基于同步辐射的单细胞生物效应红外显微光谱研究--《中国科学技术大学》2012年博士论文
基于同步辐射的单细胞生物效应红外显微光谱研究
【摘要】：本论文的研究内容包括两部分：(1)单细胞同步辐射傅立叶变换红外显微光谱研究辐射生物学效应；(2)单细胞衣藻的软x射线透射显微成像的初步研究。
第一部分：单细胞同步辐射傅立叶变换红外显微光谱研究辐射生物学效应。
这部分的主要工作包括对同步辐射软X射线微束装置进行改造和完善,使之适用于活体动物细胞的辐射生物学效应研究。联合使用传统的彗星电泳和同步辐射傅立叶变换红外显微技术检测辐射生物效应以检验辐照平台的可行性。同时验证了同步辐射傅立叶变换红外显微技术在辐射生物效应检测上的优越性。利用显微光谱技术对结肠癌细胞辐射效应进行了系统的研究,给出定性以及定量的分析。进一步使用红外显微光谱技术在单细胞水平上对单基因差异导致的细胞代谢变化进行了研究。
第一章介绍了辐射生物学起源及进展、X射线与物质作用的过程以及辐射效应产生的机理,另外介绍了同步辐射X射线的特点,尤其是同步辐射软X射线的“水窗”波段在辐射生物学研究领域的优势。最后详细介绍了红外光谱产生的机理及其在生物医学领域应用,以及探讨了同步辐射傅立叶换显微光谱技术在辐射生物学效应研究上的可行性
第二章主要介绍了同步辐射软X射线动物细胞辐照系统,包括同步辐射软x射线微光束装置以及动物细胞生存维持系统。
第三章应用单细胞辐照系统对经典癌细胞系—HeLa细胞进行辐照研究。选择氧元素K吸收边的软X射线对癌细胞进行辐照,通过传统的单细胞凝胶电泳技术对辐照效应进行检验,验证了辐照平台的可行性。同时验证了同步辐射傅立叶变换红外显微光谱技术在单细胞水平上检测辐射生物学效应的可行性,结果表明其可在分子水平上检测胞内多种组分的变化,可实现单细胞水平上对辐射效应的研究。
第四章选择氧元素K吸收边的软X射线对敲除抑癌基因p53的结肠癌细胞HCT116进行多种吸收剂量的辐照研究。用同步辐射傅立叶变换红外显微光谱对辐照的生物学效应进行定性以及半定量的分析,结果表明氧元素K吸收边的软X射线造成了癌细胞DNA、蛋白质以及脂类的含量、结构和构象的改变,反映在辐照之后的细胞内组分特征吸收峰的强度增加、吸收频率发生位移等。其中辐照后,在氨基和羟基的叠加吸收中氨基吸收比重加大,酰胺I带中α螺旋和β转角的含量明显减少、β折叠的总含量增加了1.60%、无规则卷曲的含量增加了近3%,都表明辐照后细胞内蛋白质结构向无序化发展；脂类相关吸收分析结果显示辐照后脂链长度发生了改变,且甲基的含量减小。在剂量效应研究中发现amide Ⅰ/amide Ⅱ吸收峰面积比值随着辐照剂量的增加而减小,且DNA相对于蛋白质的含量也随着辐照剂量的增加而减小。
第五章使用同步辐射傅立叶变换红外显微光谱技术对抑癌基因p53敲除前后的单细胞进行光谱分析研究,发现敲除p53基因之后细胞内DNA相对于蛋白质的的含量,蛋白质二级结构组分的含量以及脂类的含量和结构都发生了改变,说明敲除p53基因对细胞内的代谢产生了显著的影响。研究结果表明同步辐射傅立叶变换红外显微光谱具备检测单基因的改变能力,为生物医学以及其他相关单基因诊断提供了新的辅助手段。
第二部分：单细胞衣藻软X射线透射成像的初步研究
利用国家同步辐射实验室软X射线显微术实验平台对莱茵衣藻细胞进行透射全场软X射线成像初步研究,着重探索了成像的实验方法。选择氧元素K吸收边附近的软X射线对莱茵衣藻进行完整细胞的软X射线透射成像,对不同的细胞固定和脱水的处理方式成像结果对比分析,探索适应于本显微系统成像的实验方法。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学技术大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q274【目录】：
摘要5-7Abstract7-10目录10-13第一章 绪论13-37 1.1 引言13-15 1.2 辐射效应产生的机理15-18
1.2.1 生命的单位组成15-16
1.2.2 细胞的辐射生物学效应16-18
1.2.3 辐射损伤效应的修复18 1.3 细胞辐照效应的检测18-21
