DIG标记探针做NORTHERN杂交遇到的问题(标记探针,探针,试剂盒,温度) - DNA技术 - 生物秀
标题: DIG标记探针做NORTHERN杂交遇到的问题(标记探针,探针,试剂盒,温度)
摘要: [DIG标记探针做NORTHERN杂交遇到的问题(标记探针,探针,试剂盒,温度)] 大家好，我是初次做NORTHERN杂交的，探针是通过RT-PCR获得的400bp左右的beta-actin 然后用ROCHE公司的DIG标记试剂盒标记，但是结果做的很不好，没有杂交信号，而且背景很高。我们实验室目前只用我一个人做这个，所以不知道问题出在哪里，想请求大家帮助一下！÷
我觉得探针制备应该没有问题，RT-PCR后切胶回收探针。探针标记后点膜检测效率也还可以。膜是4个月前转的，转 关键词:[探针 试剂盒 温度 标记探针 保鲜膜 探针标记 RT-PCR]……
大家好，我是初次做NORTHERN杂交的，探针是通过RT-PCR获得的400bp左右的beta-actin.然后用ROCHE公司的DIG标记盒标记，但是结果做的很不好，没有杂交信号，而且背景很高。我们实验室目前只用我一个人做这个，所以不知道问题出在哪里，想请求大家帮助一下！÷
我觉得探针制备应该没有问题，RT-PCR后切胶回收探针。探针标记后点膜检测效率也还可以。膜是4个月前转的，转了后将转过的膜切了一条泳道，用亚甲蓝染，转膜效率也很高，18s和28s在膜上清晰可见，比例也对头。然后放在4度冰箱用保鲜膜密封保存，大概已经4个月了（看有的PROTOCOL说是没有问题的）。因为没有人指导，完全依据盒操作，不知道杂交过程和洗膜的一下过程有没有问题：1. 我的探针碱基对大概有390，GC含量61％。根据KIT说明书算得合适杂交温度是48～53度，我选得48度。2. 用试剂盒提供的DIG Eazy Hyb 在48度下预杂交1h, 因为没有杂交炉，我是直接放在恒温水箱里面。期间没有搅动。3. 探针沸水5分钟变性然后加入1ml预热杂交液中（膜只用15平方厘米），大概50ug/ml的探针浓度。将预杂交液倒出，加入杂交液，因为水箱小，加杂交液过程及赶气泡的过程中，杂交液温度已经降下来了，不知道这对杂交有没有影响。封好杂交袋（我用的保鲜膜）再重新放回48度水箱，杂交过夜。4. 第二天用2XSSC,0.1%sds.洗涤2X15min.再在65度下0.5XSSC,0.1%SDS,洗涤2X15min，第二次洗的时候温度还没有预热到65度，不知有没有影响。5.然后按试剂盒说明操作进行曝光检测，底物用的CSPD，因为之间拥着个方法做过探针标记效率的检测，当时探针曝光点的很清楚，而且背景很底，所以我觉得我杂交背景高跟这个应该没有很大关系。唯一区别就是检测标记效率时是在室温下加CSPD然后直接曝光20分钟，而在检测杂交时，在37度孵育了15min。以下时图片，很难看，希望不要介意，只希望能给点建议和帮助，就不胜感谢了。
回复没有人作看到吗，自己先顶一下！回复以下为个人意见：背景深的问题，主要有以下几个方面：
1，探针过量
2，杂交过程中没有振荡
3，洗膜不充分，不严格
4，曝光或显影时间过长有没有加严格的阳性/阴性对照？不过，膜放置4个月了，有点太。。。我一般对放置在冰箱里的膜再用时，一定要重新按照ROCHE说明上将膜处理后，再重杂交。你杂交前是否处理？回复hanson朋友，你好！谢谢你提供的意见。我是杂交过夜的，只是在期间振荡过一两次，不知是否有影响，我正在重新转膜重作，我会注意你提的几点问题的。另外，我是直接提取细胞RNA然后跑电泳检测beta actin的，以确定实验技术上的可行（第一次做），再做其他探针的杂交，没有加阳性或是阴性对照。我购买的试剂盒是ROCHE的“高效DIG标记试剂盒2”，想问下你用的是什么试剂盒，我用的膜在用前并没有做过杂交（转膜固定后就一直放在冰箱里），对于你提到的放置在冰箱的膜再用时，按说明书进行膜的处理，我在我的说明书并没有找到（是否就是用碱变性等处理膜），能否提供详细一点的信息，或是怎么处理。非常谢谢了！回复以下是B-actin化学发光结果，没有用roche的盒子，是自己公司开发的盒子。从我们的操作经验看，在中的振荡是必要的，操作也可以严格按公司的说明书进行。回复我只做过Southern杂交，用的是宝灵曼的“Dig标记与检测试剂盒”，效果一直不错。关于背景深的问题，我觉得振荡很重要，不但杂交时要振荡，洗涤时也要振荡，没有杂交炉可以用气浴或恒温振荡培养箱来代替。我显色用的是NBT/BCIP，加入显色试剂后不可再摇动，且要放在黑暗处，我一般显色3-5小时。也许你用的显色底物不同操作也不同。回复阿土仔朋友，你好，谢谢你提供的经验。我用的是化学发光底物CSPD，可能和你的操作有些不一样。我今天又重新电泳转膜做了一次，不过结果令我很失望，我不知道问题出在哪里，为了防止过高的背景，我提高了我的杂交温度至53度，洗膜温度为68度，这些达到了我想要的效果，背景非常干净，可是没有任何杂交信号留下，我不知道是哪一步出了问题。转膜结束后，我还特地从膜上剪下一个泳道用亚甲兰染色，可以清楚的看到上面的18s和28s以及中间模糊一片的mRNA条带，证明转膜效率是不错的，探针也检测过标记效率，为什么会没有杂交信号呢？强烈失望中，如果β－actin杂交都做不出不来，我后面的实验就没办法做了。希望更多的朋友能提供给我经验！上面的innogent朋友，如果再买你们哪个试剂盒用，估计老板会揍我的，呵呵！回复我用的是和阿土仔兄弟一样的试剂盒，做的是疫苗(vaccine)中DNA残留量的测定，不过明天才开始，看了你们的留言，心里虚啊！第一次做肯定要砸了，请问从杂交到洗膜、显色，要一气儿做完吗？中间哪一步可以停一下（比如放4度）？回复做ＤＮＡ的检测应该还是比较好作吧，我曾经跟着别人作过斑点杂交，感觉还好，不象ＲＮＡ那么娇贵．我觉得能一气作完还是一气作完吧，而且你那个除了杂交过夜外，其余时间应该都不是很长吧．祝你好运！回复不知转膜后的固定步骤是什么,没见你描述.是uv crosslink 还是80度真空烘?b-actin 还是比较好做的,不要失去信心,问题总是可以解决的.cspd最好避光孵育30分钟.回复做northern确实很麻烦，不知道是否注意到在制备探针的时候就要注意RNA酶污染的问题。所以在制备探针时最好就要采取DEPC处理措施。另外一点，膜保存的时间确实有些太长了，如果样本来源确实比较少的话，在做杂交的时候可以和试剂盒中的阳性对照和阴性对照一起做，简单的话可以采用northern dot同步进行，少了变性电泳和转膜的麻烦了。这样你就可以验证杂交过程中你是否存在其他的问题。回复再把膜染染，有可能rna交联固定不好，洗膜太严格，把rna洗掉了，我还没做，仅仅是建议。硝酸纤维素滤膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色１）将干燥的滤膜浸入５％冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。２）再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04％亚甲蓝溶液中， 于室温浸泡５－１０分钟。３）用水淋洗滤膜５－１０分钟后，可见ＲＮＡ分子量标准参照物带型锐利而poly(A)+mRNA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至５kb以上的各种mＲＮＡ共同组成，mＲＮＡ的平均长度约为２kb。回复能得到这么多朋友的帮助，真是很高兴！同时也谢谢innogent朋友的鼓励。我固定膜的方法是将RNA用碱性转移缓冲液转到带正电荷的上，根据分子克隆及精编分子克隆介绍，用碱性缓冲液可以使RNA与带正电荷不可逆结合，从而碱裂解，印迹及固定一步完成，无须进一步固定。另外，我做探针效率检测时用的是微波固定（分子克隆提供的方法：微波炉最大功率2～3分钟）。尽管如此，我现在怀疑是否可能RNA在我第一次严格洗膜条件下被洗脱的可能了（新转的膜），因为我今天又杂了一次，背景太干净了！没办法，先跟老板商量，找找原因再说了！另外，bhy朋友，谢谢你提供的方法，事实你说的那个检测转膜效率的方法，在尼龙膜也是同样适用的，我就是用这个方法检测转膜效率的，我想现在已经很少人用硝酸纤维素滤膜了吧！
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电话：021-[分享]几个Northern杂交protocol - 实验交流 - 生物秀
标题: [分享]几个Northern杂交protocol
摘要: [分享]几个Northern杂交protocolDIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17 6ml 0 75mol L柠檬酸钠（pH7 0）和26 4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。工作液－在每50ml贮存液中加入0 3 关键词:[硫氰酸胍 试剂 上清液 氯仿 电泳 缓冲液 离心管]……
DIG标记的Northern杂交试验指导
一、 RNA提取
方法一、改良异硫氰酸胍提取法
异硫氰酸胍变性液：
贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为：
4mol/L异硫氰酸胍
25mol/L柠檬酸钠pH 7.0
0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)
