哺乳动物性别鉴定的方法
哺乳动物的性别控制技术(一)X、Y精子的分离
1.X和Y精子的差异
从20世纪50年代开始，人们就对X和Y精子的大小、带电荷数、密度和活力等作了深入比较研究，但是目前发现除了X精子的染色体的含量高于Y精子和Y染色体上特异的SRY序列外，两者在其他方面没有明显差异。
2.X和Y精子的分离
当前X和Y精子较准确的分离方法是流式细胞器分类法，它的理论根据是两类精子头部DNA含量的差异。在家畜中，X精子的DNA含量比Y精子高出3%-4%。根据这一差异，准确的流式细胞分类仪可对X、Y精子进行分离。具体方法是:先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束，探测器可探测精子的发光强度并把不同强弱的光信号传递给计算机，计算机指令液滴充电器使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电，然后带电液滴通过高压电场，不同电荷的液滴在电场中被分离，进入两个不同的收集管，正电荷收集管为X精子，负电荷收集管为Y精子。用分离后的精子进行人工授精或体外受精对受精卵和后代的性别进行控制。
这种方法已用于商品化分离X和Y精子，分离的准确率达90%以上，每小时的分离速度为3-4&106个精子，用收集后的X或Y精子与卵子受精90%以上胚胎发育雌性或雄性后代。美国已有专门公司分离和出售牛和猪的X和Y精子。这一技术目前存在的主要问题是分离速度太慢，按照目前的分离速度，要获得一个输精剂量的牛精子，需花费近20h。如此长的分离时间直接影响精子的活率，导致受胎率下降。除了上述方法外，人们还根据精子表面膜电荷数、头部大小、重量、密度、运动能力和抗原性差异，
采用了电泳、密度梯度离心和免疫学等方法分离X、Y精子，但都未能取得满意结果，且重复率差，无法在生产
(二)早期胚胎的性别鉴定
运用细胞学、分子生物学或免疫学方法可对哺乳动物附植前的胚胎进行性别鉴定，通过移植已知性别的胚胎可控制后代性别比例。目前胚胎性别鉴定最有效的方法是胚胎细胞核型分析法和SRY-PCR法。
1.核型分析法
它是通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别，有XX染色体的胚胎通常发育为雌性，而具有XY染色体的发育为雄性。其主要操作程序是:先从胚胎中取出部分细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂中期，再制备染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成，确定胎胎性别。
这种方法的准确率可达100%，但是取样时对胚胎损伤大，操作时间长，并且获得高质量的染色体中期分裂相很困难，难以在生产中推广应用。目前，核型分析法主要用于验证其他方法的准确性。
2.SRY片段的PCR扩增法
它是近11年发展起来的用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。其原理和主要程序如下:先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因的一段碱基作引物，以胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测。如果胚胎是雄性，那么PCR产物与探针结合出现阳性，而雌性胚胎则为阴性。也可以对扩增产物进行电泳，通过检测SRY基因条带的有无判定是雄性或雌性。随着PCR技术的发展，现在只需取出几个甚至单个卵裂球就可进行PCR扩增，鉴定出胚胎的性别，并且准确率高达90%以上。这种方法取样少，对胚胎的损伤小，整个操作可在几分钟内完成，因而在生产中应用非常方便，有很高的商业价值，市场上已有家畜胚胎性别鉴定的试剂盒出售。运用这种方法进行胚胎性别鉴定的关键是杜绝污染，防止出现假阳性。
3.免疫学方法
