒治疗,国际上公认的治疗方案为：聚乙二醇化干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林,平均持续病毒学应答率(SVR)为56%左右。研究发现不同的基因型抗病毒治疗方案、疗程不同,且抗病毒治疗的应答率也存在差异。如HCV1b型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林(1000mg/d)联合治疗至少需要48周,SVR约为15%-50%；HCV2/3型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林(800mg/d)联合治疗仅仅需要24周,SVR约为80%。我国主要的HCV流行基因型为1b型,但值得注意的是,即使均为HCV1b型感染者,对干扰素治疗的结果也可截然不同。部分HCV1b型患者经抗病毒治疗后可达到SVR甚至痊愈,另一部分则疗效极差。虽然近期两个新型的蛋白酶抑制剂Boceprevir和Telaprevir已经被批准用于临床,但其远期疗效还有待评价。因为HCV感染呈现慢性、隐匿的特点,随着病程的进展,丙肝相关性终末期肝病患者的数量在未来二十年内将继续增长,迄今仍是世界性的医学、社会难题和经济负担。为何部分HCV1b型患者对抗病毒治疗反应良好,能够痊愈,另一些则反之?究竟哪些因素与丙型肝炎患者抗病毒治疗疗效预测的关系密不可分?如何更有效、更合理地使用干扰素进行抗病毒治疗、提高丙肝抗病毒治疗的疗效?这是目前慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗研究的热点和难点。
HCV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,全长约9.6kb,包括一个大的开放阅读框及两侧的5,和3’非编码区,可以编码约3000个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译后,前体多聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分为结构蛋白(C、E1、E2、p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。因为HCV所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能,其基因组序列呈高度异质性,不同的分离株在全基因序列上差异达30%-35%。一直以来,由于缺乏实用的动物模型和有效的HCV体外细胞培养系统,严重影响了HCV复制机制、疫苗研制及新HCV防控策略的研究。
1999年,HCV体外细胞培养研究取得了阶段性进展,Lohmann等构建了带新霉素磷酸转移酶基因作为筛选标志的HCV亚基因组(删除了结构基因,从C到NS2及P7)复制子,这是一个双顺反子结构,第一个顺反子由HCV IRES引导,第二个顺反子(NS2-5B)由插入的脑心肌炎病毒(EMCV) IRES引导。用体外转录的RNA转染Huh7细胞,在硫酸新霉素(G418)的筛选下,获得了少数细胞克隆。复制子刚转染细胞后,其复制子水平较低,随着不断传代,其RNA复制水平明显提高,经序列分析表明高复制的复制子发生了较多的适应性突变。经实验证实,重要的适应性突变有10余处,散布于整个多蛋白编码区,尤其以表达病毒RNA聚合酶的NS5A区较集中,且不同的适应性突变具有协同效应。适应性突变是复制子在特定细胞内培养取得成功的关键之一,它通过增强宿主细胞活化分子与其结合以及去除细胞抑制因子与其相互作用而有利于复制子的复制和表达。随后,一些其他基因型的HCV复制子,如HCV1a (H77)、2a (JFH1)等复制子均被报道。复制子部分揭示了HCV与宿主细胞间复杂的相互关系,对HCV的基础研究和抗病毒药物筛选具有重要意义,特别是在新的抗HCV药物如NS3与NS4蛋白酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂的研发中的发挥了重要作用。然而由于不含结构基因,非结构基因复制子在细胞培养系统中不能产生完整的HCV颗粒,难以满足深入研究HCV生物学特点、特别是针对结构基因的保护性抗原的鉴定和疫苗研制,以及全方位筛选抗病毒药物的需要。因此,很多研究者致力于建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统。