1.3.1 细胞存活率的检测19
1.3.2 单细胞凝胶电泳19
1.3.3 微核率检测19-20
1.3.4 细胞凋亡检测20-21 1.4 抑癌基因p5321-22 1.5 傅立叶变换红外光谱22-27
1.5.1 红外光谱产生的原理22
1.5.2 影响红外吸收频率的因素22-23
1.5.3 傅立叶变换红外光谱仪23-24
1.5.4 红外光谱在生物医学中的应用24
1.5.5 红外显微光谱24-25
1.5.6 同步辐射傅立叶变换红外显微光谱25-27 1.6 本课题的研究意义和主要内容27-29 参考文献29-37第二章 同步辐射软X射线单细胞辐射平台37-45 2.1 引言37 2.2 同步辐射软X射线显微术实验站37-38 2.3 单细胞辐照微聚焦装置38-39 2.4 活细胞维持系统39-42 参考文献42-45第三章 宫颈癌细胞的软X射线辐射生物学效应45-71 3.1 引言45-47 3.2 材料与方法47-51
3.2.1 仪器与试剂47-48
3.2.2 细胞培养48-50
3.2.3 辐照样品准备50
3.2.4 细胞辐照50-51 3.3 辐射生物效应的检测51-66
3.3.1 单细胞凝胶电泳检测51-57
3.3.2 傅立叶变换显微红外光谱检测57-66 3.4 讨论66-67
3.4.1 细胞辐照66
3.4.2 细胞爬片66
3.4.3 干燥方式66-67 3.5 本章小结67-68 参考文献68-71第四章 结肠癌细胞的软X射线辐射效应研究71-91 4.1 前言71-72 4.2 细胞辐照72 4.3 单细胞光谱的采集72
4.3.1 细胞固定72
4.3.2 光谱采集条件72 4.4 结果与分析72-86
4.4.1 辐照前后细胞图像72-74
4.4.2 辐照前SFT-IR显微光谱74
4.4.3 辐照后SFT-IR显微光谱74-76
4.4.4 辐照SFT-IR光谱定性分析76-78
4.4.5 相对吸收强度变化78
4.4.6 核酸相关变化78-79
4.4.7 脂类相关变化79-80
4.4.8 蛋白质酰胺带分析80-85
4.4.9 剂量效应85-86 4.5 本章小结86-88 参考文献88-91第五章 抑癌基因p53单细胞红外光谱研究91-101 5.1 引言91-92 5.2 实验材料92 5.3 细胞培养92 5.4 光谱采集及预处理92-93 5.5 结果与分析93-97
5.5.1 光谱定性分析93-95
5.5.2 酰胺I带吸收的定量分析95-97 5.6 结论97-98 参考文献98-101第六章 单细胞的衣藻软X射线透射全场成像的初步研究101-113 6.1 引言101-102 6.2 材料与方法102-103
6.2.1 材料102
6.2.2 实验方法102-103 6.3 结果与讨论103-109 6.4 展望109-110 参考文献110-113总结与展望113-115致谢115-117在读期间发表的主要论文117
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现代生物进化理论
●章节规划
在现今世界上，我们已知生物的种类大约有200万种。这么多的生物真是千姿百态、绚丽多彩，尤其是它们对生活环境的适应能力之强，更是令人惊叹不已。那么，这许许多多的生物究竟是怎么产生的？它们的适应性又是怎么形成的呢？对于这个问题，在一个相当长的时间里，很多人认为生物物种是神或上帝创造出来的。不过，在古代也已经有了最原始的进化思想，认为一个物种是由另一个物种演化来的，但是这种思想在当时仅仅是一种天才的臆测。直到1859年，达尔文发表了巨著《物种起源》，才给神创论者极为沉重的打击，使生物学摆脱了神学的束缚。
我们知道，现在生存的生物是经过漫长的岁月，在长期进化过程中发展起来的。现代生物进化的观点和理论，也是经历了相当长的认识过程才建立起来的。
