连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来(菌落,单菌落,条带,摇菌) - DNA技术 - 生物秀
标题: 连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来(菌落,单菌落,条带,摇菌)
摘要: [连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来(菌落,单菌落,条带,摇菌)] 载体是连接有EGFP的瞬时表达载体，有氨苄抗性。转化到DH5α中，涂含氨苄的平板。倒置培养12个小时候未见菌落，但是17个小时候有菌落，且密度不是很大，单菌落数不多不少的样子。我先是挑单菌落摇菌，准备做菌液pcr，但是37°C转速200培养过夜之后LB培养基仍然是清亮的，没有任何菌生长。再挑单菌落，换了别人配的LB震荡培养，仍然是没有摇起来。最后我挑单菌落加到20μl的水中做菌落pcr，设置了空白 关键词:[菌落 单菌落 条带 摇菌 培养基 连接载体 载体]……
载体是连接有EGFP的瞬时表达载体，有氨苄抗性。转化到DH5α中，涂含氨苄的平板。倒置培养12个小时候未见菌落，但是17个小时候有菌落，且密度不是很大，单菌落数不多不少的样子。我先是挑单菌落摇菌，准备做菌液pcr，但是37°C转速200培养过夜之后LB培养基仍然是清亮的，没有任何菌生长。再挑单菌落，换了别人配的LB震荡培养，仍然是没有摇起来。最后我挑单菌落加到20μl的水中做菌落pcr，设置了空白对照，pcr结果显示空白对照没有条带，其它菌落pcr只有两个未扩出条带。将pcr条带最亮的几管分别加到4mlLB培养基中，再加入4μl氨苄，37°C振荡培养过夜。最后居然还是没有菌落生长，培养基一片清亮······我在网上查到说，挑单菌落的时候可能挑到平板上未干的连接液，连接液里可能含有未连接到载体上的目的片段，所以pcr可以扩出条带。但是我很确定我挑到了菌落，肉眼看到菌落慢慢的分散开来然后水变浑浊。即使是空载，摇菌应该也能摇起来。平板是刚刚倒的，氨苄的作用肯定存在。氨苄也没问题，别人刚用过我直接拿过来用的，别人的结果没出问题。以前挑过很多次菌，菌液pcr也做过，，都没有发生这种状况。我觉得我的操作没有问题，但是实在是找不到原因了，哪位高手给指点一下啊……昨天刚刚又转化了一次，现在已经有14个小时了，肉眼只能看到几个小菌落。一般来说12个小时应该就长得差不多了。转化涂板用的是新配制的氨苄板，菌落生长缓慢会不会是感受态细菌的问题呢？细菌没有接受外源抗性质粒的活性了，但还是能缓慢的在含氨苄的平板上生长，在含有氨苄的LB液体培养基里培养24个小时也不会快速的生长。是不是这样呢？
回复我最近也是出现这个问题 1500bP的片段 连在T载体上准备去测序 可是板子要等16个小时才长出一两个斑
跳出来做菌落PCR竟然是正确条带 可是菌却摇不起来 崩溃了都……回复是不是转化出的问题？没有转进去？做菌落PCR的时候挑单菌落时有附带的连接液，所以能P出来？回复我也遇到相同问题~ 求解答呀~
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电话：021-电动车空载时电机转动有噪声,负载后电机不转,换控制器后,电机不转，是什么原因啊~望高手指教！_百度知道
电动车空载时电机转动有噪声,负载后电机不转,换控制器后,电机不转，是什么原因啊~望高手指教！
动车空载时电机转动有噪声,电机空载都不转，是不是电机霍尔线烧了还是和控制器的电流型号不同有关系,负载后电机不转,换电流型号不同其它参数相同的控制器后
我有更好的答案
电机的获儿线短了换个无获儿的控制器就好了但是没有力气了望采纳
有可能是线路接触不好，也有可能是控制器或电机不好
你电机内部的一相霍尔坏了，
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【求助】连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？
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这个帖子发布于3年零346天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做原核表达载体的构建。连接转化后，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落送测序后，结果说是混合克隆是怎么一回事，什么是混合克隆？混合克隆能分离出含有目的基因的单克隆吗？还请各位多多指教？
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挑单菌落的时候不小心挑到其他克隆，就会造成套峰了，你可以将菌液在涂个板，然后再挑取单克隆