2005年,Wakita等、Zhong等和Lindenbach等分别成功地建立了HCV2a型全长基因体外细胞培养系统。而且由此产生的病毒颗粒可在细胞内连续传代而感染性不会减低,获得了稳定的、可产生高效感染性病毒颗粒的体外细胞培养系统。在此基础上,HCV细胞培养技术取得了突飞猛进的发展并广泛的应用于相关研究中。虽然近年来这些方面的研究有很大进展,但是仍然有很多亟待解决的问题。目前已经建立的有效地HCV体外培养系统,基本都是在JFH1(2a型)毒株的基础上发展起来的,而我国丙型肝炎的主要流行毒株是1b型,与国外建立的细胞培养系统所用的HCV基因型不同。HCV1b型全基因细胞培养系统难点较多,研究进展较缓慢,但不少学者也在此方面做了很大努力。2005年Heller T等构建了HCV1b基因型全长cDNA,两端加有核酶后克隆至真核表达载体,转染Huh7.5细胞,可以检测到病毒的复制,蛋白的表达,并能够获得感染性病毒颗粒,但是该系统产生的病毒颗粒感染性很不理想。国内一些学者将含1b型HCV全长cDNA的重组质粒和高效表达T7RNA聚合酶的vTF7-3共转染细胞,通过vTF7-3表达T7RNA聚合酶的辅助作用,可使细胞高效产生HCV RNA,并发现病毒颗粒的产生。但该系统生产的重组HCV颗粒中含有痘病毒的污染,给病毒颗粒的分离纯化带来不便,且vTF7-3也有一定的细胞毒性,在以痘病毒为辅助病毒的体系中,细胞很快死亡,故在每次培养HCV是,都须重复进行细胞培养、转染重组质粒和感染痘病毒等操作,过程繁琐,实验安全性也存在一定的隐患。此外,这两个体系都需要辅助质粒或重组病毒提供凡是启动子激活物和加工因子,HCV核酸的初始复制也非RNA病毒复制的自然状态,而是以质粒DNA为模板的转录,故最为HCV复制机制和抗HCV药物的筛选平台,其作用受到限制。至今,国内尚未见到关于HCV1b型细胞培养系统完全成功的报道。
本研究旨在通过HCV完整半基因组扩增测序的方法分析病毒基因变异对PEG-IFN联合利巴韦林治疗1b亚型慢性丙型肝炎疗效的影响,试图阐明病毒基因组变异对干扰素疗效方面发挥的作用；并在此基础上,用已发生适应性突变的HCV1b复制子来插入HCV1b结构基因以建立我国流行株1b型全基因HCV细胞培养系统,为我国丙型肝炎发病机制的研究,HCV结构基因中保护性抗原的鉴定及疫苗的研制、研发抗HCV新药和新疗法、高通量筛选已见临床疗效的药物、药物单体,探索新的联合用药方案以提高疗效,并阐明疗效机制提供良好的平台。
第一章HCV5’端半基因组的扩增及其序列变异对PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响
收集慢性丙型病毒性肝炎患者治疗前血清标本,纳入研究的61例患者诊断符合《丙型肝炎防治指南》抗病毒治疗标准,所有患者均为1b型HCV病毒感染,并完成PEG-IFN联合RBV抗病毒治疗48周且随访24周,其中获得持续性病毒学应答(SVR组)的患者35例,未获得持续性病毒学应答(Non-SVR组)的患者26例。采用长片段RT-PCR法扩增包括完整核心蛋白至NS3蛋白的HCV5’端5.2kb半基因组序列,测序后分析病毒基因组序列变异与抗病毒疗效之间的关系。
统计学分析：计量资料采用独立样本t检验,计数资料采用X2检验；SVR组和Non-SVR组总氨基酸变异个数和特异性氨基酸变异个数的比较采用Mann-Whitney U检验；而特异性变异占总氨基酸变异的百分比使用X2检验。两组熵值的比较采用Mann-Whitney U检验；平均基因组距离采用独立样本t检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件。
中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效。我们分别比较了两组患者1b型HCV半基因组氨基酸变异总数和特异性氨基酸变异情况,中国CHC患者治疗前体内病毒氨基酸的变异性与抗病毒疗效相关,且氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。SVR组患者P7、NS2和NS3蛋白的特异性氨基酸变异个数(P=0.036,P0.001和P=0.006)、特异性氨基酸变异的比例(P0.001,P0.001和P0.001)、熵值((P=0.019,P=0.023和P=0.046)以及基因组距离((P0.001,P0.001和P=0.011)均显著高于Non-SVR组。