0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)
其它溶液：
2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)
水饱和酚（pH 3.5）
49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇
100%异丙醇
70%乙醇（用DEPC处理水配制）
DEPC处理后高压灭菌水
1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种都轻轻摇动混合均匀，最后将盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。
方法二、改良Krapp提取法
试剂及其配制
RNA抽提掖：
母液：4mol 异硫氰酸胍
20mmol EDTA
20mmol MES
工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。
RNA重悬液：2mol LiCl
10mmol NaAc
调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。
1． 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。
2．4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。
3．上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。
4．小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。
5．在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。
6．4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。
二、RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。
方法一、紫外吸收检测
试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。 dH2O
1．预热紫外分光光度计10～20min.。
2．取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。
3．取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。
4．将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。
RNA浓度和纯度分析
浓度计算：对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。
纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。
方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测
试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
其它试剂：甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
甲酰胺（去离子）
将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。
溴化乙锭（EB，10mg/ml）
1．将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
2．配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。
3．待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
4．样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。
5．上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。
6．电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
RNA样品质量分析：
完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。
（接上）三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆
A． 载体选择
为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。
B. 目的DNA序列与载体连接
从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。
试剂及其制备
T4 DNA连接酶
连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水（SDW）
1． 建立以下反应体系（终体积20μl）：
4μl 质粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 连接缓冲液
2μl DNA 连接酶
6μl 无菌蒸馏水
2． 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。
3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。
1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。
2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。
3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。
C．感受态细胞制备（CaCl2法）
试剂及其配制
LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。
E. coli菌株：JM105或TG1。
1．将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。
2．取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3．将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
4．将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
5．沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。
D. 质粒DNA转化
试剂及其配制
LB培养基（同C）。
氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。
X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。
1．取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。
2．然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。
3．向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。
4．与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。
5．将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。
E. 转化质粒的快速检测
试剂及其配制
煮沸缓冲液：蔗糖 8％
Triton X-100 1.5%
EDTA(pH 8.0) 50mmol/L
Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L
LB培养基（同C）
氨苄青霉素（AP）（同D）
1．选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。
2．将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。
3．将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。
4．将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。
5．取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。
6．在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。
如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。
