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黄芩苷纯化方法的研究
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摘要: 目的：建立河北道地药材热河黄芩的HPLC 指纹图谱, 并与不同产地黄芩药材指纹特征相比较, 为科学评价与有效控制黄芩质量提供新方法。方法　采用HPLC 法测定了热河黄芩等11 个不同产地黄芩样品。条件:C18柱, 乙腈-0.25% 磷酸-四氢呋喃为流动相进行梯度洗脱, 检测波长274 nm , 体积流量1.0mL/m in, 柱温30 ℃。结果　建立了HPLC 指纹图谱共有模式, 并对不同产地药材进行了相似度比较。结论　指纹图谱分析法能简便、快速地鉴别和区分不同来源的黄芩药材, 为全面控制黄芩药材的质量提供了依据。关键词: 黄芩; 高效液相法; 指纹图谱中药现代化研究的重要任务之一就是建立一套客观的质量控制方法用以规范、指导中药材的炮制加工和中成药的生产。建立中药指纹图谱的目的在于将中药与化学药品区别开来, 充分体现中药的整体效应[ 1, 2 ]。黄芩为唇形科植物黄芩S cu tella riaba ica lensis Geo rgi. 的干燥根, 具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等作用, 是我国中医临床常用大宗药材品种之一。主产于河北承德、保定, 山西汾阳, 河南, 陕西, 内蒙古及东北等地, 多为野生, 尤以河北北部野生者为道地药材, 其根条坚实, 空心少, 色黄, 品质最佳, 素有“热河黄芩”之称。　　黄芩含有多种化学成分, 其中黄酮类化合物为主要有效成分。由于受地理因素和生长环境的影响,不同产区包括栽培和野生黄芩的化学组成不尽相同。本实验利用RP2HPLC 法梯度洗脱, 建立了热河黄芩中黄酮类成分的指纹图谱, 该方法重现性和精密度良好, 有助于黄芩药材的标准化种植及黄芩道地药材的质量控制。同时对不同产地的黄芩进行了指纹图谱相似度分析, 以区分不同产地黄芩药材质量的异同, 为黄芩的鉴别提供新的依据。1　仪器、与药材　　A gilen t 1100 液相色谱仪, 紫外检测器(VWD ) , HP Chem stat ion System 色谱工作站,SCQ ―200 超声波清洗器(上海声谱超声波设备厂) , SZ―93 自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。乙腈为色谱纯(美国迪马公司) , 水为二次蒸馏水, 其他试剂均为分析纯。　　黄芩苷对照品( 供含量测定用, 批号7152200010 )、汉黄芩素对照品(供鉴别用, 批号)、黄芩对照药材(批号305) 均由中国药品生物制品检定所提供。不同产地黄芩药材样品来源见表1, 经河北医科大学药学院生药学教研室聂凤教授鉴定。2　方法与结果2.1　对照品溶液的制备: 分别取黄芩苷和汉黄芩素对照品适量, 精密称定, 加甲醇溶解并稀释制成0.1m g/mL 的溶液, 作为对照品溶液1、2。2.2　供试品溶液的制备: 取热河黄芩药材粉末(过60 目筛) 0.2 g, 精密称定, 置100 mL 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 称定质量, 超声提取45 m in, 取出,放冷, 用甲醇补足质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液2 mL置5 mL 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 微孔滤膜(0.45um) 滤过, 即得供试液1。2.3　黄芩道地药材指纹图谱的建立2.3.1　色谱条件及系统适用性试验: 色谱柱为D iamon silTM C18柱(250 mm ×4.6 mm , 5 um ) (美国迪马公司) ; 乙腈(A ) 20.25% 磷酸(B) -四氢呋喃(C) 为流动相进行梯度洗脱: 0～ 14 m in (21% A -78% B-1% C ) , 17 m in ( 28% A -71% B-1% C ) , 25 m in(31% A -68% B-1% C) , 45～ 60 m in (39% A -60%B-1% C) , 65 m in (30% A -69% B-1% C) , 70 m in(21% A -78% B-1% C)。检测波长274 体积流量1.0 mL / 柱温30 ℃; 进样量10 uL; 理论板数按黄芩苷峰计算应约为2×105, 与其他峰的分离度均大于1.0。