第二章HCV1b replicon细胞培养系统的建立
我们以两个获赠的1b复制子质粒为基础,构建在Huh7.5.1细胞内能够长期、稳定、高拷贝复制的亚基因组复制子细胞培养系统。其一是1b-G复制子质粒,该复制子含有HCV Conl分离株NS3-NS5B非结构基因的cDNA序列,在NS5A区含S2204I适应性突变。其二是lb-H复制子质粒,该复制子与1b-G相比,在新霉素抗性基因的上游插入了一个荧光素酶报告基因以方便检测,且其适应性突变位于NS3区的E1202G和T1280I,以及NS4B区的K1846T。具体方法是,将Scal酶切的线性化1b-H复制子和1b-G复制子质粒为模板,在T7RNA聚合酶的作用下,体外转录出复制子RNA,然后将此RNA转染至Huh7.5.1细胞,以含800μg/ml G418的培养基进行筛选,根据克隆形成情况对克隆进行分离培养,然后用RT-PCR、间接免疫荧光、Western Blot和荧光素酶检测等方法对克隆细胞中的HCV核酸和蛋白进行检测。
用1b-H和1b-G复制子转染Huh7.5.1细胞后,都获得了G418抗性克隆,并在最终分离出的细胞克隆中,检出HCV复制子特异性的RNA和NS5A蛋白。由于lb-H复制子中含有荧光素酶报告基因,我们通过检测报告基因的表达活性来分析病毒的复制水平,代替繁琐的RT-PCR和Western Blot检测方法,较好地方便了实验研究。
第三章我国N型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立
选取两例“难治性丙肝”患者血清,扩增HCV5’端半基因组序列并构建克隆,选取15-20个克隆进行测序分析病毒准种的优势株；选取优势克隆株质粒,通过重叠延伸PCR的方法引入合适的酶切位点,再通过酶切连接的方法,以完整的Core-NS2区基因替换复制子中的外源性基因序列,从而构建HCV1b全长cDNA重组质粒；然后将全长cDNA克隆经Scal酶切线性化,在T7RNA聚合酶作用下体外转录制备全长HCV RNA,并转染Huh7.5.1细胞,荧光定量RT-PCR检测细胞上清和细胞内HCV RNA, Western Blot方法检测病毒蛋白的表达,间接免疫荧光法检测病毒蛋白的表达以及含病毒细胞上清的感染性。
本研究在lb replicon的基础上,将来源于中国患者血清病毒的完整结构基因(core-p7)和部分非结构基因(NS2及NS3)插入复制子,成功构建了四个不同的1b型HCV全长cDNA克隆。将这些1b型HCV RNA转染Huh7.5.1细胞后,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。经比较后发现,我们构建的1b-H-P2、1b-H-80和1b-G-P2、1b-G-80在非结构基因区适应性突变的不同导致它们RNA复制水平有所不同,在一定程度上也说明不同的适应性突变位点之间存在协同作用。
本研究表明中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效,氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。完整扩增HCV5’端半基因组为构建HCV全长细胞培养系统打下了基础,并且序列分析的结果为HCV蛋白与干扰素抵抗的体外研究实验提供了线索。同时我们成功建立了针对我国人群易感染的HCV lb亚型体外复制子的细胞模型,不仅为本实验室HCV致病机制的研究及对抗病毒药物的评价提供了一个新的途径,也为下一步建立1b型HCV全长细胞培养系统提供了一个良好的技术平台。
在1b-H和1b-G复制子的基础上,我们成功构建了4个1b型HCV全长cDNA质粒,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。分析原因,可能是由于病毒在装配和释放的过程中,某些环节存在未能阐明的问题,导致产生的病毒颗粒感染活性低下；也可能是因为所构建的cDNA还存在某些缺陷,不能产生完整的病毒颗粒。为了排除后一种原因,我们使用已经明确在痘病毒辅助系统辅助下能有效复制并产生感染性病毒颗粒的1bHCV cDNA为模板,重新构建1b型HCV全长cDNA,转染细胞后仍然未能获得感染性病毒颗粒。此结果表明,我们构建的1b型全长cDNA不具有感染性与基因序列缺陷无关。病毒在细胞中能否成功复制与装配,是病毒与细胞相互选择的结果,但细胞环境复杂,蛋白与细胞因子众多,因此影响1b型HCV感染性细胞培养系统成功建立的因素有待进一步研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R512.63【目录】：