这种方法的理论依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，但是这种抗原的分子性质目前尚无定论，因而结果不稳定，准确率也较低。其方法是先分离H-Y抗原，制备抗体，然后可通过三种方法把雌雄胚胎分离开。第一种方法是在胚胎培养液中加人抗体和补体,经一段时间培养，继续发育的为雌性，不能发育而退化的为雄性。第二种方法是先将胚胎与H-Y单克隆抗体处理后，再用荧光素标记的第二抗体处理，然后在荧光显微镜下观察，有荧光的胚胎为雄性，没有荧光的为雌性。第三种方法是在胚胎发育到桑椹胚阶段向培养液中加人H-Y抗体,继续培养一段时间后，出现囊胚的为雌性胚胎，停留在桑椹胚的为雄性。由于H-Y抗原是弱抗原，在操作过程中，观察人员的主观影响因素很大，因而结果的误差大，在实际生产中的运用目前还难以实行。
三、性别控制技术的发展前景从目前的性别决定理论分析，流式细胞器分类法和SRY-PCR扩增法是准确而发展前景广阔的两种性别控制方法。但是，前者由于分离速度太慢而影响其在生产中的应用.目前需要解决的关键问题是提高分离准确率和分离速度，并加强与体外受精和显微授精技术结合提高分离精子的利用率。运用SRY-PCR技术鉴定胚胎性别，关键是提高灵敏度，减少细胞取样对胚胎的损伤，另外，需要加紧研制各种家畜的SRY-PCR试剂盒，使这种方法的操作简单而实用。
运用细胞学、分子生物学或免疫学方法可对哺乳动物附植前的胚胎进行性别鉴定，通过移植已知性别的胚胎可控制后代性别比例。目前胚胎性别鉴定最有效的方法是胚胎细胞核型分析法和SRY-PCR法。
1.核型分析法
它是通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别，有XX染色体的胚胎通常发育为雌性，而具有XY染色体的发育为雄性。其主要操作程序是:先从胚胎中取出部分细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂中期，再制备染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成，确定胎胎性别。
这种方法的准确率可达100%，但是取样时对胚胎损伤大，操作时间长，并且获得高质量的染色体中期分裂相很困难，难以在生产中推广应用。目前，核型分析法主要用于验证其他方法的准确性。
2.SRY片段的PCR扩增法
它是近11年发展起来的用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。其原理和主要程序如下:先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因的一段碱基作引物，以胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测。如果胚胎是雄性，那么PCR产物与探针结合出现阳性，而雌性胚胎则为阴性。也可以对扩增产物进行电泳，通过检测SRY基因条带的有无判定是雄性或雌性。随着PCR技术的发展，现在只需取出几个甚至单个卵裂球就可进行PCR扩增，鉴定出胚胎的性别，并且准确率高达90%以上。这种方法取样少，对胚胎的损伤小，整个操作可在几分钟内完成，因而在生产中应用非常方便，有很高的商业价值，市场上已有家畜胚胎性别鉴定的试剂盒出售。运用这种方法进行胚胎性别鉴定的关键是杜绝污染，防止出现假阳性。
3.免疫学方法
这种方法的理论依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，但是这种抗原的分子性质目前尚无定论，因而结果不稳定，准确率也较低。其方法是先分离H-Y抗原，制备抗体，然后可通过三种方法把雌雄胚胎分离开。第一种方法是在胚胎培养液中加人抗体和补体,经一段时间培养，继续发育的为雌性，不能发育而退化的为雄性。第二种方法是先将胚胎与H-Y单克隆抗体处理后，再用荧光素标记的第二抗体处理，然后在荧光显微镜下观察，有荧光的胚胎为雄性，没有荧光的为雌性。第三种方法是在胚胎发育到桑椹胚阶段向培养液中加人H-Y抗体,继续培养一段时间后，出现囊胚的为雌性胚胎，停留在桑椹胚的为雄性。由于H-Y抗原是弱抗原，在操作过程中，观察人员的主观影响因素很大，因而结果的误差大，在实际生产中的运用目前还难以实行。
