养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察--《2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集》2012年
养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察
【摘要】：【目的】揭示大鲵蛙病毒感染的病理损伤特征,为临床诊断及致病机理研究提供参考与资料。【材料方法】对发生在四川、甘肃与陕西等地的经PCR确诊的大鲵蛙病毒自然感染病例进行病理剖解、组织病理学和超微病理学的观察,【结果】剖解发现病鲵腹部膨大,皮肤上出现白点、出血斑,溃疡,头部与四肢肿胀;肝肿大,呈灰白色或斑点状出血;脾、肾肿大,淤血、斑点状出血;肠壁变薄,肠腔内充满大量含血的或淡黄色的液体。组织学上,主要为全身组织器官广泛性水肿、出血、变性、坏死和炎症细胞浸润,特别是肾、肝、胃肠道、脾和皮肤肌肉的损伤较为严重,并在病变组织细胞见圆形或椭圆形嗜酸性胞浆包涵体。肾表现为渗出性肾小球肾炎及肾小管上皮的空泡变性与坏死;肝细胞广泛性空泡变性与灶性坏死;脾淋巴细胞坏死,数量减少;胃肠道为卡他性-出血性炎;皮肤水肿,表皮细胞空泡变性,坏死脱落,形成溃疡。超微结构上,肝、脾、肾的细胞发生明显的病变,线粒体肿胀,嵴断裂,溶解,粗面内质网扩张,核糖体颗粒脱落,细胞核染色质浓缩,边集,并在一些病变细胞浆内见晶格状排列或散在的虹彩病毒样颗粒。【结论】蛙病毒感染对大鲵多组织、器官都会造成病理损伤,特别是皮肤、消化道、肾、肝与脾的损伤较为严重,主要表现为严重的变性、坏死与炎症反应,由于多组织器官的损伤,导致机体多组织器官的功能障碍,甚至衰竭,最终引起死亡。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S947.3【正文快照】：
养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察养殖大鲵蛙病毒自然感染的病理形态学观察@耿毅$四川农业大学动物医学院!四川雅安 625014
@汪开毓$四川农业大学动物医学院!四川雅安 625014
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京公网安备74号大鲵蛙病毒生物学特性及其感染的病理学研究--《四川农业大学》2013年硕士论文
大鲵蛙病毒生物学特性及其感染的病理学研究
【摘要】：大鲵(Andrias davidianus)属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科,是现存最大的珍贵两栖动物,为我国特有珍稀物种,并已经将其列为Ⅱ类国家重点保护野生动物,世界自然保护联盟物种生存委员会(IUCN/SSC)和《中国物种红色名录》均将大鲵的受威胁现状列为极危(CR)级。我国于上世纪70年代开始大鲵驯养繁殖试验,90年代后,随着水生野生动物特许利用政策的明确和大鲵人工繁殖的成功,在坚持“保护中开发,开发中促保护”的理念下,大鲵驯养、繁殖蓬勃发展,形成了“原生态保护、仿生态培育、人工繁殖、集约化养殖”的发展模式。近年来先后在陕西、四川、甘肃、湖南、重庆与贵州等地新发现一种严重危害大鲵的传染性疾病,发病大鲵主要表现为体表出现出血斑点、溃疡,头部与四肢肿胀,故被称为“溃疡病”或“大脚病”,一旦该病发生,常导致较高的死亡率,甚至达100%,给养殖户造成严重的经济损失,故又被广大养殖户称为“大鲵癌症”。本论文以四川乐山某大鲵养殖场自然发病大鲵为研究对象,进行了蛙病毒感染的PCR检测,病理形态学研究,并在此基础上采用EPC细胞进行了大鲵蛙病毒乐山株(Chinese giant salamander virus-L,CGSV-L)的分离及其部分生物学特性的研究,以期明确该病的病因与病理损伤特点,为该病的临床诊断、防治提供理论依据,同时为该病致病机制的阐明奠定基础。
1.大鲵蛙病毒感染的PCR检测
取患病大鲵肝、脾、肾组织提取病毒DNA,设计特异性引物,扩增蛙病毒属病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)5’端500bp基因,凝胶电泳显示肝、脾、肾提取DNA均能扩增出500bpDNA片段,即患病大鲵为蛙病毒感染强阳性。
2.大鲵蛙病毒的分离及理化特性研究
利用鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma Papillosum Cyprini,EPC)体外分离、增殖CGSV-L病毒,该病毒接种EPC细胞后出现典型细胞病变(CPE)并且病毒滴度较高,其TCID50值可达ml；多温度条件下培养病毒,结果表明25℃最适宜病毒的增殖。通过对乙醚、氯仿、酸、碱、胰蛋白酶和热敏感性,以及BrdU抑制作用的研究,表明病毒可能有囊膜,为DNA病毒,在过酸、过碱、胰蛋白酶处理后和热条件下,病毒易失活。