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通常如果测序结果是在载体序列后面从插入片段入开始出现双峰，由此可以判断此样品为非单一克隆（）即质粒中含有两种以上插入片段长度不同的质粒，或者样品中存在特殊结构测序后双链解旋不充分如果测序是空载的情况，可能有以下一些常见原因：◆出现了假阳性，培养时间不能过长，时间太长会出现卫星菌落。◆鉴定过程中的假阳性克隆。产生这种现象的直接原因是质粒制备过程中产生了变性的超螺旋质粒，它无法被限制性内切酶酶切；◆可能在培养过程中样品本身不稳定（游离在菌液中）而导致发生插入片段的丢失。这种情况的发生无法事先预期到；◆挑取的克隆样品为空载与带有插入片段的重组子的混合克隆，在经过再次培养时空载体的增值速度大于重组子从而导致重组子的衰亡；◆商用感受态细胞质量问题，如果在-60度（而不是-80度左右）放一段时间，转化效率就会大大降低。所以连接产物或许有很多阳性的片段,但最后转化时都转化不进感受态细胞,涂板时都散落在板子上,这样就造成了假阳性。◆载体反复冻融多次的话，可能会多掉几个碱基，也可以破坏读码框，自连后转化不成蓝斑。◆再有载体自连是做为背景存在的，有可能是载体没有100％加上“T”造成的，也有可能是不小心带入核酸外切酶污染造成的。可以把试剂盒里面的Control
Insert做一下。
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关于丁香园离问题还有
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我最近在做载体构建，使用的是Myc载体，用Ecol1 和HindIII 双酶切，使用的是Ecol1的Buffer，37度12个小时，目的基因酶切2个小时，目的基因八百多个碱基，目的基因引物合成后拉出，酶切后胶回收，连接16度过夜，然后转化，用的是氨苄平板，可是做了好几次也不见有菌落长出，经验证，感受态没有问题，我都做得很崩溃啦，大家帮帮我吧，感激不尽呀！！！
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提问者： [] [] []
欢迎您用专业知识为他人答疑解惑，花三五分钟，帮别人解决一个问题，快乐自己一天！
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秀友回答 (8)
既然感受态没问题 应该是你做的酶切的问题！
你可以问问你师兄师姐这种情况。或者换一个体系
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回答者： 一级 一星助者
我们实验室做这个也做了很久，师姐把转化后保种的菌又摇了16个小时，再涂平板，发现长菌了，你试试行不？
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回答者： 一级 一星助者
建议摇菌过夜，再涂平板，如果还没有涨菌，对质粒进行奠定，看看连接有没有问题。
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回答者： 一级 一星助者
检查一下引物末端的保护碱基，建议4个或者以上，
或者先克隆到t-载体或者topo载体上，而后切下来再连接。
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回答者： 一级 一星助者
涂平板前先浓缩一下试试，即低速离心一下，多去掉一些培养基。我当时就是这样才有结果的
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回答者： 一级 一星助者
可能是没有酶切彻底或者是切碎了，双酶切选择buffer时要同时兼顾两个酶的最佳酶切buffer(最好两酶出于同一公司，可以查得到)，酶切载体后跑胶回收确保一定的回收率，还有酶切时间（根据酶的效率来定）。转化后方37&45min使其表达抗Amp蛋白，再涂板，好运。
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回答者： 一级 一星助者
一般不长菌都是连接没有连接上，连接上12个小时就应该有长菌了，研究下连接体系看看有没有问题。一般载体与目的片段的摩尔比为1:10进行连接。
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回答者： 一级 一星助者
我最近也遇到了同样的问题，做了两次了，平板上没有任何菌落长出，按说应该能长几个假阳性的克隆的，不知道怎么回事，正在努力查找原因中
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生物秀旗下 [Website]连接后转化不成功急(菌落,载体,电泳,连接产物) - DNA技术 - 生物秀
标题: 连接后转化不成功急(菌落,载体,电泳,连接产物)
摘要: [连接后转化不成功急(菌落,载体,电泳,连接产物)] 我做克隆已快俩个月了，一直转化不成功，平板上没有菌落生长或者长出来的菌经鉴定后无阳性克隆，很是着急，请教高手！我的目的片段1 8kb，载体用的PET41a，大小5 3kb，目的片段先连到T载体上，然后都用NdeI和SalI酶切，测浓度后，用1：8和1：10载体和目的片段比例16度过夜连接，相同体系做了两管，一管电泳确定有连接产物后，另一管做转化，电转和CaCl2转化都做过了，但始终没有菌落生长，或 关键词:[菌落 载体 连接产物 电泳 无阳性克隆 克隆 酶切]……