四、模板DNA的制备
A．质粒DNA的小量提取
试剂及其配制
含AP的LB液体培养基
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)
10mmol/L EDTA
50mmol/L 葡萄糖
高压灭菌15min.后，4℃贮存。
溶液II: 0.2mol/L NaOH
1% SDS（临用前现配制）
溶液III（100ml）：5mol/L 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
dH2O 28.5ml
酚∶氯仿（1∶1）
95%和70%乙醇
1．在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。
2．取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3．将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。
4．在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。
5．加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
6．加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。
7．用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。
B． 质粒DNA的线性化
试剂及其配制
Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿（1∶1）
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
1．在离心管中依次加入：质粒DNA 10μl (1μg/μl)
10×内切酶缓冲液 10μl
dH2O 80μl
Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2．37℃保温反应2小时以上。
3．消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4．将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5．4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。
6．线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。回复:
五、RNA探针制备（根据the DIG system user"s guide）
A． 地高辛标记的体外转录
试剂及其配制（试剂盒提供）：
10× NTP标记混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)
10mmol ATP
10mmol CTP
10mmol GTP
6.5mmol UTP
3.5mmol DIG-UTP
10× 转录缓冲液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0)
60mmol MgCl2
100mmol DTE(dithioerythritol)
20mmol亚精胺
100mmol NaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μl DNase I (RNase-free)
20unit/μl Rnase抑制剂
20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶
4mol/L LiCl
200mmol/L EDTA
试验程序（带手套操作）
1．在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物（离心管置于冰上）：线性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP标记混合物 2μl
10×转录缓冲液 2μl
DMPC－H2O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2．轻轻混匀反应物，37℃保温反应至少2小时。
3．如果必要，向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI，37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板（由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量，因此，这一步有时也可以省略）。
4．向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5．再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀过夜
6．4℃下，12000rpm离心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗涤一次，真空干燥。
7．沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中（每一反应体系约10μg），并向其中加入20unit Rnase抑制剂，置于-20℃保存备测，检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B. DIG标记有效性检测
RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。
方法一、用标准DIG测试条比较鉴定
使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。
试剂及其配制
20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠&#O(88g/L)
RNA稀释缓冲液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中
BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条：带正电荷的尼龙膜
对照试剂条：在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样（300,100,30,10,3pg）
洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
封闭液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
试验程序（带手套操作）
1．将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml，即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液，如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。
2．取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E顺序编号，将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度：
编号 RNA标记物稀释方法 RNA终浓度
A 1μg/mlRNA 10μl＋RNA稀释缓冲液23μl 300pg/μl
B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C A 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 30 pg/μl
D B 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
E C5μl + RNA稀释缓冲液45μl 3 pg/μl
3．将空白测试条置于一聚酯膜上，以每一浓度1μl的量在测试条上点样，在聚酯膜上做好点样浓度标记，切勿直接在测试条上做任何记号，切勿用手接触测试条。
4．室温干燥约2min.，同时制备测试溶液。
5．在2ml封闭液中加入1μl Anti-DIG-AP。
6．显色底物溶液：在2ml检测缓冲液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。
7．准备5个样品池（2.5 ~ 5ml容量），1～6顺序编号，依次加入2ml以下溶液。
①. 封闭液；
②. 抗体溶液（第5项）；
③. ③④⑤洗膜缓冲液；
④. 检测缓冲液；
⑤. 显色底物溶液（第6项）
8．将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①. 封闭， 2min.→
②. 抗体结合， 3min.→
①. 封闭， 1min.→
③． 洗膜, 1min. →
④． 平衡， 1min. →
⑤. 显色反应（黑暗），5－30min.
