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【求助】qPCR的引物能不能用于半定量PCR
楼层直达：
问题已关闭悬赏丁当:2
麻烦问下各位前辈，我不会设计引物，在网上看到了一篇英文文献，上面有我要的目的基因的qpcR引物，然后就合成了。后来拿这个引物做普通半定量PCR,引物二聚体很多，条带不特异（cDNA没有问题），想问一下是不是qPCR不能做普通PCR？同一种基因用不同的引物P，得到的产物分子量大小一样吗？？？
不知道邀请谁？试试他们
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这个是两种不同引物扩增出来的，大家帮忙看看是什么的问题吧
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qPCR的扩增产物一般要求比较短，100－250bp左右，RT-PCR的扩增产物要求300bp以上（大概是这么要求的，具体什么范围也不太清楚了）。如果qPCR的扩增产物扩增不特异的，像你图上这种是不建议跑胶半定量的。如果跑出来是一条带的应该也没太大问题，但是一般还是选引物扩增长度在300bp的比较好些。引物怎么设计，你可以百度一下用pubmed的primer blast设计方法，里面有很好的教程。另外也可以直接让公司帮忙设计合成，告诉他们是做RT-PCR的，他们反馈回来的序列你再primer blast上验证一下就可以了，一般问题也不大！
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关于丁香园技术宝典— qPCR
qPCR 引物篇（2）PCR 设计引物时如何查询基因
PCR 之引物设计--------基因序列查询篇&
&确定目标基因的形态：DNA or RNA
&查找目标基因
&比对目标基因同源性和特点
&选取目标基因序列
&选取目标基因的目标区段
第一步：如何查基因：
1、mRNA 序列的查询；
以查大鼠cort为例；
search 选择 nucleotide &&&&&&&&for&& 1、rat cort
1、&在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对象。
该mRNA文件的命名：　Rattus norvegicus cortistatin (Cort), mRNA；
NM_012835：是唯一的编号；
把以下序列存成ｔｘｔ文件：
Rattus norvegicus cortistatin (Cort), mRNA
&&& * Comment
&&& * Features
&&& * Sequence
LOCUS&&&&&& NM_012835&&&&&&&&&&&&&&& 438 bp&&& mRNA&&& linear&& ROD 11-FEB-2008
DEFINITION&Rattus norvegicus cortistatin (Cort), mRNA.
ACCESSION&& NM_012835
VERSION&&&& NM_&GI:6978682
KEYWORDS&&& .
SOURCE&&&&& Rattus norvegicus (Norway rat)
&ORGANISM&Rattus norvegicus
&&&&&&&&&&& E M C C V E
&&&&&&&&&&& M E E G R
&&&&&&&&&&& S M M M Rattus.
REFERENCE&& 1&(bases 1 to 438)
&AUTHORS&& Xidakis,C., Mastrodimou,N., Notas,G., Renieri,E., Kolios,G.,
&&&&&&&&&&& Kouroumalis,E. and Thermos,K.
&TITLE&&&& RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence of
&&&&&&&&&&& somatostatin, cortistatin and somatostatin receptor subtypes in rat
&&&&&&&&&&& Kupffer cells
&JOURNAL&& Regul. Pept. 143 (1-3), 76-82 (2007)
&& PUBMED&&
&REMARK&&& GeneRIF: RT-PCR and immunocytochemistry studies support the
&&&&&&&&&&& presence of cortistatin in rat Kupffer cells.
REFERENCE&& 2&(bases 1 to 438)
&AUTHORS&& Bourgin,P., Fabre,V., Huitron-Resendiz,S., Henriksen,S.J.,
&&&&&&&&&&& Prospero-Garcia,O., Criado,J.R. and de Lecea,L.
&TITLE&&&& Cortistatin promotes and negatively correlates with slow-wave sleep
&JOURNAL&& Eur. J. Neurosci. 26 (3), 729-738 (2007)
&& PUBMED&&
&REMARK&&& GeneRIF: The capacity of CST-14 to increase SWA, together with
&&&&&& &&&&&preprocortistatin's inverse correlation with time spent in SWS,
&&&&&&&&&&& suggests a potential role in sleep homeostatic processes.