我做克隆已快俩个月了，一直转化不成功，平板上没有菌落生长或者长出来的菌经鉴定后无阳性克隆，很是着急，请教高手！我的目的片段1.8kb，载体用的PET41a，大小5.3kb，目的片段先连到T载体上，然后都用NdeI和SalI酶切，测浓度后，用1：8和1：10载体和目的片段比例16度过夜连接，相同体系做了两管，一管电泳确定有连接产物后，另一管做转化，电转和CaCl2转化都做过了，但始终没有菌落生长，或者有几十个菌落生长，PCR鉴定没有目的片段出现。平板抗生素(antibiotic)用的是卡那抗性，30μg/ml。感受态是DH5α，用质粒转化后有菌落生长，转化效率应该没有问题，但为什么连接成功后，转化还是没有菌落生长呢？急啊！还有连接体系，一般用多大的体系？10μL，20μL可以吗?转化后用SOC复苏，是什么条件？37度，200转，40分钟可以吗？请求高手赐教！谢谢！
回复最近，我有一个做了两次转也转不上，其他的都转上了你的问题：不知道。SOC复苏，这些都是无所谓的。转进去的话，热激完，都可以直接涂板的。可以考虑：1、你再连接一次，转的时候拿你的PET41a载体或是已连基因的T载体做阳性对照，与感受态混合冰浴30min，42度热激90秒或37度热激5min，冰浴2～5min，加培养基4倍体积培养基，37度，200～250转，45min。2、你的基因表达对DH5a有没有毒性？？3、确定你的PET41a是抗卡那的吗？？4、人状态不好，还个人做吧!找个新手来5、不过实在不懂。你说“或者长出来的菌经鉴定后无阳性克隆”，说明你转进去了，感受态、抗性应该都对；你说“一管电泳确定有连接产物后”，说明你也连上了，至少是有一个酶切位点连上了。疑问：a. 确定你的酶切位点都对吗？？b.为什么要连接两管，最好你电泳验证的那管拿来转化。两管，或许会有差别呢。你这个对照不科学的。回复From what you described, I don"t see any problem with your cloning protocol. I need to know how you purify the vector and insert DNA after Nde I and Sal I digestions.回复From what you described, I don"t see any problem with your cloning protocol. I need to know how you purify the vector and insert DNA after Nde I and Sal I digestions.我是从胶上回收的，切胶用试剂盒纯化的。回复一管电泳确定有连接产物后能看见么？平板抗生素(antibiotic)用的是卡那抗性，30μg/ml一般是50μg/ml吧200转转速高了，分子克隆上写了，要慢摇40分钟分子克隆上有，是90分钟。连接体系一般10就够了回复我想请问slj2008 "一管电泳确定有连接产物后" 这个是怎么证明的呢？直接把连接后的产物电泳吗？看大小吗？这个能看出来吗 谢谢回复我想请问slj2008 "一管电泳确定有连接产物后" 这个是怎么证明的呢？直接把连接后的产物电泳吗？看大小吗？这个能看出来吗 谢谢是的，我是取10微升的连接产物，电泳看的片段大小，我的确实有大小为7kb的条带，至于准不准确还不确定。回复Before setting up the ligation, precipitate your purified vector and insert with ethanol. Add 1-2 ul of 10 mg/ml of glycogen to increase precipitations.Set up ligation at RT overnight.回复谢谢大家的建议，继续努力！回复我也遇到类似的问题，mark一下来学习。回复又经过一个月的重复，我的转化成功了，现在总结一下：1、我的目的基因酶切用的是PCR产物，酶切过夜，保证酶切彻底。酶切后直接用试剂盒纯化。2、pet41a是切胶纯化。纯化时用水洗脱时，水加少一点，使浓度浓缩一下。3、连接之前跑一下电泳，估计一下浓度，连接时目的片段比例大一点。4、连接条件我用的是16度过夜，第二天加PET4000，22度反应3小时。5、转化我用的是电击转化，用空载质粒做对照，感受态是新鲜制备的。6、最后我的平板上长了三个菌落，PCR、酶切鉴定只有一个菌落是阳性克隆，险吧，呵呵~至于问题我到现在还不清楚出在哪里，很是奇怪！可能还是连接的问题，最后还要谢谢大家的帮助！回复理论上只有一个点就行了，可是现实中。。。。。有时间也不知道怎么了，成功了也不知道怎么成功的，失败了找了很多原因也没有找到，也许这就是的奥炒所在吧。。。。
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