所有组分均在70 m in 内被检测完。2.3.2　测定方法: 分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液1 和2 及供试液1 各10 uL , 注入液相色谱仪,记录70 m in 内的色谱峰及其保留时间和峰面积, 色谱图见图1。2.4　方法学考察[ 2 ]2.4.1　稳定性试验: 取热河黄芩药材粉末, 精密称定, 按上述方法制备供试液, 分别于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 检测指纹图谱。结果表明, 各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化, RSD 分别为0.03%～ 0.95% 和0.17%～1.13% , 符合指纹图谱要求, 稳定性良好。2.4.2　精密度试验: 取热河黄芩药材粉末, 精密称定, 按上述方法制备供试液, 重复进样6 次, 记录指纹图谱。结果表明, 各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化, RSD 分别为0.03%～1.04% 和0.17%～ 0.42% , 符合指纹图谱要求, 精密度良好。2.4.3　重现性试验: 取热河黄芩药材粉末6 份, 精密称定, 按上述方法制备供试液, 记录指纹图谱。结果表明, 各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化, RSD 分别为0.01%～ 0.84% 和1.19%～ 1.71% , 符合指纹图谱要求, 重现性良好。2.5　不同产地黄芩药材指纹图谱的比较及相关技术参数: 按供试品溶液1 的制备方法操作, 分别取不同产地黄芩药材样品2～ 11 制成供试品溶液2～11, 分别取10 uL 进样, 同前条件记录指纹图谱(见图2) , 其中11 号峰(S 峰) 为黄芩主要指标成分黄芩苷, 将其作为内参比峰。比其色谱峰对内参比峰的相对保留时间定性, 得到14 个共有峰(图1, 表2) , 计算各共有峰相当于其内参比峰的峰面积比值(表3) , 每个样品的非共有峰面积占总峰面积均小于10% , 符合指纹图谱要求。相对峰面积比值存在一定的差异, 可用来鉴别和区分不同产地的黄芩药材。2.6　数据处理2.6.1　系统聚类分析: 系统聚类分析是无管理、无指导的模式识别方式, 可依据所测样品的数据, 对样品进行分类[ 3 ]。本研究以形态学鉴定的11个不同产地的黄芩样品为研究对象, 进行指纹图谱研究, 获得包括黄芩苷(11 号峰) 在内的29 个峰, 从中选出14 个共有峰, 将其峰面积相当于内参照物峰的峰面积量化, 得到11×14 阶原始数据矩阵, 运用SPSS 对其进行系统聚类分析, 采用离差平方和法(W ard’sM ethod) , 利用欧氏距离(Euclidean) 作为样品的测度, 11 个样品基本可分为两大类, 样品1、8、2、3、9、10、11、5、6 为一类, 4、7 为二类。聚类谱系图见图3。2.6.2　相似度分析: 运用中药指纹图谱相似度计算分析。将实验数据导入中药指纹图谱相似度计算软件, 经选峰, 设定匹配模式, 将谱峰自动匹配, 然后设定标准模板, 进行谱峰差异性评价和整体相似度评价。依据聚类结果由一类样品通过中药指纹图谱相似度计算软件得出黄芩药材指纹图谱的共有模式, 各样品与该共有模式比较, 其相似度结果见表4。　利用Excel 软件, 运用公式计算。分别采用欧氏距离、相关系数和夹角余弦作为测度, 以1、8、2、3、9、10、11、5、6 号样品为标准样品, 以其均值作为共有模式, 计算所有样品的相似度, 结果见表5。　　由表4、5 可知, 不同方法所得相似度结果趋于一致, 以相关系数为测度, 相似度在0.99～ 1.00 可归为一类, 药材品质较优, 包括河北道地药材热河黄芩在内, 与道地研究结果相符; 相似度在0.97～0.99 的样品质量次之, 为市售一般品; 相似度在0.85～ 0.92 的样品质量最次。其结果与系统聚类结果及药材的道地性和生药学鉴定结果相符。3　讨论3 .1　本实验比较了不同提取溶剂如95% 乙醇、70% 乙醇、45% 乙醇、50% 甲醇、甲醇的水浴回流、索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果, 以甲醇提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂, 不同提取时间(30、45、60 m in) 的提取效果。