9．显色反应30min.即停止反应（延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较），用水漂洗测试条，将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。
显色反应进行5～10min.时，对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色，30min.时3pg的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。
如果标记物浓度低于10－30pg则不适宜采用这一快速检测方法。
方法二、用DIG标记的RNA对照比较检测
试剂：DIG标记的对照RNA（浓度约为100μg/ml）
其它试剂同方法一
1．将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl（5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：
编号 对照RNA稀释方法 终浓度
A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl
B A 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C B 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
D C 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl
E D 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl
F E 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl
* 稀释后的A－E可以在-70℃下至少贮存一年。
2．按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3．取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C－F浓度进行检测。
4．用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5．将膜置于封闭液中，室温下封闭30min.。
6．准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7．将膜置于抗体溶液中，室温下保持30min.，注意抗体溶液必须没过膜。
8．室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.。
9．再将膜置于检测缓冲液中2min.。
10．在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液（现配现用）。
11．除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时（一般几分钟即可见开始显色），注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。
12．当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。
13．比较对照和样品的颜色测算浓度。
六、Northern 印迹杂交
A． 探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝
甲酰胺（去离子）
SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠&#O (88g/L)
用1mol/L HCl调整至pH 7.0
Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)
用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml
于-20℃保存。
预杂交溶液：5× SSC
5× Denhardt 溶液
50%(w/v) 甲酰胺
1%(w/v) SDS
100μg/ml 鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）
杂交溶液：DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液：2×SSC 加入0.1% SDS
0.5×洗膜缓冲液：0.5× SSC加入0.1% SDS
0.1×洗膜缓冲液：0.1× SSC加入0.1% SDS
D. Northern转膜
转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的 分子量Marker.
1．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
2．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
3．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
4．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
5．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
6．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
7．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
8．交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时；方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。
9．转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。