然而，神创论和生物进化论的斗争，直到现在仍然存在。在我们的身边，信神、信命、信鬼的思想和活动也时有发生。这些事实要求我们教师，通过各种渠道、手段和方式对学生进行生物进化观点的教育，使学生通过对本章内容的学习不仅可以了解生物进化理论在达尔文之后的发展，进一步树立生物进化的观点和辩证唯物主义观点，而且能够通过学习进化理论的发展过程，加深对科学本质的理解和感悟。
本章内容分析和教学安排：
1.内容分析
本章包括两节内容：第1节《现代生物进化理论的由来》和第2节《现代生物进化理论的主要内容》。第1节可用1课时教学，第2节可用4课时教学。
第1节《现代生物进化理论的由来》包括三部分内容：拉马克的进化学说、达尔文的自然选择学说和达尔文以后进化理论的发展，其中重点是第二部分，即达尔文的自然选择学说。
第2节《现代生物进化理论的主要内容》包括三小节：第一小节是《种群基因频率的改变与生物进化》；第二小节是《隔离与物种的形成》；第三小节是《共同进化与生物多样性的形成》。
第一小节包括三部分内容：种群是生物进化的基本单位，突变和基因重组产生进化的原材料,自然选择决定生物进化的方向。为什么说种群是生物进化的基本单位?这是本节的重点和难点之一。教材主要说明两点：一是说明个体不是进化的基本单位，一个个体适应能力无论多强，如果它的基因不能传给后代，它 在进化上就没有贡献，如骡；二是种群是生物繁殖的基本单位，它是指同种生物中一群能够自由交配的个体。关于本小节第二部分，由于在本模块遗传部分已经讲述了可遗传变异的三个来源，因此，这里着重讲述突变率以及突变在进化中的意义。关于本小节第三部分，教材主要通过“探究”来完成。这项探究强调的是运用数学方法，而不是用实验材料来实际操作，对科学探究能力的全面提高具有独特价值。
第二小节《隔离与物种的形成》包括物种的概念和隔离在物种形成中的作用两部分。关于物种的概念，目前还没有一个完全统一的定义，分类学上的物种主要依据的是形态学标准，进化论中的物种主要依据的是遗传学标准——以能否自由交配为标准，生态学上主要以生态要求是否一致为标准。
第三小节《共同进化与生物多样性的形成》包括共同进化、生物多样性的形成和生物进化理论在发展三部分内容。共同进化包含两层含义：一是不同物种间的共同进化，二是生物与无机环境之间的相互影响和共同演变。在本小节第三部分，教材简单介绍了中性学说和间断平衡说，让学生认识到在进化论领域至今仍有不同观点，进化理论仍在不断发展，同时也再次强调以自然选择学说为核心的进化理论的重要地位。
2.教学安排
现代生物进化理论 第1节 现代生物进化理论的由来 1
区域：福建省
第2节 基因在染色体上
●从容说课
本节内容包括了萨顿的假说、基因位于染色体上的实验证据和孟德尔遗传规律的现代解释3个教学知识点。在人类对基因与染色体关系的探索过程中，萨顿和摩尔根都作出了杰出的贡献。因此在我们的课堂教学中,通过组织学生活动、思考和讨论，帮助学生领悟科学家独到的研究方法、缜密的思考、严谨的推理，进行探究并得出相关的结论。
由于本节从上一节《减数分裂和受精作用》引过来，所以在教学安排上思路如下：
（1）通过回忆孟德尔分离定律和观察哺乳动物精子（或卵细胞）的形成过程图解，引导学生联想等位基因与同源染色体的行为之间究竟是什么关系？学生的这种疑惑源于头脑中的认知冲突，由认知冲突产生的问题会激发学生的探究兴趣。
（2）接着引导学生把孟德尔分离定律中的遗传因子换成同源染色体，重读分离定律，画含一对同源染色体（假设其上有一对等位基因）和含两对同源染色体（假设其上各有一对等位基因）的精原细胞减数分裂示意图，让学生强烈意识到基因和染色体行为存在明显的平行关系。采取学生活动的教学方式有利于落实探究性学习的课程理念，培养学生的探究意识和动手、动脑的能力，并使学生在活动中加深对生物学原理的理解，提高学生对生物学观点的认同程度。教师肯定学生的发现并介绍萨顿的假说，让学生体验到成功的喜悦。
（3）在摩尔根的果蝇杂交实验中，教师采取问题串的形式、环环相扣、层层深入的设问、引导学生思考和讨论，逐步揭开遗传的奥秘，最终证实基因的确位于染色体上。通过介绍多种生物的染色体和基因的数量关系，让学生理解到一条染色体上应该有许多个基因，且基因在染色体上呈线性排列。另外，还简要介绍现代分子生物学技术在基因定位上的应用，有利于拓展学生视野，增强学生学习生物学知识的时代感，体现教材内容的先进性。