结果表明, 以甲醇为提取溶剂, 超声提取45 m in, 提取较完全, 且方法稳定、重现性好。采用甲醇提取, 可将其不同成分完全表述。70% 乙醇虽可将黄芩苷提取更完全, 但指纹图谱只倾向于某几个峰, 甲醇提取黄芩苷的峰相对低些, 但就指纹图谱的整体性而言更合适一些。实验中还发现用50% 甲醇提取的供试品溶液很不稳定, 黄芩苷峰很快降低, 汉黄芩素峰则相应升高, 说明在甲醇中若水的比例较大, 黄芩苷很不稳定, 容易发生水解, 而采用纯甲醇超声提取, 溶液的稳定性良好。3.2　本实验采用274 nm 作为检测波长, 也是为了兼顾其他峰的吸收。文献报道多采用280 nm 测定黄芩苷的含量。黄芩中黄芩苷含量很高, 在色谱图中占绝对优势, 其他特征峰很弱, 为了反应药材化学成分的全貌, 可使用不同的检测波长, 突出其他特征峰, 相互参照辨认, 并可避免图谱中仅有一种成分偏高的现象。本研究为图谱中除突出黄芩苷色谱峰特征外, 也同时突出其他特征, 故选274 nm 检测。3.3　在流动相系统的选择中, 分别以乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.25% 磷酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水、乙腈-甲醇-0.25% 磷酸、乙腈-0.25% 磷酸-四氢呋喃等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验。结果表明, 用乙腈-0.25% 磷酸-四氢呋喃进行梯度洗脱为佳, 加入四氢呋喃后峰形尖锐且分离度较好, 在调整好流动相的不同时间洗脱比例之后, 各峰的保留时间适中, 且基线较平稳, 不易漂移, 有利于指纹图谱的分析。3.4　本实验用不同的数据处理方法对数据进行分析, 由得出的相似度结果可知, 11 个样本间有较好的相关性, 但又有区别。采用3 种不同检验方法, 结果是一致的, 得到3 种不同方法之间的相互认证, 3种方法各有优势, 且针对点不同, 结合使用效果更好, 为指纹图谱的分析提供了强有力的依据。3.5　本研究方法建立的指纹图谱可快速鉴别区分不同来源的黄芩药材, 通过指纹图谱对黄芩药材进行综合宏观分析, 有利于全面控材质量, 促进黄芩药材及其制剂研制水平和质量控制的全面提高。References:[ 1 ]　Li X B, Tu P F. Fingerp rint system of Chinese medicinal materials [J ]1 Chin Trad it Herb Drugs (中草药) , ) :385-387[ 2 ]　Xiao R, Zhang L T.A ctuality and future of studies on fingerprints of TCM [J ]1 J HebeiMed Univ (河北医科大学学报) ,) : 310-313[ 3 ]　Technical Requirement of the Fing erprint in Injection of Chinese Materia Medica (Tentative Standard ) [ 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) ] [S ]. 2001[ 4 ]　Zhang K R, Bi K S1 Study on fingerprint of Rad ix Paeoniae Rubra by HPLC [J ]1 Chin Trad it Herb Drugs ( 中草药) ,) :
作者:肖蓉, 袁志芳, 王春英, 张兰桐 , 王彩红
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从引物设计到实验全程服务黄芩苷对照品的制备及其在胃肠康颗粒剂中的含量测定 论著 | 39康复网 | 医源世界
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黄芩苷对照品的制备及其在胃肠康颗粒剂中的含量测定
来源：中华实用医药杂志 作者：李清禄 何海斌 蔡碧琼 尧舜英
【摘要】 目的 简化黄芩苷提取纯化工艺，建立胃肠康颗粒剂中黄芩苷的含量测定方法。方法 通过超声提取酸沉、调节水溶液碱酸度除杂、甲醇超声助溶重结晶纯化工艺，获得黄芩苷对照品。结果 得到的黄芩苷对照品理化性质与标准品一致，含量达99。58μg范围，样品含量与色谱峰面积线性关系良好（r=0。...