REFERENCE&& 3&(bases 1 to 438)
&AUTHORS&& Deghenghi,R., Avallone,R., Torsello,A., Muccioli,G., Ghigo,E. and
&&&&&& &&&&&Locatelli,V.
&TITLE&&&& Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the rat
&JOURNAL&& J. Endocrinol. Invest. 24 (11), RC31-RC33 (2001)
&& PUBMED&&
REFERENCE&& 4&(bases 1 to 438)
&AUTHORS&& de Lecea,L., Criado,J.R., Prospero-Garcia,O., Gautvik,K.M.,
&&&&&&&&&&& Schweitzer,P., Danielson,P.E., Dunlop,C.L., Siggins,G.R.,
&&&&&&&&&&& Henriksen,S.J. and Sutcliffe,J.G.
&TITLE&&&& A cortical neuropeptide with neuronal depressant and
&&&&&&&&&&& sleep-modulating properties
&JOURNAL&& Nature 381 (6579), 242-245 (1996)
&& PUBMED&& 8622767
COMMENT&&&& PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final
&&&&&&&&&&& NCBI review. The reference sequence was derived from U51919.1.
&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&& Summary: inhibits grow may act as a
&&&&&&&&&&& neuropeptide to mediate signaling via a somatostatin receptor
&&&&&&&&&&& subtype [RGD].
FEATURES&&&&&&&&&&&& Location/Qualifiers
&&&& source&&&&&&&&& 1..438
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /organism=&Rattus norvegicus&
&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&/mol_type=&mRNA&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /strain=&Sprague-Dawley&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&taxon:10116&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /chromosome=&5&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /map=&5q36&
&&&& gene&&&&&&&&&&& 1..438
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /gene=&Cort&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /note=&cortistatin&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&GeneID:25305&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&RATMAP:41189&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&RGD:2383&
&&&& CDS&&&&&&&&&&&& 30..368
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /gene=&Cort&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /note=&Preprocortistatin&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /codon_start=1
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /product=&cortistatin&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /protein_id=&NP_&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&GI:6978683&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&GeneID:25305&
&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&/db_xref=&RATMAP:41189&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /db_xref=&RGD:2383&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /translation=&MGGCSTRGKRPSALSLLLLLLLSGIAASALPLESGPTGQDSVQD
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& ATGGRRTGLLTFLAWWHEWASQDSSSTAFEGGTPELSKRQERPPLQQPPHRDKKPCKN
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& FFWKTFSSCK&
&&&& sig_peptide&&&& 30..110
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /gene=&Cort&
&&&& mat_peptide&&&& 324..365
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /gene=&Cort&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& /product=&cortistatin-14&
ORIGIN&&&&&
&&&&&&& 1 aaagcacaga cttcaggtct ccaaggagga tgggtggctg cagcacaaga ggcaagcggc
&&&&&& 61 cgtcagccct cagtctgctg ctgctgctgc tgctctcggg gatcgcagcc tctgccctcc
&&&&& 121 ccctggagag cggtcccacc ggccaggaca gtgtgcagga tgccacaggc gggaggagga
&&&&& 181 ccggccttct gactttcctt gcctggtggc atgagtgggc ttcccaagac agctccagca
&&&&& 241 ccgctttcga agggggtacc ccggagctgt ctaagcggca ggaaagacca cccctccagc
&&&&& 301 agcccccaca ccgggataaa aagccctgca agaacttctt ctggaaaacc ttctcctcgt
&&&&& 361 gcaagtagcc cgagcctgac cggagcctga ccggccaccc tgtgaatgca gccgtggcct
&&&&& 421 gaataaagag tgtcaagt
其中origin后面的序列，是我们用来设计的序列。