三、性别控制技术的发展前景从目前的性别决定理论分析，流式细胞器分类法和SRY-PCR扩增法是准确而发展前景广阔的两种性别控制方法。但是，前者由于分离速度太慢而影响其在生产中的应用.目前需要解决的关键问题是提高分离准确率和分离速度，并加强与体外受精和显微授精技术结合提高分离精子的利用率。运用SRY-PCR技术鉴定胚胎性别，关键是提高灵敏度，减少细胞取样对胚胎的损伤，另外，需要加紧研制各种家畜的SRY-PCR试剂盒，使这种方法的操作简单而实用。　1.2动物性别决定的机理未分化的性腺中胚层处于中性，如果Ｙ染色体存在，ＳＲＹ基因将自启动转录，在胚胎睾丸组织细胞系中表达产生ＳＲＹ因子。ＳＲＹ因子主要产生三方面的作用：一是激活下游的苗勒氏体抑制物基因ＭＩＳ（副中肾抑制基因）表达，从而抑制苗勒氏管的发育；二是抑制或对抗DSS（逆性别剂量敏感基因）基因产物，进而抑制卵巢发育；三是作用于间质细胞，使之分泌睾酮，使胎儿雄性化，导致阴茎、阴囊和其他雄性器官的形成。对于雌性动物，由于ＳＲＹ基因的缺少，使得Ｘ染色体短臂上ＤＳＳ位点基因转录，促进卵巢发育，而卵巢产生的雌激素使苗勒氏管发育成输卵管、子宫、子宫颈、阴道等。
　　ＳＲＹ基因仅仅是涉及性别决定过程的基因之一，近年来又发现和克隆了许多可能参与性腺分化和发育的基因，如Ｙ染色体上锌指结构基因（Ｚｉｎｃ－finger-Ygene,ZFY）是继ＳＲＹ之后又一和性分化有关的单拷贝基因，并与精子的发生有关，在Ｘ染色体上存在其同源序列ZFX[4]。另外还有上面提到的ＭＩＳ。ＤＳＳ基因以及ＳＲＹ基因的相关基因ＳＯＸ基因家族等。
　　2.家畜早期胚胎的性别鉴定
　　由于胚胎性别鉴定所潜在的巨大的经济效益以及其重大的意义，所以各国研究人员在该领域进行了深入的研究，目前已发展了许多胚胎性别鉴定的方法。
　2.1细胞生物学方法（染色体核形分析）主要是利用Ｘ、Ｙ染色体在形态上的差异，通过判定胚胎细胞性染色体是Ｘ还是Ｙ来鉴定胚胎的性别。该方法缺点或存在的困难是分析性染色体需要用分裂中期的细胞，而从桑葚期和囊胚期的胚胎里取出较多的分裂球才能获得处于分裂中期的细胞，这要降低胚胎性别鉴定后移植妊娠率。
　2.2免疫学方法
在８一细胞期至早期胚泡期，哺乳动物的雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子，即Ｈ-Ｙ抗原，利用Ｈ-Ｙ抗原和抗体免疫反应的原理可以进行胚胎的性别鉴定。
　　2.2.1胚胎的细胞毒性分析[5,6]
在补体（如豚鼠血清）存在的情况下，Ｈ－Ｙ抗体可以与ＨＹ+胚胎（雄性胚胎）结合，并使其中的一个或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈现不规则的体积和形状，阻滞胚胎发育，受影响的胚胎即为雄性胚胎，将经培养后发育正常的雌性胚胎进行移植就可使母畜只生雌性后代。但这种方法是以破坏雄性胚胎为代价，而且其准确率不高，经这种方法鉴定的Ｈ-Ｙ+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有８５％为雌性，这种方法很少被使用。
　　2.2.2间接免疫荧光分析法[5,6]以Ｈ-Ｙ抗体为一抗，用FTTC标记的Ｙ球蛋白（如山羊抗鼠Ｙ球蛋白）作为二抗，将上述两种抗体依次与胚胎共同培养，雄性胚胎上的Ｈ-Ｙ抗原先与一抗结合，一抗再与二抗结合，然后通过洗涤将未结合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC标记，故在荧光显微镜下显荧光，雄性胚胎显荧光，不显荧光者为雌性胚胎。这是一种非损害性胚胎性别鉴定法，鉴定过的胚胎都可以存活。但准确率不高，牛83％、绵羊为83％、猪为81％。
囊胚形成抑制法利用Ｈ-Ｙ抗体能够可逆性抑制囊胚形成的原理，将Ｈ-Ｙ抗血清与桑葚胚共培养，一段时间后雄性胚胎由于具有Ｈ-Ｙ抗原被Ｈ-Ｙ抗体所抑制，不能形成囊胚，而无Ｈ-Ｙ抗原的雌性胚胎则不受影响继续发育成囊胚，因此可以将雌、雄胚胎分开。然后可洗去Ｈ－Ｙ抗体，雄性胚继续发育。这种方法鉴定的胚胎存活率与正常无异，其正确率为８０％左右。但只能检测桑套期前的胚胎，如果胚胎已发育至囊胚，则无法鉴定。
　　2.3测定卵裂球Ｘ_染色体连锁基因剂量鉴别胚胎性别[7]从胚胎中取出一个卵裂球，采用双重微量测定法，测定其与Ｘ_连锁的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＨＰＲT）和与常染色体连锁的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＡＰＲＴ）的活性。由于在８一细胞阶段，雌性胚胎中的两条Ｘ染色体均有活性，因此可根据ＨＰＲT活性在基因剂量上的两倍差异，得到ＨＰＲT与ＡＰＲT比率的双态分布图，因而鉴别出雄性和雌性胚胎，该方法比较繁琐，所需时间长。