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&&&&& 【摘要】 目的 简化黄芩苷提取纯化工艺，建立胃肠康颗粒剂中黄芩苷的含量测定方法。方法 通过超声提取酸沉、调节水溶液碱酸度除杂、甲醇超声助溶重结晶纯化工艺，获得黄芩苷对照品;并通过薄层层析、紫外光谱、红外光谱对其定性，HPLC法定量:色谱柱为Symmetry十八烷基键合硅胶柱，4.6mm×75mm，HPLC Column（Waters公司）;甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）作流动相，检测波长278nm。结果 得到的黄芩苷对照品理化性质与标准品一致，含量达99.25%，得率4.12%。在0.058～0.58μg范围，样品含量与色谱峰面积线性关系良好（r=0.9950），加样回收率为98.80%～102.80%。结论 含量测定方法简便、快速，可用于胃肠康颗粒剂和相关颗粒剂产品中黄芩苷的含量测定。超声提取工艺简单，在中药活性成分提取方面有良好的应用前景。
&&&&& 关键词 黄芩苷 制备 胃肠康颗粒 HPLC法 含量测定
&&&&& Preparation of baicalin and content determination in& weichangkang granula by HPLC&&
&&&&& Li Qinglu，He Haibin，Cai Biqiong，et al.
&&&&& College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fujian350002.
&&&&& 【Abstract】 Objective To simplify the process of extraction and purification for baicalin in traditional Chinese medicine，and establish a determination method of the content of baicalin in weichangkang granula.Methods The baicalin was&extracted from the powder of scutellaria baicalensis georgi in ethanol with ultrasonic，precipitated in acid，the precipitation was dissolved in water and precipitated by adjusting pH，the deposid was dissolved with ultrasonic and recrystallized in methanol，then qualitative analysis by TLC，UV，IR，quantitative analysis by HPLC:Symmetry C 18& ，3.5μm，4.6mm×75Mobile phase:CH 3 OHl-H 2 O-H 3 PO 4（47:53:0.2）;Flow rate:1ml?min -1 .Detectionwavelength:278nm.Results The physical chemistry characters of baicalin contrast sample were consistent with the baicalin standard sample.The rate of product of baicalin was4.12%，higheThe content of baicali was99.25%.The baicalin was determined，the standard curve was linear within the range of0.058～0.58μg（r=0.9980）.The recoveries were within98.80%～102.80%.Conclusion The determination method of content by HPLC is simple，quick，accurate and suitalbe for quantitative determination of baicalin in weichangkang granula and other reˉlated products.The extraction process with ultrasonic is easier and faster，has a potential application to the extraction of active components from traditional Chinese medicine.