建议杂交条件：探针浓度50~100ng/ml，温度68℃过夜。
1．将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。
2．将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使用)，用预杂交液稀释成设定浓度。
3．将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68℃）杂交过夜。
4．杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的中，贮存于-70℃以备重复使用。重复使用时，解冻并在68℃下变性10min.。
5．洗膜：杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42℃，然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68℃。当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。
七．杂交结果检测
方法一、化学发光检测
试剂及其配制：
洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
封闭液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
Anti-DIG-AP
CSPD: 25mmol CSPD（用前稀释）
检测程序：
1．杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。
2．将化学发光底物置于室温下。
3．用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.（封闭过程在摇床上轻轻摇动），在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。
4．在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。
5．在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。
6．去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.。
7．去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化学发光底物处理之前，膜必须保持湿润，哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。
8．用检测缓冲液稀释CSPD（1∶100），选择以下方法的一种进行发光底物处理：
a. 单张杂交膜处理：将膜置于一保鲜袋中或两张醋酸纸之间，用镊子轻轻抬起一角，用一消毒的吸管从膜顶端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化学发光底物，让底物溶液均匀扩散到膜的表面，然后将膜放平，用一张湿润的滤纸轻轻排除气泡使膜四周被液体封闭，室温下放置5min.，然后接步骤9。
b. 成批膜处理：取一个干净的盘子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盘中，用一钝头镊子将膜置于其中，轻轻倾斜盘子直到膜表面全部浸有底物溶液，室温下放置5min.，用镊子小心夹住膜的一角，提起使多余液体滴出（切勿使膜干燥），然后将其置于一干净保鲜袋中。重复以上过程将膜一张一张全部处理完后接步骤9。
9．当膜半干燥时，即刻将膜封闭在保鲜袋中。为了缩短曝光时间，膜需在室温下稳定7～8小时或37℃下15min.，达到稳定态的膜单拷贝基因的检测也只需曝光15min.，如果封膜后马上曝光处理，则曝光时间要60min.。
方法二、NBT-BCIP荧光检测
试剂：Anti-Dig-AP
其它同化学发光检测。
试验程序：
1．杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。
2．将化学发光底物置于室温下。
3．用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.（封闭过程在摇床上轻轻摇动），在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。
4．在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。
5．在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鲜袋中处理，要排除气泡；如果在盘子中进行处理，要轻轻摇动，使膜全部浸入抗体溶液中。
6．去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.以除去非结合抗体。
7．与此同时，准备颜色底物溶液，在10ml检测缓冲液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。
8．去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。
9．除去检测缓冲液，加入大约10ml颜色底物溶液，显色反应可以在保鲜袋中进行，也可以在暗盒中进行，显色反应中切勿摇动。在显色反应中，可以短时暴露于光下观察，一般几分钟后开始显色，但完全反应大约需要12小时。
10．显色完成后，用H2O洗膜以终止反应，如果膜还要再用则用TE终止反应。
结果记录可采用影印和照相的方法，膜如果贮存在TE中可长期保存颜色不变。
非放射性（DIG，BIOTIN）探针Northern杂交方法
试剂材料：
（一）20× SSC： 3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠（pH 7.0）
（二）洗涤液1： 2× SSC，0.05% SDS
（三）洗涤液2： 0.1× SSC，0.1% SDS
（四）洗涤液3： 2× SSC，0.1% SDS
