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蛋白质研究技术 主讲:王世立 研究员 shili@ 电话:座机电话号码 山东省医药生物技术研究中心
第一节、蛋白质的分离与纯化 一个哺乳动物细胞大约含有 10,000 种蛋白质。要研究它们的结构与功能,首先要把它们分离、纯化出来 但由于蛋白质在大小、带电性、水溶性等方面的差异,没有一种方法能够分离所有的蛋白质
首先讨论蛋白质分离、纯化的常规方法和技术,然后介绍膜蛋白(membrane protein )的分离
蛋白质分离纯化的基本原则 选择好的材料
摸清目的蛋白质的稳定性
探索有效的抽提法和浓缩法
建立一套层析的组合
以较好的方法贮存
蛋白质分离纯化的方法 粗提: ① 盐析 ③ 有机溶剂沉淀 ② 结晶 ④ 等电点沉淀 精提 : ①
离心(centrifugation) ②
电泳(electrophoresis) ③
层析(chromatography)
① 离心(centrifugation) 原理:悬液中的各种粒子(细胞,细胞器及分子)有不同的分子量(mass)或密度(density),因此离心时有不同的速率
不同的蛋白质分子量差别很大,但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是 1.37 g/cm3。 除非蛋白质结合了脂或碳水化合物,蛋白质之间密度的差异不会超过 15%
离心力由转速和从转子中心到蛋白质界面的距离决定
① 离心(centrifugation) 沉降系数(sedimentation constant)与蛋白质的密度和形状有关,也与介质的密度和粘度有关 离心可用于两个方面: 作为一种分离技术从混合物中分离一种成分 作为一种分析技术测定物质的物理性质,如分子量,密度,形状及平衡结合常数(equilibrium binding constants)
Ⅰ. 差速离心(differential centrifugation) 用于从组织匀浆中把可溶性的 蛋白质与细胞的不溶性成分分开
离心后,蛋白质留在上清 (supernatant)中,其他成分
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Gel filtration,凝胶过滤(分子筛)原理与应用
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&&对​分​子​筛​的​原​理​进​行​分​析​,​具​体​说​明​如​何​应​用​分​子​筛​进​行​纯​化​蛋​白
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