&&&&& Key words baicalin preparation weichangkang granula HPLC content determination&&&
&&&&& 黄芩苷（Baicalin）是中药黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中具有杀菌抗病毒作用的主要成分［1］，是黄芩素G位羟基与葡萄糖醛酸结合而成的苷［2］，具有很高的药用价值［3，4］。黄芩苷的提取方法已有不少报道［5～9］，但工艺都很繁琐，得率低，制取标准品就更为困难、因而黄芩苷标准品且价格昂贵，生产应用上要将其作为对照品进行质量控制就受到很大的限制。笔者试图寻找一种操作简单、得率高、纯度高的提取黄芩苷新工艺，以期能批量生产黄芩苷对照品。胃肠康颗粒的前身是中药散剂，由黄芩、黄柏、秦皮等药材组成，主要成分为黄芩苷和盐酸小檗碱，对细菌、病毒单独或混合感染产生的急、慢性肠炎等有效，主要用于水产养殖中鱼类肠溃疡、消化不良、胃肠不适或各种肠炎。该制 ˇ 剂是将多种中药原料，经粉碎过筛后直接混合而成，由于原料取材不一，有效成分含量不确定，影响疗效。此外，由于鱼类肠道细而短，药物在体内停留时间短，直接影响有效成分的吸收。因此，中药散剂用于鱼病的治疗效果欠佳。所以将其主要成分提取出来，并加入适当的赋形剂，制成颗粒剂，可大大提高其疗效，但由于各种药材的产地、品种、提取工艺等不同，直接影响样品质量，所以建立行之有效的监测方法，对生产工艺的确定和样品质量的控制具有重要指导意义。HPLC法测定黄芩苷含量已有不少报道［10～15］，但由于不同的中药，成为差异很大，对其主成分的测定方法也差异较大，笔者在前人工作的基础上，对HPLC法测定复方中成药中黄芩苷含量进行了进一步探索，并用于测定复方纯中药制剂―胃肠康颗粒中黄芩苷的含量，效果良好，可作为胃肠康颗粒剂产品质量控制的检测方法。
&&&&& 1 仪器与试剂
&&&&& 1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪:Waters1525二元泵;Waters2487紫外检测器;色谱柱:Symmetry十八烷基键合硅胶柱，4.6mm×75mm，HPLC Column（Waters公司）;IR谱用AˉVATA R360傅里叶红外光谱仪（NicoLet），波长范围400～4600cm -1& ，KBr压片;7051型紫外分光光度计，波长范围5cm -1& （上海天美科学仪器有限司）;BS201S电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）;ShLOA快速水分测定仪（上海第二天平仪器厂）;数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;三用紫外分析仪（2F-I型）;X4型显微熔点测定仪（北京光电设备厂，温度未校正）。
&&&&& 1.2 试剂 乙醇，甲醇，甲酸，磷酸等均为分析纯试剂;薄层层析硅胶G（中国青岛海洋化工集团公司）;甲醇（色谱纯）;黄芩苷标准品（中国药品生物制品检定所）;胃肠康颗粒剂（福建金谷科技开发有限公司）。
&&&&& 2 方法与结果
&&&&& 2.1 黄芩苷对照品的制备
&&&&& 2.1.1 黄芩苷粗品的提取
&&&&& 称取已干燥黄芩粉末100g2份，分别以70%乙醇50℃超声提取2次，每次1h，滤过，将提取液减压回收乙醇至尽后，加蒸馏水100ml，用浓HCl调pH值为3～4，静置约0.5h，滤过，滤液在40℃用浓HCl调pH值至2.0，保温30min，静置12h后抽滤。将沉淀分别用水和95%乙醇洗涤2遍，干燥即得黄芩苷粗品。
&&&&&& 2.1.2 黄芩苷的纯化