1、&要会判断哪个是你要的序列；拉丁文
Mouse&MUS。。。
Rat&rattus 。。。。
2、&有别名，所以要判断是或者不是；
有受体，配体，名称中正好含这个关键词的；
3、如何判断：&& also know as
4、多个转录本时如何查找同源序列；
还有其他内容，可以向BioTNT 技术部垂询：
2、 启动子序列的查询；
3、microRNA 序列的查询；
4、 SNP 序列的查询；
技术支持：&&&&产品咨询：[email protected]&&&&售后服务群：
ELISA、蛋白芯片、荧光定量PCR、PCR ARRAY--BioTNT 科研好助手
产品搜索说明：
1. 搜索产品时先要选择搜索条件：品名搜索和货号搜索，搜索到产品列表时，可根据产品类别和品牌进行一次筛选；
2. 由于某些产品的英文名较多，可更换关键词搜索；
3. 当进行品名搜索时，切勿将品名和种类同时输入，否则就有可能搜索不到产品（例如：FAST Frame for Chip
Kits - 4 Slide frame 生物芯片，将有可能搜索不到产品或者过多的产品）；
4. 如果您需求的产品比较急时，可联系在线客服，即时为您提供更便捷的服务。实时荧光定量PCR_百度百科
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术[1]
，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）
2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；
2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；
3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；
5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；
6.正式定量实验：对所有样品上机检测；
7.实验结果和数据分析，形成报告。
优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）
（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）
实时荧光定量PCR技术原理
将标记有的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时荧光定量PCRCt 值
Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
（如图1所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR荧光化学物质
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：和。现将其原理简述如下：
1. TaqMan：PCR扩增时在加入一对的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一，两端分别标记一个报告荧光基团和一个荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. ：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光[2]
实时荧光定量PCR传统定量PCR
1．传统定量PCR方法简介
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和，内标用基因工程方法合成。用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－结合物，最终酶使显色。常规的PCR－ELISA法只是，若加入内标，作出，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过扩增到达平台期时，检测重现性。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种的方法。
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在之中，通过对每个Ct值的计算，根据获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用对未知进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。
实时荧光定量PCR相关应用
实时荧光定量PCR临床疾病诊断
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR动物疾病检测
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、。
实时荧光定量PCR食品安全
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业等检测。
实时荧光定量PCR科学研究
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
实时荧光定量PCR应用行业
各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体核酸，因此它比、时间分辨、等免疫学方法更具独到优势。
实时荧光定量PCR关于名称
根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）[3]
的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR[1]
，但是有少数作者并没有坚持这一原则。
．wikipedia[引用日期]
．中国知网[引用日期]
．www.rdml.org[引用日期]
中国电子学会（Chinese Instit...
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上分子生物学课的话，老师会告诉你，qPCR设计原则有以下几点:1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物5‘端可以修饰。9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10、引物3'端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。 要是我告诉你以上说的大部分都是屁话，你愿意继续听么？实际的引物设计操作中，如果按照以上所有条款来设计引物，就等着老板来抽你吧。PP5是最好的引物设计软件？错了，PP5只是最好的引物验证软件，用它来设计引物就完蛋了，连Tm值都算不准。下面来教你怎么设计qPCR引物吧，首先花1分钟找到基因的转录本序列。NCBI上找，如果遇到多转录本，可先用DNA STAR的MegAlign来进行比对，仅选取重合部分，这样就能扩增出所有转录本了。同时注意，仅选取3`末端序列，由于Oligo dT是从PolyA开始反转录的，所以如果片段较长的话，反转录酶可能无法把5`端序列全部给反转成cDNA。上图为序列搜索，NCBI上，Gene选项，找到基因后找出NM号链接，点开序列好了，有了序列就要找引物了。不要用PP5了，太老了不好用，且PP5不能兼容Win7的系统。现在推荐你们两款软件，都是超赞的，PP6和AelleID6.0/BD 7.0，有这个在手，基本上就是傻瓜型的操作了。只要会输入序列，就能找到引物了，对引物会有具体的评分，Best、Good、Poor、Not Found，选取Best导出即可，如果是Poor或者Not Found，就调整一下参数如Tm值或引物长度，一般来说都是没问题的。还有就需要调整一下扩增片段长度，qPCR的扩增产物尽量不超过200bp。这三款软件均有破解版，且可以设计Taqman探针和分子信标哦！
上图为PP6界面，你会发觉和BD7.0/AelleID 6.0界面完全一样，点击新建可弹出对话框，贴入序列即可。
引物搜索，注意调整产物长度，Tm值及搜索范围。
引物导出，可直接导出Excel文件，方便实用。
今天就说这么多了，有用没用的大家就凑合看吧。如需软件可回复我你的邮箱，有空的话会给大家发送的。请支持我们！谢谢大家！
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