摘要3-10ABSTRACT10-21绪论21-35 0.1 HCV的分子生物学特征21-25 0.2 丙型肝炎病毒感染周期与病毒RNA的复制25-27 0.3 HCV复制子系统27-29 0.4 HCV全长细胞培养系统29-31 0.5 支持HCV复制子及HCV全长基因组复制的细胞系31-32 0.6 1b型HCV全基因细胞培养系统的研究现状32 0.7 本研究的目的和意义32-33 0.8 总结与展望33-35第一章 HCV 5’端半基因组的扩增及其序列对PEG-IFN/RBV治疗1 b亚型CHC疗效的影响35-53 1.1 材料和方法35-41
1.1.1 材料35-38
1.1.2 方法38-41 1.2 结果41-49 1.3 讨论49-53第二章 HCV 1b replicon细胞培养系统的建立53-75 2.1 材料与方法53-67
2.1.1 材料53-56
2.1.2 方法56-67 2.2 结果67-71 2.3 讨论71-75第三章 我国丙型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立75-102 3.1 材料和方法75-91
3.1.1 材料75-77
3.1.2 方法77-91 3.2 结果91-96 3.3 讨论96-102参考文献102-114攻读硕/博士学位期间主要成果114-117致谢117-120附件120
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【参考文献】
中国期刊全文数据库
王小红;熊瑜琳;李俊刚;谭朝霞;胡亚君;;[J];第四军医大学学报;2006年09期
黄辉红;周元平;杨洁;曾艳丽;魏君锋;彭劼;吴英松;黎诚耀;刘叔文;侯金林;;[J];广东医学;2010年07期
姚相杰,郭佳,郑从义,方呈祥,屈三甫,陈震球,李中红,李信墙,李卫云;[J];科学通报;2004年10期
;[J];中华肝脏病杂志;2004年04期
吕琪;郑义;宋林立;李忠新;李瑜珍;周小梅;;[J];中国病原生物学杂志;2006年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
胡志军;丁辉;汪晓军;;[J];北京中医药;2012年03期
严军雄;黄露;伍武彪;;[J];中国输血杂志;2008年08期
邵圣文;徐伯赢;卢添宝;徐菊玲;顾福萍;段劲;;[J];重庆医学;2011年09期
周志涛,吴英松,李明;[J];第一军医大学学报;2005年04期
魏君锋;张太松;黄辉红;曾艳丽;张帆;王俊洁;周斌;吴英松;刘叔文;侯金林;郭亚兵;周元平;;[J];南方医科大学学报;2010年10期
李京涛;周斌;周元平;曾艳丽;李威;王俊洁;张健;张浩;刘叔文;;[J];南方医科大学学报;2012年01期
李瑜元;;[J];广东医学;2008年07期
郭顺明,聂青和;[J];实用肝脏病杂志;2005年03期
独晓勤;李红兵;唐谦;樊万虎;;[J];实用肝脏病杂志;2010年03期
王柏芳;王颖;王炳元;王菲;李雪华;;[J];实用肝脏病杂志;2012年03期
中国博士学位论文全文数据库
张立新;[D];山东大学;2011年
刁青蕊;[D];南京中医药大学;2011年
史华新;[D];湖北中医药大学;2011年
高博;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
吕欣;[D];第四军医大学;2005年
高明;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
苏海霞;[D];第四军医大学;2007年
王俊文;[D];北京中医药大学;2008年
张丽颖;[D];吉林大学;2009年
罗源;[D];第二军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
张岱;[D];中国医科大学;2010年
张小丽;[D];南京医科大学;2011年