3.大鲵蛙病毒主要功能基因的研究
以CGSV-L基因组DNA为模板,分别采用特异性引物PCR扩增MCP全基因、DNA polymerase基因和NF-H1基因片段,并进行目的片段的克隆、测序和序列分析,构建相应的系统发育树,分析其分类地位,结果表明CGSV-L为蛙病毒属新成员,各基因与GeneBank上报道的蛙病毒属的相关序列相似度很高,但基于MCP全基因和DNApolymerase基因的系统发育树揭示了CGSV-L病毒在分类地位上较为接近FV3、Hynobius nebulosus virus,而基于NF-H1基因的系统发育树显示：CGSV-L与FV3在一个大分类,但更接近Ranavirus KRV-1,soft-shelled turtle iridovirus和Rgrylio iridovirus。
4.大鲵蛙病毒自然感染的病理学研究
利用病理解剖技术、组织切片技术与超薄切片技术对患病大鲵进行大体、组织和细胞病变研究,结果表明,自然感染蛙病毒大鲵眼观症状主要表现为全身性肿胀,下颌与腹部充血、出血,四肢皮肤坏死,肌肉溃烂,甚至出现断肢现象,以及肝、脾、肾的肿大、坏死。组织病理主要表现为全身组织器官广泛性水肿、出血、变性,其中肾、肝、脾、皮肤肌肉和胃肠道的损伤最为严重,并在病变组织细胞胞浆内圆形或椭圆形嗜酸性包涵体,部分细胞内可见圆形嗜碱性包涵体。肾小管上皮细胞的空泡变性与坏死,肾间质大量炎症细胞浸润；肝脏细胞严重空泡变性与局灶细胞溶解性坏死,大量淋巴细胞在间质聚集成团；脾脏淋巴细胞坏死,数量减少,大量淡红染蛋白样物质沉积在脾髓细胞之间和网状纤维上；胃肠道发生明显的出血性-卡他型炎症；皮肤水肿,表皮细胞空泡变性,坏死脱落,肌层呈蜡样坏死,大量炎症细胞浸润,形成溃疡灶。透射电镜下可见肝细胞内线粒体肿胀,细胞核染色质浓缩,内质网扩张；肾脏肾小管上皮细胞,溶酶体增多,线粒体肿胀,部分发生固缩或形成髓鞘样结构；脾脏内淋巴细胞数量明显减少,多形态的网状细胞和巨噬细胞大量增多。细胞内可见呈正六边形,直径为140-180nm的病毒颗粒散在或类晶体状排列。
5.大鲵蛙病毒在鲤鱼上皮瘤细胞内形态发育研究
收集接种CGSV-L后不同时间的EPC细胞样品,进行超薄切片、醋酸铀及柠檬酸铅染色,在透射电镜下观察CGSV-L在EPC细胞内形态和装配过程,结果显示：CGSV-L感染EPC细胞16h后可见子代病毒粒子,在72h后达到高峰。病毒粒子具有独特的形态学特征,病毒大小约为160nm,呈六边形,符合蛙病毒属病毒的形态特征。病毒侵染细胞后,在宿主细胞胞核内完成病毒基因组的复制、扩增,和核衣壳的合成、组装；在胞浆内形成电子密度低的装配区,成熟的病毒颗粒和空衣壳在胞浆内聚集成类晶体样排列,或散在于胞浆内,或形成包涵体；最后成熟的病毒粒子通过细胞膜出芽的方式被释放出细胞。
【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S947.3【目录】：
中文摘要4-7ABSTRACT7-141. 文献综述14-21 1.1 蛙病毒概述14-18
1.1.1 蛙病毒生物学性状14-15
1.1.2 蛙病毒感染的分布与危害15
1.1.3 蛙病毒感染机制15-16
1.1.4 蛙病毒免疫性16
1.1.5 蛙病毒感染的病理学变化16-17
1.1.6 蛙病毒感染的诊断与防治17-18 1.2 大鲵病害研究概况18-20
1.2.1 中国大鲵养殖现状18
1.2.2 大鲵常见疾病18-20 1.3 研究目的与意义20-212. 材料21-23 2.1 实验动物21 2.2 实验材料21 2.3 主要试剂配制方法21-233. 方法23-33 3.1 大鲵蛙病毒感染的PCR检测23-24
3.1.1 引物合成23-24
3.1.2 病鲵组织内病毒DNA的提取24
3.1.3 PCR检测24
3.1.4 PCR产物的鉴定24 3.2 大鲵蛙病毒的分离、适应EPC细胞及增值特性的研究24-26
3.2.1 组织悬液的制备24
3.2.2 鲤鱼上皮瘤细胞传代培养24-25
3.2.3 组织悬液液接种到EPC细胞单层25
3.2.4 大鲵蛙病毒细胞种毒的制备25
3.2.5 病毒液接种到EPC细胞单层25
3.2.6 大鲵蛙病毒在不同温度下增殖情况的研究25-26 3.3 大鲵蛙病毒理化特性的研究26-28
3.3.1 大鲵蛙病毒细胞种毒TCID_(50)的测定26
3.3.2 病毒的核酸类型鉴定26
3.3.3 乙醚敏感性测定26-27
3.3.4 氯仿敏感性测定27
3.3.5 耐酸性试验27
3.3.6 耐碱性实验27
3.3.7 胰蛋白酶敏感试验27-28