(五）DIG DNA 标记试剂盒
（六）HyB高效杂交液
采用本操作方法进行杂交很少会遇到困难。它不仅能提高成功的概率，而且容易使实验中出现的难题得到解决。如果用户以前没有进行过杂交实验，我们建议先用人β-actin对照探针进行杂交，以熟悉和掌握杂交技术。
（一） 概论
1. 以下方法中所采用的杂交温度，适用于平均G/C含量(40%)的DNA探针的杂交。对于G/C含量不同的探针的最适杂交温度，则必须通过试验才能确定（Sambrook et al.，1989）。
2. 高浓度探针不能直接加到膜上，因为局部探针浓度不均一会导致产生异常杂交信号
3. 探针标记时的注意事项：
a. 合成的寡聚核苷酸探针，核苷酸长度应大于22 nt，Tm应大于60℃。一般采用长度为30～40 nt的寡聚核苷酸, 可以得到最隹结果。
b. 标记反应后，去除未掺入的核苷酸非常重要。如果在纯化后得到的标记探针很少，应加入更多的载体核酸（如10～15μg变性的鲑精DNA; 或酵母tRNA）一起层析以帮助富集标记的探针。
c. 一定要测算探针的比活性，以便在杂交前知道标记的探针是否有用，也有助于计算杂交所需的探针数量，以及确定最隹的X光胶片的曝光时间或化学显色时间。检测相同的基因，比活性高一倍的探针所需的曝光时间可以减少一半。
d. 杂交时加入的探针量不要超过推荐的浓度，否则背景很深。
非放射性标记的cDNA探针杂交
建议杂交时使用的DNA探针浓度为2～10 ng/ml。探针浓度大于10 ng/ml时虽可缩短杂交所需时间，但可能会加深背景。
（1） 在68℃加热HyB杂交液，充分搅动使沉淀完全溶解。
（2） 在10×10 cm膜中至少加入5 ml HyB杂交液，使膜完全被杂交液复盖浸润，排除气泡，在68℃连续振荡30～60分钟，进行预杂交。
（3） 将非放射性标记的DNA探针放在95～100℃中煮5～10分钟使之变性，然后迅速放入冰浴中冷却并离心片刻。
（4） 将变性的非放射性标记探针加入到5 ml新鲜的HyB杂交液中充分混匀。
（5） 除去预杂交溶液，加入含有探针的杂交液，排除气泡，确保整块膜都被杂交液均匀浸润。
（6） 在68℃连续振荡杂交6小时或更长时间（可以杂交过夜）。
（7） 在室温下，用洗涤液3将杂交好的膜振荡洗涤2次，每次15～20分钟，并更换洗涤液。每100cm2膜至少用20 ml洗涤溶液洗涤。
（8） 在68℃，用洗涤液2将膜振荡洗涤2次，每次15～20分钟，并更换洗涤液。
注意：对于与靶DNA不是完全同源的探针来说，这一步的洗涤温度需降低至50℃进行洗涤。
（9） 用镊子将膜取出，滴去多余的洗涤液，即可直接进行化学荧光检测，或用于其它检测（例如显色检测）。
非放射性标记的寡聚核苷酸探针杂交
建议杂交时使用的寡聚核苷酸探针的浓度为20～50 ng/ml，探针的浓度大于50 ng/ml虽可缩短杂交所需时间，但可能会加深背景。
（1） 在68℃中加热HyB杂交液，充分搅动使沉淀完全溶解，然后放42℃保温备用。
（2） 在10×10 cm膜中至少加入5 ml HyB杂交液，排除气泡，确保整块膜为杂交液覆盖浸润，在42℃振荡30～60分钟，进行预杂交。
（3） 将非放射性标记探针加入到5 ml新鲜HyB杂交溶液中充分混匀。
（4） 除去预杂交液，加入含非放射性探针的杂交液，排除气泡，确保整块膜被杂交液覆盖浸润。
（5） 在42℃振荡杂交1-2小时。
（6） 在室温下，用洗涤液3将膜振荡洗涤30分钟，期间更换洗涤液一次。每100 cm2膜至少用20 ml洗涤溶液洗涤。
（7） 在42℃，用洗涤液2将膜振荡洗涤30分钟，期间更换洗涤液一次。
（8） 用镊子将膜取出，滴去多余洗涤液，即可直接进行化学荧光检测，或用其它方法检测（如显色检测）。
杂交结果的分析
（一） 杂交信号
一般来说，一个基因的转录本很少只在一种组织中表达，较常见的是在不同的组织中有不同的表达水平。例如，组织型纤溶酶原激活物可在肺和肾中高水平表达，在胎盘、肝和脑中表达水平较低，而在胰、心和骨骼肌中的表达则非常微弱。即使在所有组织和不同细胞中都有表达的基因，例如细胞骨架β-acrin，它在不同组织中的表达仍存在一些差异。
因此，建议在对实验结果作出任何结论之前，应进行多次X光胶片曝光分析。例如组织型纤溶酶原激活物，如果X光胶片曝光时间过短很可能会得出错误的结论，以为它只在肺和肾中表达。在基因转录本表达水平非常低的情况下（即使是在获得cDNA探针的组织中），有必要将X光胶片曝光较长时间。如果长时间曝光也不能产生强烈的信号，则可以通过提高探针的比活性来增强其敏感性，也可以通过使用RNA探针来提高敏感性。
转录本大小的判断
用含3％甲醛的变性凝胶进行电泳，虽然可以消除RNA分子中高度存在的二级结构，但是不同mRNA分子之间的变性程度仍会有所不同。在本制备中使用的电泳条件，对1.0～4.0 kb范围的转录本的分辨效果最好，因此，超出这一范围的转录本的大小只能粗略地估计了。建议在进行膜杂交实验之前，先用2种不同的变性方法对你所要测定的转录本的大小进行测定。Sambrook et al.(1989)对这些变性方法巳有讨论。
用β-actin 对照探针杂交的预期结果
用β-actin 对照探针杂交后，应该在每条泳道的约2.0 kb处产生杂交信号。β-actin对照探针的杂交信号很强，X光胶片只需曝光几分钟便可观察到杂交带。在心脏和骨骼肌中，则存在2种形式的β-actin mRNA，一种是2.0 kb的，另一种是1.6～1.8 kb的（Giovanna et al. 1991, Lamballe et al. 1991）。出现这种差异不是mRNA降解所致，而是探针与α-actin或γ-actin杂交产生的结果。在其它组织中，actin的其它异构体也可能被检测到，这取决于杂交条件的严格程度。
背景很高（有或者无杂交信号）
不管是在何种条件下洗涤，如果延长洗膜时间仍不能改善背景状况的话，则要脱除膜上的探针重新进行杂交。背景很高的原因有如下几种：
1.标记探针时，未掺入的dNTPs没有完全从探针中除去。建议使用PCR产物纯化柱来纯化探针。
2. DNA探针的平均大小过大。最隹大小范围为200～800核苷酸。
3. 杂交溶液中探针浓度过高。对于DNA探针来说，浓度不要超过10ng/ml；对于寡聚核苷酸探针来说，不要超过50ng/ml。
没有杂交信号或杂交信号很弱
