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【求助】siRNA转染讨论
基因沉默老师：
您好！您是RNAi干扰的高手。我是个菜鸟，许多问题不清楚。我想请教您几个问题，麻烦了，谢谢！1、&&siRNA是小分子干扰RNA，那么我们实验设计RNA干扰片段应该是RNA才对，这样它才能够与目的基因上互补序列的mRNA发生基因沉默作用。但是我看到许多文章有的是设计互补的DNA片段，有的是RNA片段，设计好之后再构建载体.那么我胡涂了，做实验的时候是用哪个呢？是设计RNA还是DNA?还是两者都可以用吗？如果都可以的话，两者有什么区别呢？2、&&还有一个就是转染后检测各项指标的时间问题。有些文章提到说转染siRNA进入要检测的细胞后，开始检测指标.但有些文章是在转染24h后检测，有些则是在转染48h、72h 、96h后检测，那么我又不清楚了，这个转染时间是自己定，还是有什么标准没有？我想这个应该与siRNA存在时间有关吧,但具体原理不清楚,望赐教.3、&&还有一个就是siRNA转染浓度问题。在构建好siRNA的载体之后，准备将其转研究细胞时，siRNA转染浓度根据说明书上定,还是要自己摸索,自己摸的话,转染浓度怎么定才好呢?
以上是我的菜鸟问题，麻烦基因沉默老师了，再次感谢！基因沉默老师,你不在吗?等待你的出现啊!哪位战友会,也恳求你回答,谢谢啊!我也是基因沉默的初学者，只是最近准备课题，所以关于基因沉默的文献看了一些，siRNA分子可以在体外转录生成后转染入细胞，此时的转录到细胞中的为RNA片段。siRNA也可以在体外构建表达框架，进入细胞后，在细胞内RNA聚合酶的作用下，转录生成。此时转染入细胞的是编码siRNA的DNA片段，该DNA片段前缀RNA聚合酶的启动子整合入质粒、病毒或者是siRNA表达框架中。载体和表达框架的设计则各有不同了。至于检测时间和转染浓度，应该参考文献或者是根据做预实验测出最佳检测时间或最佳转染浓度。我只能回答这些，因我也是初学者，所以仅供参考哦siRNA设计时候是针对mRNA,siRNA一般都是以化学合成的RNA为概念，而shRNA是载体法是设计的DNA片断，两种不同的方式。从NCBI网站上获得序列有cDNA,mRNA;或者基因组DNA。
我建议的是mRNA水平检测在24h开始，蛋白水平在48h开始。
转染的浓度根据具体的细胞株，具体的转染试剂的操作手册来确定！目前推荐的浓度一般在终浓度100nmol.学习中。。。。。。。不同基因的蛋白半衰期不同，RNAi方法不一导致产生足够siRNA的时间不一，所以最佳检测时间会有不同；需要自己确定最佳时间，做个时间梯度吧，一般48h就够了。但要是siRNA而不是载体介导的shRNA，要注意siRNA的效果短暂这个问题，时间太长效果就差了。好久没有上网了,谢谢各位老师.在这里我也想请教基因沉默老师几个问题：１．化学合成的siRNA转染细胞后，靶基因沉默时间一般小于72小时。从一些文献来看，成功完成转染需要24-48小时，疑惑的是：沉默时间72小时，包不包成功完成转染时间？上面提到检测转染效率是在siRNA转染后24小时测mRNA水平，48小时测蛋白水平，那么这些时间包括在72小时里面吗？2 ．我实验目的是瞬时转染原代细胞，然后在常氧及缺氧情况下培养24小时，测细胞增殖凋亡情况。想请教的是：培养24小时，其时间起点从何算？是转染48小时后，测到靶蛋白水平下降以后为起点吗？
谢谢！谢谢基因沉默老师的回答。
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【求助】LipofectamineTM 2000 转染siRNA 转染效率
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这个帖子发布于4年零119天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
LipofectamineTM 2000转染siRNA，用的小鼠T细胞，一般转染效率多少？最好有文献支持！我转染效率可以达到80-85%，做了多次结果都很稳定，但老板说不可能，请问一般转染效率为多少？我用流式细胞仪检测的转染效率（FAM-siRNA），请高手指教，有相应文献支持或提供更好！再次谢谢！可以加丁当！
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看看PNAS这篇文章吧 （
)，达到那么高的效率，很悬。一般转染质粒用LF2000，转染siRNA用RNAiMax。
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我没用过LipofectamineTM 2000，据说毒性蛮大的，试用过promega、polyplus的，对不同的细胞系，还是先试用以后，在决定买。
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LipofectamineTM 2000转染siRNA 细胞毒性比较大，干扰效率一般可以达到70-80%（定量PCR验证结果），但一般需要用WB验证其干扰效果。目前siRNA 干扰选择用RNAiMax比较多，细胞毒性相对小，转染效率高，用量少。用流式细胞仪检测的转染效率你能初步看到转染率不能验证干扰率或基因过表达水平。要从蛋白水平验证才有效，
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可以用其他方法检测看看。
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能请教下楼主流式测上述转染效率的具体步骤吗
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lipo我试过最高大约70%吧
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想问一下楼主用流式检测si-FAM 转染效率的步骤？谢谢！
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想问一下楼主用流式检测si-FAM 转染效率的步骤？谢谢！ 同问？？？