（4）在以上内容的基础上，引导学生在染色体和基因水平上阐明基因分离定律和基因自由组合定律，以达到课程标准的要求。培养学生的分析归纳能力，让学生不仅在观念上逐渐认同，在知识结构上也获得了科学知识。
●三维目标
1.知识与技能
（1）说出基因位于染色体上的理论假说和实验证据。
（2）概述孟德尔遗传规律的现代解释。
2.过程与方法
（1）运用有关基因与染色体的知识阐明孟德尔遗传规律的实质。
（2）尝试运用类比推理的方法，解释基因位于染色体上。
3.情感态度与价值观
（1）认同科学研究需要丰富的想象力，大胆质疑和勤奋实践的精神，以及对科学的热爱。
（2）参与类比推理的过程，提出与萨顿假说相似的观点，体验成功的喜悦。
●教学重点
1.基因位于染色体上的理论假说和实验证据。
2.孟德尔遗传规律的现代解释。
●教学难点
1.运用类比推理的方法，解释基因位于染色体上。
2.基因位于染色体上的实验证据。
●教具准备
教学课件。
区域：福建省
●从容说课
《DNA的复制》内容是本章的一个重点，本课在教材中所占的篇幅不大，但对这节课内容进行合理的拓展和延伸，利用这节内容让学生学习科学家的思维，培养学生的能力是一个很好的内容。为此可利用有关Flash或Authorware课件，将复制过程以及科学家如何研究DNA的复制具体化、直观化。
《DNA的复制》主要内容包括复制所需要的条件、复制过程及特点、领会DNA分子独特的双螺旋结构和碱基互补配对能力与复制的密切关系。本课不仅与DNA的结构有密切关系，也与有丝分裂、减数分裂、生物的生殖等知识有联系，并且与酶、ATP知识有关，同时也是对遗传规律进行科学解释的基础。所以在本课的学习过程中可以对选学内容DNA半保留复制的实验进行分析，并且联系生物科学的新进展等热点材料，进行分析、讨论和评价，可以培养学生的综合素质。
●三维目标
1.知识与技能
（1）概述DNA分子的复制过程；
（2）了解梯度离心的原理。
2.过程与方法
通过复制过程的实验的分析，学习分析实验的方法。
3.情感态度与价值观
分析经典实验，让学生领悟科学探究的魅力。
●教学重点
DNA复制的条件、过程和特点。
●教学难点
DNA分子的复制过程。
●教具准备
DNA复制过程的分步Flash动画。
●课时安排
●教学过程
［课前准备］
学生自找资料了解有关梯度离心的原理。教师准备有关DNA分子复制的早期推测的资料。
［情境创设］
生物亲代和子代之间是通过
区域：福建省
动物细胞融合与单克隆抗体
课题 动物细胞融合与单克隆抗体 教师 冯敏 课时安排 2课时
教学重、难点 （1）动物细胞融合技术与植物体细胞杂交的区别
（2）单克隆抗体的制备过程、方法与原理与应用
目标 ⑴ 掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。
⑵ 简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。
⑶了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。
目标 让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。
目标 通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
教学媒体 动物细胞融合、单克隆抗体制备过程的教学课件
教学过程 教学意图
【复习导入新课】
师：植物体细胞杂交技术的过程是怎样的？
一学生黑板展示植物体细胞杂交过程，其他学生补充
师：根据其过程，我们来做一个抢答游戏，看看哪组同学反应灵敏，基础知识扎实
问题：（1）植物细胞融合遇到的第一个障碍是什么？
（2）去除细胞壁的方法？
（3）利用酶的什么特性？
（4）诱导融合的方法有哪些？
（5）植物细胞融合完成的标志是什么？
（6）植物体细胞杂交技术的目的是什么？
（7）动植物细胞在结构上有何区别？
师：既然动物细胞与植物细胞不同，那么动物细胞是否可以融合或杂交？如果可以，两者的方法、过程相同吗？......