　　3分子生物学方法
　　3.1ｙ-染色体特异性ＤＮＡ探针利用Ｙ-染色体特异的ＤＮＡ探针与Ｙ-染色体的ＤＮＡ进行特异性结合，以鉴定胚胎性别的一种方法。早在１９８８年，ＥｉｌｉＳ等就将牛的Ｙ-染色体ＤＮＡ重复序列探针用于牛胚胎的性别鉴定。用于检测的方法有两种：一种是原位杂交；另一种是用探针与ＤＮＡ提取物相结合。这种方法的准确率超过９５％。但是这些特定序列通常具有种间特异性，所以对每种动物都必需研制不同的探针。另外，原位杂交有时还需使用放射性物质，这种方法没有被推广。
　　3.2聚合酶链式反应（ＰＣＲ）应用于胚胎性别鉴定ＨｅｒＴ等（1990）首先成功建立了家畜胚胎性别鉴定的ＰＣＲ法[8]。ＰＣＲ法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术。即通过合成ＳＲＹ基因或其他Y-染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行ＰＣＲ扩增反应，能扩增出目标片段的胚胎即为雄性胚胎，否则即为雌性胚胎。由于ＰＣＲ极为灵敏，所以只要从胚胎中取出几个细胞就可以进行性别鉴定，这对性别鉴定后胚胎移植的妊娠率没有影响。龚荣慈，等实验表明，只要8ｐｇ的ＤＮＡ即可检出ＺＦＹ、ZFX序列而判定胚胎的雌雄[12]。在国内，曾溢滔，等（１９９１）就通过对牛ＳＲＹ基因的直接测序，设计引物用ＰＣＲ扩增ＳＲＹ基因来检测奶牛胚胎的性别[9]，杨建明，等[10]（１９９５）、欧阳红尘[11]（１９９５）等则通过扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列来鉴定牛早期胚胎性别，而龚荣慈，等设计了特异于牛ＺＦＹ基因的引物对奶牛基因组ＤＮＡ进行ＮestPCR来进行性别鉴定。黄淑帧，等通过扩增ＳＲＹ基因对转基因试管牛和试管羊胚胎进行了性别鉴定，得到的转基因牛和转基因羊的性别和鉴定结果完全一致[13]
用ＰＣＲ鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为：①胚胎的获取：冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别；②引物的设计：根据Ｙ染色体上的性别决定基因或特异性片段设计引物，同时设计一对公母共有基因引物作为内对照，避免假阳性的发生；③用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞热处理后进行ＰＣＲ扩增；④电泳检测。能同时扩增出Y-染色体上相应片段和公母共有基因片段的胚胎即为雄性胚胎，而只能扩增出共有基因片段的胚胎即为雌性胚胎。
　　ＰＣＲ鉴定胚胎性别的研究成功，使胚胎的性别鉴定进入了一个崭新的发展阶段，但是只有进一步研究简易快速的胚胎切割取样技术、胚胎性别鉴定的ＰＣＲ试剂盒以及取样胚胎的冷冻保存技术，才能达到推广应用阶段，相信在不久的将来，所
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动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中意义重大。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性的危害。性别控制可以通过精子分离或胚胎性别鉴别来实现。
性别控制 -
降性别遗传病病，有四百多种，现实中常常见到的病有、抗维生素D佝偻病、磷酸盐血症、症等；常见的病有红绿色盲、蚕豆病、血友病、假性肥大型肌营养不良、先天性丙种球蛋白缺乏症、等，病也有十几种。性连锁遗传病，相对容易预防，原因就是可以通过性别控制来实现。因为性连锁疾病可以随着性别的不同，而表现出正常人、携带者或者患者，所以可以通过控制性别的方式，获得这个家族健康的男孩或者女孩。遗传优秀素质在夫妻之中，两个人存在着明显的综合素质差异，比如说女方综合素质比男方好的多，那么有目的的生育一个男孩是最好的，因为男孩可以把母亲的优秀素质继承到极致；如果男方的综合素质好，生育一个女孩，往往更多的继承来自父亲的优良基因。
