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上海卡迈舒（Kmaels）科技实业有限公司公司介绍
-1){this.style.display='none';}" />上海卡迈舒（Kmaels）科技实业有限公司，主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发及售，并代理销售二十多个国外知名品牌，致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供一流的科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。公司主营业务试剂盒：ELISA试剂盒、兽药残留类试剂盒。培养基：显色培养基真菌（包括霉菌、酵母菌）气单胞菌肠球菌、链球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌李斯特氏菌绿脓杆菌沙氏菌、志贺氏菌阪崎肠杆菌大肠埃希氏菌O157大肠杆菌、大肠菌群、粪大肠细菌总数测定细菌鉴定培养基运送培养基样品制备植物组织培养基其它培养基疫苗培养基葡萄球菌（包括金黄色葡萄球菌）弧菌（包括副溶血性弧菌、霍乱弧菌）&[]
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【求助】荧光定量PCR的扩增产物长度为什么不能太长？
楼层直达：
这个帖子发布于7年零261天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
看文献上说荧光定量PCR的扩增产物长度不能太长，最好在75~200bp之间（不同文献提供的扩增产物长度范围大同小异，大致就是这个范围）。请问哪位兄弟姐妹知道为什么荧光定量PCR的扩增产物长度为什么不能太长，长扩增产物对结果分析有什么影响吗？万分感谢先！
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你说的这种Real-time PCR应该是通过Taqman探针检测的。
Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量。
传统PCR通过琼脂糖凝胶电泳判断产物量，达到半定量的目的。由于EB等染色剂与较长片段DNA结合后才能显现可测量的荧光，因而往往产物大小为150-1000bp。Real-time PCR通过反应中得到的荧光强度/循环数的比例关系得出结果，因而不需要加长产物。
产物长度短还能够简化热循环反应条件，减少反应时间。当然在条件允许的情况下，尽量增长产物长度（<200
bp）可以使引物同时适用于普通PCR和Real-time PCR。这也是我实验室的常规设计原则。
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既然这么规定，自有他的道理，我认为，产物越短，探针和上下游引物之间的距离越近，扩增过程中探针5端的发光基团可以高效的切除下去，保证扩增和荧光信号的增长同步进行。
当然，明白了原理之后，仔细想想，如果产物片段长一点，应该也没事，只要保证探针是特异性的与上下游引物之间的模板结合的就行了吧。分子信标和Taqman差不多，但是我们同学所作的扩增片段好像是300-400bp，扩增的也挺好。
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非常感谢楼上两位兄弟的释疑。我昨天就此问题请教了我们学校一位老师，他的解释是扩增产物较短可以保证每一轮的扩增效率接近100％（扩增效率是荧光定量PCR实验中非常重要的指标），我下来想了想觉得很有道理，不知各位战友以为如何？
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关于丁香园荧光定量PCR的CT值太高(荧光定量,目的基因,引物浓度,梯度) - PCR实验 - 生物秀
标题: 荧光定量PCR的CT值太高(荧光定量,目的基因,引物浓度,梯度)
摘要: [荧光定量PCR的CT值太高(荧光定量,目的基因,引物浓度,梯度)] 小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以 关键词:[荧光定量 目的基因 梯度 引物浓度 模板浓度 逆转录试剂盒 上下游引物]……
小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录盒不行，换了另一个进口盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。6、操作应该不会有什么大的失误现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水至20ul
回复发现一个问题，溶解曲线虽然是单峰，但是纵坐标的Rn的值很高，别人的都是小于0.1，我的1-5. 是不是这个原因啊？回复你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？建议换一对引物。回复你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？建议换一对引物。好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧回复好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧200bp对于Real-time PCR太大了，一般来说是几十个bp最合适。个人认为还是引物的问题。另外不排除RNA提取过程和逆转录过程中DNA的污染，建议先用DNAse处理后再进行逆转录。回复小弟最近在做荧光，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。6、操作应该不会有什么大的失误现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水建议先进行普通的PCR，用actin鉴定模板的质量。循环数设在22-26之间，跑胶后，看ACTIN的表达情况，再分析原因。回复首先做半定量来检验一下引物和体系，其次定量需要对模板进行稀释（以10的指数）做标曲。引物长度不是问题，片段短当然更好。纵坐标的阈值是可以手动调节的，有个计算公式。国产和进口试剂的阈值是不同的回复今天跑了一次胶，如上图所见。前两道是actin，后四道是目的基因。95度15秒，60度1分钟，四十个循环。个人感觉cDNA模板和引物应该没有问题。难道是荧光的机器坏了？我用的是AB7500.各位大侠实验室的荧光定量PCR机器多长时间维修一次？回复好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？回复好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？第六和第七道我没有加样啊。请问是如何看出引物有问题呢？回复有可能是RNA降解的原因，建议将RNA跑个电泳看看。回复奥，呵呵，我以为你actin 4个也对应着有4个目的扩增片段哪，呵呵回复请问各位大侠做实时荧光定量PCR，你们的模板c 10微升体系的，一般稀释多少呢？还是要自己摸索啊回复做实时荧光定量PCR最好不能低于20ul体系，不然荧光信号不稳定。回复求指教，我最近也遇到了与楼主同样的问题，why回复求指教，我最近也遇到了与楼主同样的问题，why引物特异性差，重新设计引物，多设计几条
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电话：021-荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电_百度作业帮
荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电泳仅出现目的带,接着我准备用sybr green 做荧光定量PCR,不知道可不可以就用我现在设计的这个引物去做?因为目的基因是多基因家族,所以在设计引物时我是在3非翻译区设计的引物,不知道荧光定量PCR中,此引物还可不可以用?
完全可以,PCR长度从50bp到数百都可以,不止局限于150-300个碱基对.楼上说的有道理,但是有一点要注意,最好计算一下扩增片段的Tm值,这样做溶解曲线的时候,光有一个峰还不够,而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行.是否在翻译区没有影响.
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博凌科为-为你理论上讲是可行的。只要你的产物片段在150-300个碱基对左右，并且有特异性，作为荧光定量应该是没有问题的。但是这里有一点你要注意，你在做半定量的时候电泳看到单一的条带不意味着不存在非特异性扩增。事实上电泳检测DNA灵敏度是很低的，在EB染色下，在电泳上出现一个条带的前提是要有5个ng的DNA,也就是说如果你在半定量中，非特异性的产物并不是主要产物，因此低于5ng的话，你在电泳时看不...
在real-time PCR中，一般原则是100～150bp的扩增产物最好（Livak et al., Methods 2001），能使扩增效率尽量接近100%，以保证定量的准确性。引物的Tm值最好在58～62度之间，正反引物间Tm值差距在1度以内，GC含量在40%～60%之间且两条引物GC含量接近，引物长度在21～25bp。满足这些条件的引物适宜用来荧光定量PCR。在程序跑完之后要看一下熔解曲线...
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如何做好荧光定量PCR实验
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