下面就让我们一起来看看有关动物细胞融合的基础知识。
一、动物细胞的融合
通过自学，大家已了解了动物细胞融合的相关知识，哪位同学到前面来讲解一下细胞融合的内容 ？一同学用自己的话讲解，其他同学做补充并提问：
（1）动物细胞融合的实际操作过程中，只是用单个的两种细胞融合吗？为什么？
（2）使用灭活病毒作为诱导剂的原理是什么？不灭活的病毒能作为诱导剂吗？
（3）哪种促融合方法效率较高且对细胞伤害小？
（4）动物细胞融合技术的目的、原理、优点、最有价值的应用是什么？动物细胞融合完成的标志是什么？
1、概念：是指（在一定的条件下）两个或多个细胞融合形成一个细胞的过程。
“2个或多个动物细胞”→“1”、“杂交单核细胞”
2、动物细胞融合的方法：物理法（如电场法）、化学法（如聚
乙二醇法）、生物法（如仙台病毒法）
注意：应用物理法进行细胞融合的效率高，且对细胞伤害小，易操作、控制和观察。
师：当我们把2个动物细胞放到一起时，还需要做什么呢？
师：在诱导方法上，动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法是否相同？
生：相类似，可以用物理法、化学法，但动物细胞融合时可用灭活的病毒作为诱导剂。
灭活的病毒
4、意义：打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用；制备单克隆抗体
（1）动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，那么动物细胞融合的具体过程是否也和植物原生质体融合的过程一样呢？
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法
植物体细胞杂交 细胞膜的流动性 去壁后诱导原生质体融合 物理法（离心、振动、电激）化学法（聚乙二醇 获得杂种植株
动物细胞融合 细胞膜的流动性 使细胞分散后诱导细胞融合 除以上方法，还有生物法 制备单克隆抗体
二、单克隆抗体的制备
师：在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先回顾一下抗体的基础知识，再来了解以下问题：
1、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？
生：传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。
师：B淋巴细胞有什么特点？
生：B淋巴细胞能产生抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
师：根据B淋巴细胞的这个特点，若要想获得大量的单一抗体，如何做呢？
生：采用动物细胞培养。
师：对。我们必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体，即单克隆抗体，这就是单克隆抗体的概念。
可遗憾的是，在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，科学家是怎样解决这一问题的呢？想一想，能利用细胞融合技术来制备单克隆抗体吗？请阅读课本P58单克隆抗体制备的文字及示意图
师：两位科学家极富创造性的设想是什么？
生：如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
师：对，正是科学家先有了这个极富创造性的设想，然后再锲而不舍地把设想变为现实，才创造出单克隆抗体。下面我们请同学展示一下自己对单克隆抗体制备过程的了解。
（学生边写边讲，不足的地方进行补充，教师精讲点拨）
4、应用：诊断试剂；治疗疾病和运载药物。
引入学生思考，激发兴趣
培养学生归纳总结的学习习惯
复习体液免疫过程，进行新旧知识的联系
以概念图的形式进行知识梳理
区域：福建省
基因工程的基本操作程序
2 学情分析
学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。
3 教学目标
3.1 知识目标
⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程
⑵简述基因工程的原理和基本步骤
3.2 能力目标
⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法
⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案
3.3 情感态度与价值观
⑴关注基因工程的发展
⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高
4 教学重点与难点
4.1 教学重点
基因工程基本操作程序的四个步骤
4.2 教学难点
⑴从基因文库中获取目的基因
⑵利用PCR技术扩增目的基因
5 教学整体思路
采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。【2】