&&&&& 将上述黄芩苷粗品研碎于烧杯中，加150ml蒸馏水加热至80℃时用40%NaOH调pH值为7.5使粗品完全溶解，再用浓HCl调节pH值至6.0，加95%乙醇260ml，静置后过滤。滤液再用浓HCl调pH值为2.0，静置冷却至黄芩苷完全沉淀，过滤后将沉淀用水洗涤至pH 值为7左右，再用95%乙醇洗涤，抽干即得较纯的黄芩苷样品。将此黄芩苷样品用300ml甲醇在50℃超声波下溶解，冷却沉淀，静置，过滤，弃去滤液。将沉淀在室温超声波下溶于甲醇中，5℃下静置逐渐析出淡黄色细针状结晶物，依此再重结晶1次，干燥即得纯化的黄芩苷样品。产率为4.12%。
&&&&& 2.2 黄芩苷样品的定性分析
&&&&& 2.2.1 黄芩苷样品溶液的配制精密称取黄芩苷样品6.10mg，用甲醇溶解并定容至100ml容量瓶中。
&&&&& 2.2.2 黄芩苷标准品溶液的配制精密称取干燥至恒重的黄芩苷标准品5.80mg，用甲醇溶解并定容至100ml容量瓶中，即得标准溶液。
&&&&& 2.2.3 薄层层析
&&&&& 以硅胶G作固定相，以105℃烘箱活化30min，分别吸取黄芩苷样品溶液和标准品溶液各6μl，点样于已活化的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7:1:2）为展开剂进行展开，结果标准品与样品的R& f 值相等，都为5.5/8.6，在365nm紫外灯下观察，只有一个荧光点，在硅胶板上喷1%FeCl 3 乙醇溶液只有一点显示深兰色，初步判断样品为黄芩苷，且不含杂质。
&&&&& 2.2.4 电子光谱
&&&&& 用黄芩苷样品溶液和标准品溶液进行UV谱扫描。得到两个谱图的结构完全一致，样品溶液无杂质峰，说明本试验得到的样品为黄芩苷且基本无杂质。
&&&&& 2.2.5 红外光谱
&&&&& 黄芩苷样品和黄芩苷标准品的IR谱如图1、2（略）所示。两个谱图的结构完全一致，可确认得到的样品为黄芩苷。图1 黄芩苷标准品IR谱图2 黄芩苷对照品IR谱2.2.6 熔点 测定黄芩苷标准品、本法得到的样品以及本样品与标准品混合物的熔点均为223℃～224℃，说明本法精制的样品纯度较高。
&&&&& 2.3 HPLC法测定黄芩苷含量
&&&&& 2.3.1 色谱条件 　　&&&&& 色谱柱:Symmetry十八烷基键合硅胶 柱，4.6mm×75mm，HPLC Column（Waters公司）;流动相:甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）;检测波长:278流速1ml/min。
&&&&& 2.3.2 标准曲线绘制
&&&&& 精密吸取“2.2.2”项上标准液进样，进样体积分别为1、2、4、6、8、10μl，在上述色谱条件下测定峰面积，得到黄芩苷标准曲线，直线方程为:Y=4024667X（Y为黄芩苷含量μg，X为色谱峰面积nm 2 ），回归系数r=0.9980。线性范围为0.058～0.58μg。
&&&&& 2.3.3 进样精密度
　　精密吸取“2.2.1”项下的黄芩苷样品溶液进样，每次体积为5μl，记录色谱峰面积，进行进样精密度测定（表1），结果表明进样精密度良好。表1（略）进样精密度试验
&&&&& 2.3.4 测定溶液的稳定性试验
&&&&& 精密吸取“2.2.1”项下的样品溶液5μl，每间隔2.5h进样1次。共测定6次，色谱峰面积分别为07、09，平均峰面积为1206069，RSD为0.11%，表明测定溶液在15h内稳定。
&&&&& 2.3.5 黄芩苷样品的含量测定
&&&&& 根据“2.2.3”上的试验结果，人分面积的平均值，即1218277，代入标准曲线方程，经计算可得样品中黄芩苷的含量为99.25%。同时还测定了按文献法 ［7］制备芩苷样品，并与本法比较（表2）（略），结果表明，本法得到的黄芩苷样品纯度与文献得到的样品及标准品均很接近，可作为对照品使用。 表2（略） 不同样品测定结果&&&&&&&&& 2.3.6 胃肠舒颗粒中黄芩苷含量的测定