刘玲玲;[D];南华大学;2011年
刘翠萍;[D];郑州大学;2011年
李军;[D];郑州大学;2011年
魏君锋;[D];南方医科大学;2011年
郭艳;[D];第三军医大学;2011年
苏峥;[D];河北医科大学;2005年
张帆;[D];第三军医大学;2005年
孙梦宁;[D];第四军医大学;2006年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
张瑞;李俊强;刘丽君;杜绍财;魏来;;[J];北京大学学报(医学版);2006年06期
张帆,王小红,王宇明,熊瑜琳,陈嵩,谭朝霞;[J];第四军医大学学报;2005年14期
郑义,高博,景维,孔令保,杨晓俊,吴正辉,叶林柏;[J];中国病毒学;2005年04期
康来仪,孙永德,郝连杰,曹学义,潘启超;[J];中华传染病杂志;1997年02期
中华医学会传染病与,寄生虫病学分会,肝病学分会;[J];中华肝脏病杂志;2000年06期
谢尧,徐道振,陆志檬,骆抗先,贾继东,王宇明,赵桂珍,张树林,张大志;[J];中华肝脏病杂志;2004年02期
庄辉,Tracy L,崔怡辉,凌斌华,张玲霞,Bowden S;[J];中华流行病学杂志;2001年02期
;[J];中华流行病学杂志;2004年05期
毛红霞,胡芸文,吴瑛,兰水云,袁正宏;[J];中华实验和临床病毒学杂志;2004年02期
唐小平,吴婉芬,袁小珍;[J];中华微生物学和免疫学杂志;1997年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
吕凌;;[J];国外医学.内科学分册;1990年11期
Tabor E;侯莉;张景云;;[J];国际流行病学传染病学杂志;1992年04期
陈华忠,蔡修熙;[J];中西医结合肝病杂志;1993年02期
陈雷;曹爱琴;李继忠;韩维淑;计雪文;;[J];中原医刊;1993年05期
于建国;马国华;徐学芳;;[J];泰山医学院学报;1993年03期
李玉雨;李英信;李燕;李景源;金相哲;金海顺;白鹤贤;张金玉;吴京淑;;[J];延边大学医学学报;1993年01期
金兆伟;张灵麟;;[J];预防医学情报杂志;1993年04期
王瑞,崔金凤,黄临萍;[J];实用医技杂志;1994年01期
杨翔;;[J];国外医学(微生物学分册);1994年06期
郑祖英;;[J];健康博览;1995年07期
中国重要会议论文全文数据库
蔡春;张婧;常乐;刘家云;程晓东;苏明权;师长宏;贾战生;;[A];中华医学会第五次全国艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全国热带病学术会议论文汇编[C];2011年
计丹英;崔文英;丁嘉祥;张月;郭王;刘文虎;;[A];全国内科护理学术交流会议、全国心脏内、外科护理学术交流会议、第9届全国糖尿病护理学术交流会议、第9届全国血液净化护理学术交流会议论文汇编[C];2011年
龚作炯;;[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年
汪年松;盛晓华;张晓光;严艳;俞岗;崔勇平;唐令诠;;[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
李婷婷;陈姿喧;曾劲峰;章金刚;王文敬;边奕鑫;黎诚耀;;[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集（摘要篇）[C];2010年
戚中田;赵平;;[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
张贺秋;王国华;陈坤;徐元基;夏芳;凌世淦;陈德蕙;;[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学分会第十次形态科学与显微注射技术学术研讨会论文摘要集[C];2000年
张贺秋;王国华;陈坤;徐元基;夏芳;凌世淦;陈德惠;;[A];面向二十一世纪的生物医学体视学和军事病理学论文摘要汇编[C];2000年
苑宇哲;季阳;杨秀华;高蕾;黄毅;汪学纯;潘志红;;[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集（摘要篇）[C];2010年