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lipo2000转染sirna的效率大概在70%左右，但是细胞死亡率高，不是很推荐使用，我们实验室用的是RFect小核酸转染试剂，专门针对sirna和mirna转染的，转染性能很不错，细胞死的也少。
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关于丁香园君，已阅读到文档的结尾了呢~~
qpcr和电泳对sirna转染效率鉴定分析
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qpcr和电泳对sirna转染效率鉴定分析
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3秒自动关闭窗口　　本文收录了与siRNA转染相关的常见问题，并附上QIAGEN专家的解答，希望能对您的实验有帮助。
Q：我该如何优化siRNA转染？
A：在实验室中建立RNAi和研究每一种新的细胞系时，应当优化siRNA的转染。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含优化的有用信息（）。在优化实验中，转染效率可通过阳性对照（如AllStars Cell Death Control siRNA）的转染来监控。
应当优化的转染因素包括：
试剂和siRNA的量
转染时的细胞汇合度
分析前细胞和复合物的孵育时间
Q：转染少量的siRNA为何很重要？
A：高浓度的siRNA转染可能产生脱靶效应，即siRNA影响了部分同源或非同源基因的表达。研究表明，可能会对RNAi实验产生误导结果的脱靶效应可通过降低siRNA浓度而在很大程度上避免（1,2）。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的高效吸收，实现了低浓度下的基因沉默，而不损害knockdown的效率。
Q：在siRNA转染过程中为何应当避免细胞毒性？
A：siRNA导入所引起的细胞毒性干扰了RNAi后的数据分析，因为表型分析不再可靠。影响数据分析的因素包括转染试剂所引起的表型改变，压力所引起的基因表达改变，以及不应当用于分析的死细胞的存在。
HiPerFect Transfection Reagent对细胞无毒性，不会引起液泡形成（这标志着细胞进程的破坏）。详细的细胞周期和细胞形态学分析显示mock转染的细胞（只有HiPerFect Transfection Reagent）和未转染的细胞之间无差异。
Q：顺式转染和反式转染之间有什么差别？
A：在反式转染的步骤中，siRNA先加在平板的孔中，然后才是转染试剂。在复合物形成之后，加入细胞。顺式转染则相反，先在孔中加入细胞，然后才是复合物。反式转染使用广泛，特别对于高通量实验，因为它容易自动化，转染前siRNA可储存在孔中，且使用了较少的材料，因为不需要在一块单独的板上开展siRNA-转染试剂复合物的形成。
参考文献：
1. Semizarov, D., Frost, L., Sarthy, A., Kroeger, P., Halbert, D.N., and Fesik, S.W. (2003) Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 6347.
2. Persengiev, S.P., Zhu, X., and Green, M.R. (2004) Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA 10, 12.
本文翻译自QIAGEN公司的《Flexible RNAi Technologies You Can Rely On》。
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联系信箱：PEI进行基因转染中N/P比怎么计算？ - 实验交流 - 生物秀
标题: PEI进行基因转染中N/P比怎么计算？
摘要: [PEI进行基因转染中N P比怎么计算？] 我用PEI进行基因转染，好多文献上提到N P比，请问N P比是怎么计算出来的？PEI又是怎么和DNA反应结合的呢？请做过这方面的朋友指点一二！谢谢！ 关键词:[分子量 转染 基因 线状 复合物]……
我用PEI进行基因转染，好多文献上提到N/P比，请问N/P比是怎么计算出来的？PEI又是怎么和DNA反应结合的呢？请做过这方面的朋友指点一二！谢谢！回复法。。。。。。回复你有没有？麻烦发给我几篇吧，谢谢:)回复只有法吗？还有没有别的方法？文献上好像没有提到怎么计算的回复PEI中43分子量对应一个N， 或者RNA中325/330分子量对应一个P，N/P计算根据分子量可以算出质量比，质量比接下来就好办了吧，比如PEI与形成的复合物N/P=10，质量比就是10×43/330=1.3，回复
PEI中43分子量对应一个N， DNA或者RNA中325/330分子量对应一个P，N/P计算根据分子量可以算出质量比，质量比接下来就好办了吧，比如PEI与DNA形成的复合物N/P=10，质量比就是10×43/330=1.3， 你说的PEI是分枝状的还是线状的？我用的是25k的分支状PEI，也是这么算的吗？回复
你说的PEI是分枝状的还是线状的？我用的是25k的分支状PEI，也是这么算的吗？ 你观察下结构就知道了，算法一样回复
你观察下结构就知道了，算法一样 能具体地说下吗？我不太明白怎么算的回复
能具体地说下吗？我不太明白怎么算的 结构中都是43的分子量对应一个N回复
结构中都是43的分子量对应一个N 嗯，谢谢回复
结构中都是43的分子量对应一个N 你不是应助贴，我没办法给你金币哦:shuai:回复以25 kDa branched PEI为例，w/w 1.33的时候，N/P是10，是最佳配比，其实用w/w比是一样的，而且更直观回复
以25 kDa branched PEI为例，w/w 1.33的时候，N/P是10，是最佳配比，其实用w/w比是一样的，而且更直观 :hand:
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