如果X光胶片曝光30-60分钟后仍没有杂交信号产生，这可能是杂交探针的活性很低，需重新标记探针。
如果重新标记后探针的比活性仍然很低，则可能是标记时DNA的用量太少。DNA的用量通常为25～50 ng（可根据浓的母液的OD260值计算）。如果手头上DNA的样品量很少，可将你标记时使用的DNA量点样在琼脂糖凝胶上，傍边点上巳知含量的DNA标准样品一起电泳，从中估算出探针DNA的量。经溴化乙锭染色后，如果看不到明显的探针DNA带，说明DNA量少于20～50 ng，那么在标记时要加大2～3倍的DNA量。如果仍然失败，则要用巳知含量的对照探针例如β-actin探针来优化标记条件。
探针与靶基因不完全同源
如果是用种间交叉的探针进行杂交，则应降低最后洗涤条件的严格程度，将洗涤温度提高到50～56℃，并用洗涤液1代替洗涤液3。如果是用合成的寡聚核苷酸探针进行杂交，则应确保探针与靶基因完全同源。
无法去除探针和再次杂交
杂交膜如果不能再次杂交，很可能是上次杂交的探针没有完全从膜上去除，也可能是因膜已经干燥或部分干燥造成的。如果膜已经干燥那怕只是部分干燥，要想除去膜上的探针已是不可能的了。因此，在整个洗膜过程中应避免使膜干燥。在完成洗涤后，用镊子将膜夹起滴去多余的洗涤液（不要使膜干燥），立即用塑料薄膜将膜包裹住。
杂交2次后信号减弱
这种现象在低丰度基因中极为常见，即使是高丰度基因（例如，β-actin），经过2轮杂交后，杂交信号也不可能象通常看到的那样强。
杂交时—————
2．预杂交液，50mL
DEPC水 30mL
Na2HPO4&#O 2.45g
NaH2PO4(NaH2PO4&#O) 0.38g(0.494g)
0.5M EDTA 100μL
去离子甲酰胺 7.5mL
加无离子水至50mL
——————杂交后——————
1．洗膜液Ⅰ，500mL
1×SSC 500mL
0.1%SDS 0.5g
2．洗膜液Ⅱ，2000mL(500mL)
NaH2PO4&#O 2.465g (0.62g) 25mM
Na2HPO4&#O 12.248g (3.06g) 25mM
EDTA 0.584g (0.146g) 1mM
SDS 20g (5g) 1%
加水至 2000mL (500mL)
3．洗膜液Ⅲ，500mL
Na2HPO4&#O(10mM) 1.79g
DW to 250mL
约1mL磷酸调PH7.0
去离子甲酰胺(50%) 250mL
Northern杂交
准备物品：50ml量筒1个 100ml量筒1个 300ml烧杯1个 250ml 烧杯1个 250ml的锥形瓶1个 10ml 离心管2个 大小盘各1个 镊子1把 剪刀1把 DEPC水500ml 2，瓶玻璃棒1根 电泳槽、转膜槽、梳子、杂交桶 以上物品均用DCPE水处理
1. 4 M LiCl (50ml) LiCl 8.478g定量至50ml，DEPC处理，灭菌。
2. 1 M Na3PO4 (50ml) 19.01g定量至50ml，DEPC处理，灭菌。
（注：该溶液配完后，可以溶解并消毒，但是不要放在4℃，其溶解性不好，放在室温下仍有小结晶。）
3. 10% SDS (100ml) SDS 10g加入100ml DEPC水。
（注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧）
4. 10% N-lauroylsarcosine (10ml) 0.2—0.45 um膜过滤。
5. BufferⅠ：Maleic acid buffer (500ml) 1× 用NaOH调pH为7.5，DEPC处理。
（注：调节PH时，需要的碱较多，可以直接加入固体粉末约2克。）
0.1M maleic acid 5.8g
0.15M NaCl 4.4g
6. BufferⅡ：Blocking solution 1% (100ml)
Blocking Reagent 1g，加入100ml maleic acid buffer，60℃溶解1小时，加入100ul DEPC处理，灭菌。
7. 洗液Ⅰ （500ml） 2×SSC，0.1%SDS DEPC处理 使用量：50ml/100cm2
20×SSC 50ml + 10% SDS 5ml + 水445ml
（注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧）
8. 洗液Ⅱ （500ml） 0.1×SSC，0.1%SDS DEPC处理
20×SSC 2.5ml + 10% SDS 5ml + 水497.5ml
（注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧）
9. Washing Buffer (300ml): Maleic acid buffer + 0.3% Tween 20 (v/v)
10. Detection buffer (200ml) DEPC处理）PH9.5
0.1M Tris-HCl 2.42g
0.1M NaCl 5M NaCl 4ml
50mM MgCl2 2.03g
11. High SDS hybridization buffer (50ml)，混匀，或65℃烤箱1小时，置-20℃保存。
（注：使用时新鲜配置）
DEPC处理水 9ml
SDS 7% 3.5g
Formamide, deionized, 50% 25ml
20×SSC 12.5ml
1M sodium phosphate, pH 7.0 2.5ml
N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v) 0.5ml
blocking reagent, 2% 1g
0． 01N的NaOH 0.4g
3M的NaCl 175.32g
13. 20×SSC (500ml) DEPC处理
3M NaCl 87.66g
0.3M sodium citrate 44.12g
用10M NaOH调pH7.0
14. 10×MOPS电泳缓冲液：小烧杯中MOPS 4.19g，加入DEPC水，3M乙酸钠2.67ml，用10M NaOH调pH7.0，加入0.5M EDTA 2ml，用DEPC水定量至100ml，过滤除菌，倒入棕色瓶中，4℃保存。
15. 1M Tris-HCL （200 ml）
称取Tris碱24.22g，加纯水溶解，用浓盐酸调pH8.0，定量至200ml，加入DEPC 200ul，过夜，消毒。
