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技术&| 磷酸化蛋白Western跑不出来好捉急,解螺旋给你支招
医生科研助手
特别福利:关注解螺旋微信号,回复关键词"2月",可索取2016年2月资源包:生物信息分析软件与TCGA相关文献。作者:解螺旋.大肚腩转载请注明来源:解螺旋,医生科研助手话说我做硕士课题的时候需要跑磷酸化的AMPK(p-AMPK),当时同组四五个孩子一起跑,效果都很不理想,要么是条带过淡,要么是根本出不来。那几个月的时间我们疯狂的到处请教师兄师姐,在各种实验论坛上寻找改进方法,最终出来效果不错,文章也发了,在此总结几个Western跑磷酸化蛋白的要点,希望各位科研民工们少走弯路。
工欲善其事必先利其器,抗体很关键。这里我们要说的并不是最贵的就是最好的,如果条件允许,建议同时购买不同厂家的抗体,一起来试一试,因为有时候即使是最好的品牌,不同批次稳定性也不一样。抗体从订购到到货有一定的时间,所以到货后请尽快分装好,准备做实验,我们当时因为实验进度问题,抗体到了3个多月才开始正式实验,这样拖了时间找厂家售后申诉也是很被动的。
我们那时候用CST的一抗,感觉效果不稳定,也可能跟抗体放久了有关。最后买了另一家代理的抗体算是有了比较稳定的结果。当然,还是选择购买口碑较好的公司的产品为佳,这样即使出了问题售后也会跟进。如果经费有限,可以买买小包装的产品先试试,不少抗体公司还有5ul的抗体试用装免费申请。
再者,孵育一抗的时候,建议用新鲜抗体,什么意思呢?很多同学因为想图省事儿,很多时候配好孵育液,每次孵育好之后再次放进冰箱等待下次重复利用,一些比较好跑的蛋白到时没啥问题,但是磷酸化的蛋白建议每次都用新鲜的抗体原液,将条带剪下来后用杂交袋塑封好,按1:1000的比例加入抗体原液孵育,再这种情况下,100ul的抗体也是能用很久的,所以尽量每次都用新的抗体。
普遍反映磷酸化的条带很淡,有时候达不到制图标准,这点可以加大上样量来解决,另外,磷酸化蛋白一般与非磷酸化的蛋白一起跑一起制图,它本来就是要比非磷酸化的要淡一些,不要过分担心。
不同kb的蛋白电泳时间有所差别,参数啥的要用脑子更改,不能一成不变,避免发生那种蛋白跑不见了的惨剧。
这个步骤非常重要,强推BSA封闭,不要用脱脂奶粉封闭,BSA封闭对磷酸化的抗体效果非常好,而且也不贵,具体怎么配百度之。另外,BSA封闭液倒是可以反复使用不至于向奶粉一样臭掉,用来孵育一般非磷酸化的抗体,效果同样棒棒哒!
再者,封闭时间可以延长,一般封闭2-3小时的情况下,可以封闭延时到4小时,所以按照从早到晚做实验的时间,用BSA配好封闭液开始封闭的时候,您就可以慢慢的约个火锅唱个歌再回来了,实验本来就很辛苦,不要再依赖百度外卖大叔了。
严格遵守洗膜时间,不得减少次数,每个步骤洗3次,每次可以洗长一点,比如(11-12分钟)。
&最后向大过年还在跑Western的同学们致敬,条带会有的,文章会有哒!!大家新年快乐啦!&
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