男性与女性的不同，仅仅是在性染色体上的不同。男性是XY，女性是XX，X染色体携带基因比较多，基因组工程的报告是1090个，Y染色体相对较小，携带基因量也少，为144个。
男性性染色体中的X，必然来自于母亲，因为父亲提供Y，那母亲只能提供X，这是毋庸置疑的。X基因量大，因此，男孩像母亲。
对于女孩，有两条X染色体，但这两条X染色体并不是都发生作用的，在遗传上一条是失活的，染色质，因此，女性的基因产物，同具有一条X染色体的男性差不多，在遗传学上这叫做。
女性两条X染色体中，来自于母亲一条，来自于父亲一条，但到底是哪一条失活，原先认为是随机的，现在认为，失活也是一次身体内的自然选择，自然的法则就是优胜劣汰，这个时候，没有质量损失的一方，是容易保留的，比如说，精子新鲜，在射精后很快遇到已经排出的卵子，这个时候精子质量更好，因此，来自于父亲的X染色体占优势，母亲的被失活。如果射精后精子已经开始老化，质量下降，这个时候排卵，就会是以母亲的X染色体遗传为主；如果都老化或者都新鲜，那就是随机的，看哪一方以微弱的优势被选择。
因此，男孩更像母亲是肯定的，女孩大部分情况下更像父亲，也有一部分是随母亲的。医生认为，临床上，男性的精子优化更好控制一些，因此，实现女儿随父亲是比较容易的，不存在技术难度。性别控制更有利后代，这也是优生的要求，实行性别控制，对于很多家庭是有非常重要的优生意义的。
性别控制 -
性别控制主要包括两个方面，即受精之前和受精之后。前者是通过对精子的体外干预，使在受精之时便决定了后代的性别。后者是通过对胚胎性别进行鉴定，从而获得所需性别的后代。性别控制技术在畜牧生产中具有重要意义，首先，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快畜禽育种进程，同时也可提高珍稀动物的繁殖、保种进程；其次，通过控制胚胎性别可以及时克服牛胚胎移植中出现的异性双生不育的现象；第三，可使受性别限制的生产性状（如泌乳、产蛋）和受性别影响的生产性状（如生长速度）的生产能力得到充分发挥，从而获得最大经济效益；第四，可以防止性连锁遗传疾病，迅速降低伴性有害基因在群体中的频率。精子的流式细胞仪分离法（1）生物学原理
哺乳动物精子的遗传物质以致密的单倍体染色质形态存在于精子细胞核内，因X、Y性染色体相差很大，致使两性精子DNA总含量可相差3%～4%。这就是人们多年以来梦想通过重量或密度的不同来分离两性精子而达到性别控制的惟一根据。但由于不同发育时期的精子尾部和顶体的大小差异往往会掩盖染色质含量的微弱差异，故较大的Y精子很可能会重于较小的X精子。所以，依据整个精子的重量或密度来分离两性精子的方法一般不会很理想。目前，最可靠的分离精子方法是根据X和Y精子的DNA含量存在差异的原理，利用改良的流动细胞测定仪分离X和Y精子。
（2）流式细胞仪工作原理
流式细胞仪由液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统等所组成，能够定量测定精子等多种单个细胞的细胞膜、胞浆以及核内的多种物质，而且具有测定快速、精确、多参数的特点。利用流式细胞仪进行精子分离前，先将可与DNA结合的荧光素染料（Hoechst33342）与稀释的精液共同培养；分离时，精液首先以极高的速度喷出，形成一个个极微小的液滴，存在于微滴中的单个精子因受到激光照射而产生出相应的光散射信号和某种颜色的荧光信号，前者的强弱反映精子细胞的大小、形态等，后者是由与DNA链定量结合的染料受到某种波长的光的激发而发射出来的，光学系统通过分析测出该精子的DNA含量，从而识别出其类型并以图表的形式在计算机上直观地显示出来；接着，分选系统依精子的类型分别施加以正负不同的电荷，使它们在电场中断续向前运行时定向偏转于不同的电极，这样，X精子和Y精子就可被分别收集到不同的容器中而予以分离，不含精子的微滴以及类型不能被识别的模糊精子会被仪器弃掉。
（3）优缺点
我们知道，精子核是被细胞质高度地包裹着，而哺乳物的精子又是不对称的，故精子因激光照射而发荧光时，如果精子的定位不正确，从半透明的扁平面发出的真正反映X精子和Y精子DNA差异的荧光与从精子边缘发射出的荧光相比则会显得更加微弱，甚至于检测系统不能分辨，这样定位不正确的绝大部分精子就会被认为不可辨别而弃掉，这是影响流式细胞分类仪精度的一个重要原因。由于精卵结合时就决定胎儿的性别，所以精子分离会最大限度地节约人力、物力和财力且不会损伤胚胎，随着技术进步，精子的分离速度已经达到了1.1×10E7个，而分离纯度则稳定在90%左右，可以说这是一种很有前途的方法。早期胚胎的PCR性别鉴定法（1）生物学原理