张申英;张欣欣;刘晶;卢敏;汪垣;;[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库
记者贾晓惠
通讯员黄显斌
唐明山;[N];科技日报;2002年
王江;[N];科技日报;2000年
张新生;[N];科技日报;2008年
李向;[N];卫生与生活报;2009年
姚雨;[N];医药经济报;2009年
张加;[N];中国医药报;2010年
梓桦;[N];医药经济报;2003年
张汝金　肖鑫　本报记者　黄华敏;[N];解放军报;2002年
庄愉;[N];医药经济报;2010年
刘浦泉;[N];科技日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库
李卫华;[D];四川大学;2005年
洪沙;[D];第四军医大学;2005年
胡巍;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
郑义;[D];武汉大学;2005年
许信刚;[D];西北农林科技大学;2005年
张立新;[D];山东大学;2011年
温晓玉;[D];吉林大学;2008年
吕欣;[D];第四军医大学;2005年
叶力;[D];武汉大学;2005年
宋春辉;[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库
姜翠;[D];吉林大学;2013年
吉瑾;[D];西北农林科技大学;2010年
马寅众;[D];武汉工业学院;2012年
李宁;[D];辽宁中医学院;2005年
朴莲淑;[D];延边大学;2006年
汤兆明;[D];福建医科大学;2005年
赵月鸣;[D];吉林大学;2006年
许小亮;[D];暨南大学;2006年
梁勇;[D];安徽理工大学;2006年
沈才飞;[D];第四军医大学;2006年
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matrix蛋白和g蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建及生物学活性观察
construction .
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construction and characterization of recombinant vsv with dou
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matrix蛋白和g蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建
官方公共微信一种新型慢病毒载体制备体系的改进--《热带医学杂志》2011年08期
一种新型慢病毒载体制备体系的改进
【摘要】：目的完善已初步建立的以痘病毒为辅助病毒的慢病毒载体(LV)瞬时制备体系。方法通过同源重组质粒pZIPPY-NEO/GUS,将vTF7-3痘病毒D13L基因的ORF通过同源重组被新霉素基因(neo)以及可视性筛选基因(GUS)替代,制备D13L缺陷性痘病毒(vTF7-3-ΔD13L)。结果经RT-PCR鉴定,D13L基因被完全敲除。制备体系中将vTF7-3-ΔD13L代替vTF7-3后,制备体系培养上清经RT-PCR、Western blotting分别检测到慢病毒载体特异性RNA序列以及特征性p24蛋白的存在,提示系统可以正常制备出慢病毒载体颗粒,并进一步评价了慢病毒载体的感染性。此外,对此系统的动力学特征也进行了初步分析。结论 vTF7-3-ΔD13L制备成功,通过此系统可制备出没有复制性痘病毒污染的慢病毒载体,本研究为该系统的大规模应用奠定了客观基础。
【作者单位】：
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【分类号】：R346【正文快照】：
本研究团队以慢病毒载体(lentivrialvector,LV)[1-2]为切入点已初步建立起一套通过基因操作技术在体外细胞培养系统中生产高滴度LV的大规模培养技术体系[3],利用该体系制备慢病毒载体产量比目前国内外的报道高出1个数量级。然而通过该系统生产的慢病毒载体颗粒中含有感染性痘
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