3.3.8 耐热性试验28 3.4 大鲵蛙病毒主要功能基因的克隆及其系统进化分析28-30
3.4.1 引物设计及合成28
3.4.2 模板制备28
3.4.3 PCR扩增MCP、NF-H1和DNA polymerase基因28-29
3.4.4 MCP基因、NF-H1基因、DNA polymerase基因的胶回收及纯化29
3.4.5 MCP、NF-H1和DNA polymerase基因与pMD19-T载体连接29-30
3.4.6 重组质粒的转化30
3.6.7 阳性克隆菌的鉴定30
3.6.8 MCP、NF-H1和DNA polymerase基因序列测定及分析30
3.4.9 大鲵蛙病毒系统发育树的构建30 3.5 大鲵蛙病毒自然感染的病理学研究30-32
3.5.1 临床症状及病理解剖观察30-31
3.5.2 组织病理学研究31-32
3.5.3 细胞病理学观察32 3.6 大鲵蛙病毒在EPC细胞中形态发育及超微病理学的研究32-33
3.6.1 电镜样品的制备方法32
3.6.2 取样方法及时间32-334. 结果33-52 4.1 大鲵蛙病毒感染的PCR鉴定结果33-34 4.2 大鲵蛙病毒的分离及其在EPC细胞上增值特性的研究34-35
4.2.1 CGSV-L的分离34
4.2.2 CGSV-L在不同温度下的增殖情况34-35 4.3 大鲵蛙病毒的理化特性35 4.4 大鲵蛙病毒主要功能基因的研究35-39
4.4.1 大鲵蛙病毒主要功能基因的扩增、T-克隆与鉴定35-36
4.4.2 MCP、DNA polymerase和NF-H1基因的系统发育分析36-39 4.5 大鲵蛙病毒自然感染的病理学研究39-49
4.5.1 临床症状与剖解病变39-40
4.5.2 组织病理学变化40-49
4.5.3 细胞病理学变化49 4.6 大鲵蛙病毒在EPC细胞中形态发生学49-52
4.6.1 电镜下CGSV-L病毒粒子的形态特征49
4.5.2 CGSCV-L在EPC细胞内的形态与超微病理学49-525 讨论52-61 5.1 大鲵感染蛙病毒的PCR诊断53-54 5.2 大鲵蛙病毒的增殖特性与理化特性54-55 5.3 大鲵蛙病毒主要功能基因的分析55-56 5.4 大鲵感染蛙病毒的临床症状辨析56-57 5.5 大鲵蛙病毒组织病理学与发病机制57-58 5.6 细胞病理学损伤特点与发病机制58-59 5.7 大鲵蛙病毒在EPC细胞内的形态发育59-60 5.8 展望60-616. 结论与创新点61-63参考文献63-72致谢72-73作者攻读硕士学位期间发表的学术论文73
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京公网安备74号怎么办陕西水产科技服务有限公司技术老师：席冬一、大鲵（）传染性很强，成鲵和患都有此病，初步认为是蛙彩虹病毒和嗜水单胞菌病寄生引的，暂时没有有效的治疗方法，只能通过预防来降低患病几率。二、的发病规律：水温在18-25℃易发病。主要症状为：大鲵前期：潜伏期比较长一般有5-10个月，此时病鲵无明显症状，所以养殖户很难判断大鲵是否已经患有，前期蛙彩虹病毒FV3会在病鲵体内不断繁殖，随着病毒数量的不断增加，病体亚健康状态也就逐渐形成了，同时病鲵体生理功能和抗病能力开始逐渐下降，病鲵直接表现出得部分症状就是反应开始出现迟钝摄食能力初步减弱，这时是预防和治疗的最佳时期。
（图1）前期大鲵中期：中期行走困难反应迟钝，活动量明显减少，摄食明显减弱。这时嗜水气单胞菌感染病鲵体，在温度和水质等环境应激刺激下脚面开始糜烂变质、败血，有的病鲵四肢肿胀浮肿，爬行能力降低，出现呆滞、麻痹等症状。
（图2）中期大鲵晚期：晚期病鲵开始停止基本行走，并且停止摄食，四脚呈灰白或淡黄色组织坏死，四肢浮肿加重，基本失去爬行能力，四肢化脓性糜烂加重个别出现掉块现象，解剖可见肝肿大并呈灰白色，肠道空白，严重的有大量腹水血水。由于摄食停止体脂肪酸和维生素等开始快速匮乏，形成病鲵代谢功能障碍，影响神经功能。病鲵死亡加快，所以此时会出死亡率大幅提高。
（图3）后期