哺乳动物Y染色体上存在性别决区（Sexdeter-miningregionofY），即SRY基因，它位于Y染色体短臂，从着丝粒到端粒与拟常染色体区相邻的35kp的范围内。人们将携带SRY基因的一段基因组片段导入XX小鼠胚胎，实现了由雌性向雄性的性反转，证明了SRY基因确为哺乳动物的性别主宰基因。人类的SRY基因只有一个外显子，长850bp，该基因有一个多聚腺苷酸位点和两个转录起始点，其间是一个可读框，可编码204个氨基酸，其中包含可编码79个氨基酸的保守区-HMG盒。SRY基因在哺乳动物间具有高度的同源性，如牛和小鼠的SRY基因有75%的同源性，同人有95%的同源性。而HMG盒的保守性更大，绵羊、牛、山羊和小鼠的HMG盒中有一段完全相同的190bp的序列，这是我们进行引物设计的重要依据。除SRY基因外，Y染色体上锌指结构基因（ZFY）和其在X染色体上的同源序列ZFX基因对于哺乳动物的性别鉴定均具有重要意义。另外，人们也曾利用奶牛染色体成釉蛋白基因、人类Y染色体a类卫星序列进行过性别鉴定的研究。
聚合酶链式反应（PCR）法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术，即通过在一定条件下进行PCR扩增反应合成Y-染色体上特异性片段来进行胚胎性别鉴定，能扩增出目标片段的胚胎即为雄性胚胎，否则即为雌性胚胎。由于PCR极为灵敏，所以只要从胚胎中取出几个细胞就可以进行性别鉴定，与核型分析法相比，其对性别鉴定后胚胎移植妊娠率的影响已很低了。用PCR鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为：①胚胎的获取：冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别；②引物的设计；③用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞，处理后进行PCR扩增；④电泳检测。根据引物的对数、扩增的特异片段和EB加入的时间不同，PCR法又可分为以下几种：
①双扩增根据Y染色体上的性别决定基因或特异性片段设计引物，同时设计一对公母共有基因引物作为内对照，避免假阳性的发生；能同时扩增出Y-染色体上相应片段和公母共有基因片段的胚胎即为雄性胚胎，而只能扩增出共有基因片段的胚胎即为雌性胚胎。
②单扩增只用一对引物，只扩增SRY基因、成釉蛋白基因、ZFY基因或Y染色体a类卫星序列，此种方法虽然节省引物，但是排除不了假阳性和假阴性的干扰。这里要说明的一点是，曾溢滔等曾设计一个双扩增实验证明Y染色体a类卫星序列可用于人类的性别鉴定，至于是否适用于其他动物的性别鉴定还有待研究。
③联合扩增 由于ZFX与ZFY有较大的同源性，故我们可以利用同源区的共同引物ZFXY和各自特异引物共三种引物进行扩增，这样，电泳检测时，雄性DNA会出现两条带而雌性DNA只出现一条带。另外，徐亚欧等人发现公牛的ZFY基因扩增片段上有两个Pstl酶切位点，ZFX基因则没有，所以前者电泳时会现出现3个片段，这也为扩增后检验提供了一种方法。
④直接观察法此种方法是在进行扩增之前向微量离心管中直接加入适量的EB，待扩增后，将微量离心管置于紫外灯下直接观察，荧光较强者为雄性胚胎。此种方法可以减少鉴别所需时间，但较高浓度的引物会产生一定的背景荧光。
性别控制 -
问题与展望&
从目前来看，流式细胞器分类法和PCR扩增法是较准确而发展前景广阔的两种性别控制方法。但是，前者由于分离速度太慢和一部分精子类型不能被识别而影响其在生产中的应用，目前需要解决的关键问题是提高分离准确率和分离速度，并同时加强体外受精和显微授精技术的研究，来提高分离精子的利用率。运用PCR技术鉴定胚胎性别，关键是进一步研究简易快速的胚胎切割取样技术、胚胎性别鉴定的PCR试剂盒以及取样胚胎的冷冻保存技术，才能进入推广应用阶段。我们有理由相信，随着相关技术的迅猛发展，性别控制技术在畜牧生产中将会得到广泛应用。
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