细胞爬片细胞免疫荧光染色实验有人做过吗？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-05-25 09:55 标签： 细胞免疫荧光
细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤_百度文库
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细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤
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2.打孔剂的作用时间不能长。
3.用丙酮固定效果好...
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标题: 细胞爬片固定以后能否保存(细胞爬片,免疫荧光)
摘要: [细胞爬片固定以后能否保存(细胞爬片,免疫荧光)] 来不及做免疫荧光。 细胞爬片固定以后能否保存？ 怎样保存？一般能保存多久？ 关键词:[细胞爬片 免疫荧光]……
来不及做免疫荧光。 细胞爬片固定以后能否保存？ 怎样保存？一般能保存多久？
回复我的4℃保存的，但是细胞好像萎缩了回复细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.回复细胞爬片最好用新鲜的，否则，结果不好你就怪不了别人
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免疫荧光经典总结贴（欢迎交流）
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免疫荧光第一步的步骤及注意事项
1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.
2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如,还是贴壁不大好的细胞比如神经元
前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片
3.接种细胞密度很重要。不要过密或者过稀，这点很重要，直接决定你实验结果的好坏；
4. 固定,用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.
5. 不知道你的一抗是 在胞浆表达还是在胞核表达
如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟
6. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.
7. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.
8. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.
注意,PBS液的PH值要调在7.4左右.
免疫荧光第二步的步骤及注意事项
1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)
2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光
3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光
4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.
5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.
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免疫细胞化学
免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。
抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。
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1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4％的甲醛室温固定20－30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！！！
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95％甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
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1).用50mM PBS(pH7.4)洗涤三次，标记盖玻片的细胞面，轻轻冲洗防止洗脱细胞。
2) 洗涤完毕后，用冷甲醇（－20℃）固定3min。
3) PBS洗涤3次，用3％的BSA在4℃封闭3h。
4) 直接加入抗血清（1：500）4℃反应2h。
5) PBS洗涤5次，沥干。加入抗IgG-FITC（10μg/mL）, 4℃避光反应1h。
6) PBS洗涤5次，吸水纸沥干。用甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下观察，激发波长为490nm-520nm。
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1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
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Triton X－100不是必须加的，若想通透的话，看胞质和胞膜的抗原表达，就可以用0.2％的作用5min 就可以了，如果只看膜上的表达就没有必要加了。若膜蛋白加Triton X－100可能会影响结果。
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英文protocol
GENERAL IMMUNOFLUORESCENCE PROTOCOL
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很好，谢谢
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