（图4）后期二、的防治：传染性强，死亡率高，没有特效根治药物，要注意对病鲵及时隔离及早预防。初期：可以选用维生素C和多维、黄氏多糖等营养类药物和鲵病速康内服，同时浸泡病鲵，从而提高鲵体的自身免疫力和抗病能力。中后期：对于病情严重的病鲵应及时捞出隔离内服：维生素C+黄金多维+鲵病速康+之血先锋+败血停+连续内服7-10天。外用：第1-2天每天双氧水或舍利泰洗净病灶后抹上四环素软膏或用12的龙胆紫药水抹于病灶并且用水霉净浸泡药浴1-3小时然后放流到环境好的池中隔离单养。第3-4天每天用维生素c和黄金多维浸泡药浴9-12小时然后放流到环境好的池中隔离单养。第5-8天每天用舍利泰或者涂抹病灶，并且药浴5-8小时然后放流到环境好的池中隔离单养。第9-10天每天继续黄金多维+维生素B1药浴8-10小时。（备注：在给投喂药饵的时候，摄食量一定要减到平时的五分之一以下，药量按病鲵体重计算）三、平时对于的预防应当做系统的预防可从下面几方面着手1环境方面定期对大鲵的养殖池塘消毒可选用85片剂或粉剂和，舍利泰等碘制剂或者交替使用对进行有益藻类的培植有益藻类做到生态抑制有害菌类可选用EM益菌素氨基酸肥水素等；2饵料方面在投喂时要对所用饵料进行杀虫消毒等基本的处理对于活饵可在暂养池进行药饵投喂和活体药物消毒对非活饵料可采用药物浸泡；3大鲵（）自身体质方面在过程中最终导致大鲵死亡的原因是继发性合并感染。所以对大鲵的防病治病要勤观察，早发现，早隔离，早治疗。同时，的防治迫切需要各级部门的高度重视和大力支持，以便于攻克疾病难关，降低养殖风险，使这一新兴产业向着更加健康、稳定、有序的方向发展。
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中国大鲵“烂脚病”病原菌的分离鉴定
为了解重庆地区部分中国大鲵（ Andrias davidianus）养殖场流行“烂脚病”的病因，对患“烂脚病”中国大鲵进行剖检后，在其肺部分离到一株优势菌CQWU2013，对该优势菌进行致病性实验、生理生化特性鉴定、16S rDNA测序和药敏实验。结果显示：中国大鲵“烂脚病”是由肺炎克雷伯氏菌（ Klebsiella mobilis）引起的，该菌为短链状排列的革兰氏阴性杆菌，其生理生化特性符合肺炎克雷伯氏菌的指标，16S rDNA序列同源性高达99.6％；药敏实验显示该菌对部分青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和糖肽类药物耐药，对供试的20种药物中有7种药物出现明显的耐药现象。
Abstract：
In order to understand the pathogen from Andrias davidianus suffered from“foot-rot” disease, pathogenic bacte-ria from pathologic tissues of diseased A.davidianus were examined and isolated.Identifications of the isolated bacteria in-cluded the morphological, physiological and biochemical characteristics.The 16S rDNA gene detection and antibiotic sen-sitivity test were also conducted.The result showed only one predominant bacteria strain was isolated and identified as Klebsiella mobilis, and it had strong pathogenicity to giant salaman the similarity of16 S rDNA was 99.6%to other K.mobilis.The antibiotic susceptibility test revealed that K.mobilis rain was resistant to 7 agents.Above all, the K.mobilis strain was bacterial pathogen leading to “foot-rot” disease of A. some candidate sensitive antibiotics was provided for the clinical treatment of the disease.
FAN Wen-qiao
SUN Han-chang
JIANG Yu-song
XU Jing-ming
JIANG Li-ling
ZHAO Man-chun
WU Bao-hong
作者单位：
重庆文理学院林学与生命科学学院重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心,重庆,402168
年，卷(期)：
Keywords：
在线出版日期：
基金项目：
重庆市教委科学技术研究项目( KJ1401105)；重庆市基础与前沿研究计划一般项目( cstc2014 jcyjA80042)；重庆市科委自然科学基金计划资助项目(Cstc2011jjA80028)；重庆文理学院人才引进项目
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