16. 0.5M Tris-HCl (pH7.4) / 1.5M NaCl
称取Tris碱15.2g，加水约200ml。用浓盐酸调pH7.4，再加入NaCl 43.83g，定量至250ml，高压消毒。
17. loading buffer : 1ml, pH8.0
甘油（50%） 0.5ml
EDTA(1mM) 0.5M EDTA 2ul
0.25%溴酚蓝 0.0025g
0.25%二甲苯青FF 0.0025g
DEPC水 0.48ml
18. 3mol/l乙酸钠 100ml： 乙酸钠40.8g，加入水溶解，10M NaOH调pH8.0，DEPC处理。
19. 0.5M EDTA 50ml：EDTA 9.31g，加入水溶解，10M NaOH调pH8.0，DEPC处理。
二、地高辛试剂盒标记cDNA探针（Cat No. 1093657）
1．DNA模板（0.5-3ug）15ul，沸水加热10分钟变性，迅速置冰浴中；
2．在冰上加入：
管5 hexanueleotide mix 2ul —六聚体引物混合物
管6 dNTP mixture 2ul—dNTP 混合物
管7 Klenow enzyme 1ul 聚合酶
3．混匀，短暂离心，37℃水浴20小时（至少60min）；
4．加入0.5M EDTA 2ul (pH8.0)，终止反应；
5．沉淀：加入4 M LiCl 2.5ul和预冷100%乙醇75ul，混匀，-70℃ 30分钟或-20℃ 2小时。目的沉淀DNA探针
6．离心12000r, 15min，倒掉，再加入预冷70％乙醇50ul，离心数分钟，倒掉；
7．空气干燥，加入TE-buffer 50ul
（注：在挥发乙醇时，不能太干，防止DNA不溶解）
三、实验操作
1、甲醛-琼脂糖电泳
1） 36ml水溶解0.75g琼脂糖，水浴至60℃，加入5ml 10×MOPS电泳缓冲液及12.3M甲醛(37%) 9ml（注：溶解在用微波炉溶解琼脂糖，尽量防止水分挥发，可以使用底火1.5分钟）
2） 铺制凝胶，拨去梳子，放入电泳池，加入1×MOPS，约400ml，电泳缓冲液使其淹没凝胶1mm左右；
（注：凝胶凝固较慢，应该放在4℃，约需要1小时，拔起梳子时，应该垂直、快速拔起，防止粘连，使底部暴露。）
3）在一EP管中加入以下物品，混匀，短暂离心，55℃保温15分钟；然后放在冰上加样，以消除RNA的二级结构。
RNA样品 11ul
10×MOPS电泳缓冲液 5ul
12.3M甲醛 9ul
甲酰胺 25ul
4）加入5ul加样缓冲液，总体积55ul，混匀，在5v/cm电压下（80mv）电泳至溴酚蓝泳动了凝胶长度的2/3；约需要1.5-2小时。点样时应该避免点在边上的孔中，不利于转膜时覆盖橡胶膜。（注：剪膜大小约10x9cm，此时应该把用DEPC水把尼龙膜自然浸湿，约需要3h）
5）取出凝胶，用0.01N的 NaOH和3M NaCl洗涤15min×2次；
6）用真空转移器把RNA从胶上转移至膜上，以0.01N的 NaOH和3M NaCl为转移缓冲液。 10cmHg，3 hr；
（注：连好后应该实验一下，然后在放置凝胶，凝胶比较软，应该果断的把凝胶取出，并且反转一下，利于转膜，不能有气泡，应该用玻璃棒轻轻赶出，液面始终高于凝胶才有效，避免加样孔接触尼龙膜边缘，不利于抽真空，把凝胶取出后应该用含有溴乙啶的溶液浸泡，观察转膜效果）-
7）烘烤膜：120℃ 30分钟 （或将膜RNA面朝下UV照射3-5分钟）。（注：可以在此步进行斑点杂交，以检验后边的步骤，在烤膜时应该用两张干净的滤纸包住，以防止膜在高温下转曲，发生交叉污染）
2、预杂交：加入杂交液，50℃ （或42℃）水浴3hr或过夜。（注：可以用68℃进行预杂交，而且应该预热杂交液，在预杂交和杂交时转速不能太快，大约8转/min，而且转膜面向内使之洗到膜）
3、杂交（2.5ml/100cm2）：在3ml杂交液中加入探针（10-100ng/ml），开始杂交16小时。（取标记探针约25ul，沸水加热10min，迅速冰浴，加入杂交液中混匀，并避免起泡，50℃ 或42℃水浴或过夜，探针量应该提高在0.5-3ug，注意杂交液一定要回收，可以反复利用）
4、洗膜、检测：
洗液Ⅰ （50ml/100cm2） 5min×2次
洗液Ⅱ （50ml/100cm2） 15min×2次，振荡洗涤 （68℃）
washing buffer 2min，换袋
blocking buffer（100ml/100cm2） 30min
150 mu/ml of anti-DIG-AP in blocking solution（稀释1:5000） 50ml, 30min
washing buffer (100ml/100cm2) 15min×2次（除去未结合的Ab）
detection buffer 20ml, 2-5 min（平衡膜）
color solution (detection buffer 10ml + 管9 200ul，新鲜配制) 30min (5min-过夜)。显色期间不能晃动。显色完后，把膜浸入水中10分钟，干燥后保存。（注：应该放在黑暗密闭的容器中，避光、防止震荡）
＊含标记DNA的杂交液可于-20℃保存并重复使用。使用前将杂交液100℃沸水浴10分钟。
＊二次杂交：将已杂交过的膜浸于二甲基甲酰胺中，50-55℃水浴脱色数分钟，用DEPC水漂洗后；除去探针：formamide,50%(v/v)，50mM -HCl(pH8.0), 1%(w/v)，将膜完全浸于液体中，68℃孵育1小时。在水中浸洗膜，然后置2×SSC。干燥膜或直接用于杂交。
＊Quantification procedure: 用dilution buffer(管3)稀释试剂盒中DIG-标记的管1对照DNA（1:5,1:50,1:500,1:5000）与靶DNA探针（1:1,1:10,1:100,1:00），将其变性（沸水浴后迅速冰浴），各取1ul点到上，将膜于80℃ 2h或UV照射3分钟，按标准步骤进行染色、显色、照相。
“我们希腊是冠军”兄综合了这么多资料，真得不错！但最好标明出处，因为8楼的方法由我的朋友主笔，我也好给他个交代吧。不好意思！但学术精神仍然值得褒奖。
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