6 教学过程
教学过程 教学内容 教学手段和方法 预期目标
1、复习“基因工程”的概念，引入新课教学。
2、目的基因获取
⑴从基因文库中获取目的基因
⑵利用PCR技术扩增目的基因
⑶直接人工合成
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
⑴将目的基因导入植物细胞
⑵将目的基因导入动物细胞
⑶将目的基因导入微生物细胞
4、目的基因的检测和鉴定
⑴检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因。
⑵检测目的基因是否转录出了mRNA
⑶检测目的基因是否翻译成蛋白质。
⑷个体生物学水平的鉴定。
5、尝试设计某一转基因生物的研制过程。
师：通过分析图1-6我们知道基因工程的基本操作程序包括目的基因获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体、目的基因检测与鉴定。
师：基因工程概念中的“更符合人们需要”的那个基因就是目的基因了，只有有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性，所以基因工程的基本操作的第一个环节就是目的基因的获取。到底什么是目的基因呢？
师：目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，如抗虫基因，抗旱基因。
师：怎样才能获得这些目的基因呢？获取目的基因的方法有哪些呢？
学生阅读书本讨论，师生归纳：（一）可从基因文库中获取目的基因。
师：通过讨论分析我们已知什么是基因文库了，那么基因文库和基因组文库有什么区别呢？可结合P10生物技术资料卡讨论分析。
师：怎样从基因文库中得到我们所要的目的基因呢？
师：除了从基因文库中获取目的基因，还可以利用PCR技术扩增目的基因。
师生共同归纳：PCR技术扩增目的基因过程：
若基因比较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
师：作为基因工程表达载体，只需含目的基因就可以完成任务吗？为什么要有“表达载体”的构建这一步骤？
师生共同归纳：基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子以及标记基因等。
师：什么是启动子、终止子？它们的作用是什么呢？
师：标记基因的作用是什么呢？
师：基因表达载体构建完成后，如何将目的基因导入受体细胞呢？
师：根据受体细胞的不同，导入的方法也有所不同，将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。下面以农杆菌转化法为例。
师生共同归纳农杆菌转化的过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA，构建基因表达载
稳定维持和表达。
师：除了上述方法，将目的基因导入受体细胞的方法还有基因枪法和花粉管通道法。
师：若受体细胞是动物细胞，目的基因如何导入呢？
师：显微注射技术是转基因动物中最多采用的方法，也是最为有效的一种方法。
师：具体过程如何呢？
师：由于原核生物具有：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的特点，因此常作为基因工程的受体细胞。
师：什么是感受态细胞呢？目的基因导入微生物细胞的具体过程是什么？
师：首先要检测基因生物染色体的DNA是否插入了目的基因。
师：如何检测转基因生物的DNA上是否导入了目的基因呢？
师：通常采用的方法是采用DNA分子杂交技术。具体过程是将转基因生物的基因组DNA提取出来，并将含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素做上标记制作探针，（为了保证目的基因通过碱基互补配对来检测，探针必须是单链）再将探针与基因组DNA杂交，若结果显示出DNA杂交带，就表明目的基因已经插入染色体DNA。
师：目的基因导入了受体细胞后，就一定能表达吗？
师：如何知道目的基因已经发挥功能和作用呢？
师：检测的内容除了上述两项外，还可检测目的基因是否翻译成蛋白质。具体过程：从转基因生物中提取出蛋白质（抗原），用相应的抗体进行抗原抗体杂交，若有杂交带出现则表明目的基因已经形成蛋白质产物。
师：除了分子检测外，与时还需要进行个体生物学水平的鉴定。
如何了解抗虫棉是否具有抗虫特性呢？
师、生归纳小结：基因工程的四个操作步骤，结合P15思考与探究：β—珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的β—珠蛋白，想一想，应该如何设计？ 通过学生看本专题中基因工程的概念和图1-6来帮助学生建构基因工程的基本操作程序的整体框架。
举例如抗虫基因，抗旱基因等都是目的基因。通过具体的实例使学生对目的基因有一具体的认识。
学生阅读书本P9，讨论。
教师出示投影片，用打比方等手段帮助学生理解“基因文库”、“基因组文库”“部分基因文库”
多媒体演示PCR反应原理。
通过复习DNA来学习PCR的扩增过程。
学生阅读并讨论P15思考与探究1：作为基因工程表达载体，只需含目的基因就可以完成任务吗？为什么？
可复习“分子运输车”结构模式图来帮助理解。
师板图演示基因表达载体的组成
学生阅读分析
挂图或多媒体分步演示农杆菌转化法的过程。
学生看书，教师分步演示（板图、挂图等）过程帮助学生理解。
学生讨论分析P15图。
学生阅读生物技术资料卡片P12、P13。师生共同阅读分析
学生阅读书本并结合14页图1－14目的基因的检测示意图理解。
教学时可把“检测目的基因是否转录出了mRNA”与“检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因”作比较
适当拓展：
⑴ 将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质
⑵ 将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取
⑶ 从转基因生物中提取蛋白质（也就是抗原）。
⑷抗原与抗体结合﹍﹍
联系基因工程的概念，使学生对基因工程的基本操作程序有一总体的认识。
抽象变直观，便于学生理解。
通过师生共同讨论帮助学生理解如何从基因文库中获得目的基因。
通过动态的多媒体演示帮助学生理解PCR反应原理，尝试描述目的基因的扩增过程。
讨论DNA合成仪合成目的基因所需的条件。
联系旧知，学习新知。
抽象的知识具体化，有利于学生学习新知。
要使学生能对“转化”的含义进行适当的解释。
学生学会描述目的基因导入动物细胞的具体过程。
通过适当拓展帮助学生理解检测目的基因是否翻译成蛋白质的原理。
旨在通过设计转基因生物将基因工程的操作程序有机的关联起来。
区域：福建省
物质跨膜运输的方式
标 知识与技能
②说出被动运输与主动运输方式的异同点。
③阐述主动运输对细胞生活的意义。
过程与方法 培养学生提出问题的能力；培养学生解读图表数据的能力。
与价值观 本节情感态度与价值观的教学价值方面不太明显，主要强调学生积极思考，主动自觉地联系生活实际，理解研究物质跨膜运输的意义。
教学重点 ①物质进出细胞的方式，说出被动运输与主动运输的异同点。
②图表数据的解读。
教学难点 ①主动运输。
②正确解读坐标数据图表。
区域：福建省
蛋白质工程的崛起
标 知识与技能
2.简述蛋白质工程的原理。
3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。
过程与方法 通过采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式让学生理解本节内容是基因工程的延伸和发展。
与价值观 使学生认识到科学探索之路的漫长、艰辛和永无止境。
教学重点 （1）为什么要开展蛋白质工程的研究？
（2）蛋白质工程的原理。
教学难点 蛋白质工程的原理。
教学方法 探究法、导读法、分析交流
教学用具 多媒体课件
课时安排 1课时
容 设计与反思
区域：福建省
动物细胞培养和核移植技术
标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。
2\说出动物细胞养的所需条件。
3\简述动物细胞培养的基本程序。
4\简述动物细胞核移植的概念。
过程与方法
与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激发为祖国而奋斗的精神。
2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯物主义观念。
教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件；
2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景
教学难点 用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程
教学方法 以探究法、谈话法、材料教学法相结合。
教学用具 多媒体课件
课时安排 1课时
容 设计与反思
区域：福建省
植物细胞工程的基本技术
标 知识与技能
2、简述细胞工程的发展历程
3、描述植物细胞全能性的含义
4、简述植物组织培养的含义
过程与方法 简述细胞工程的概念→简述细胞工程的发展历程→描述植物细胞全能性的含义→简述植物组织培养的含义→说出植物组织培养所需的条件→说出植物组织培养的基本程序→列举植物组织培养的优点及实际应用
与价值观 体验植物组织培养技术
教学重点 1、 植物组织培养的原理和过程。
2、 植物体细胞杂交的原理。
教学难点 植物组织培养的实验
教学方法 本节教材内容对学生来说，虽说在必修模块中学了一些细胞的知识，但仍然是一个新的领域，学习起来有一定的困难。教师可采用讲授为主结合讨论的方法。
教学用具 多媒体课件，录象
课时安排 2课时
容 （第1课时） 设计与反思
区域：福建省