&&&&& 称取5胃肠康颗粒，每份约2.0g，各加入50ml甲醇，50℃下超声波振荡30min，0.44μm滤膜过滤，将滤液用甲醇定容至100ml，得产品溶液。分别精密吸取溶液各5μl进样，按上述色谱条件测定，并计算产品中黄芩苷含量（表3）。（略）
&&&&& 表3（略） 胃肠康颗粒中黄芩苷的含量&&&&&&&&& 表4（略）产品中黄芩苷回收率 （n=5）
&&&&& 3& 讨论
&&&&& 3.1 提取与纯化
&&&&& 利用超声波的作用对中草药中的黄芩苷提取和成方制剂中黄芩苷的提取测定，从黄芩苷的得率、产品纯度和成方制剂中黄芩苷含量测定的重现性、精密度及回收率看，超声提取工艺简单快速、提取完全，克服了文献报道中的加热回流、索氏提取等之繁琐工艺;在产品精制纯化过程中不用文献报道中的索氏提取后浓缩重结晶，而直接用超声助溶重结晶，简单快速，分离效率高，纯度符合要求。因此，本方法可代替传统的回流提取、浓缩精制之生产工艺和产品质量之前处理方法。可见，超声提取在中药有效成分提取中不失为一种简单快速有效的方法。
&&&&& 3.2 色谱条件
&&&&& 比较各种流动相，发现“甲醇-水-磷酸”体系，不管是分离效果，还是测定重现性均最好，只是不同的仪器，三者的比例必须通过试验来调整。试验还表明，用HPLC法在本实验色谱条件下测定胃肠康颗粒中主成分黄芩苷含量，方法简便、准确、可靠，可作为胃肠康颗粒产品中黄芩苷的含量测定和产品质量控标的测定方法。
&&&&& 参考文献
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&&&&& 13 沈嘉，吴秋媚.HPLC法比较不同工艺制备的黄连解毒汤及日本汉方黄连解毒汤中黄芩苷含量.中草药，）:102-104.
&&&&& 14 李守拙，李沈明，范书铎.黄芩茎叶中野黄芩苷含量测定.中草药，）:910.
&&&&& 15 杨立新，刘岱，冯学锋，等.高效液相色谱法测定不同产地黄芩中黄酮化合物的含量.中国中药杂志，）:166-169.
&&&&& （收稿日期:）
&&&&& （编辑日 强）
&&&&& 基金项目:福建省教育厅科技项目（项目编号:JB01212）
&&&&& 作者单位:350000福建农林大学生命科学学院
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HPLC法测定清颗粒中黄芩苷的含量实验
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一、实验目的及背景&&& 建立高效液相色谱法测定一清颗粒中黄芩苷的含量。方法：采用l C18（250&4.6mm，5&m）色谱柱，以甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58）为流动相；流速为1.000mL/ moL，检测波长275nm，柱温29℃。结果：黄芩苷在0.8&g范围内成良好的线性。（r=0.9945），平均回收率98.9%，RSD=0.31%。结论：方法简便、快速、适用性好，可用于该制剂的质量控制。&&& 一清颗粒是中药复方制剂，黄褐色；味微甜、苦。由黄连 ，大黄 ，黄芩共 3味中药组成，具清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所致的身热烦躁，目赤口疮，咽喉、牙龈肿痛，大便秘结，吐血，咯血，衄血，痔血等症；咽炎，扁桃体炎。为了更有效的控制制剂质量，采用高效液相色谱法对该制剂中黄芩苷进行了含量测定，为该制剂的生产提供了质量控制依据。二、仪器与试药&&& 高效液相色谱仪，Breeze工作站。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。黄芩苷对照（中国药品生物制品检定所，批号为212），一清颗粒。&&三、方法与结果1、色谱条件与适用性试验&& 色谱柱：Hypersil& C18（250&4.6mm，5&m），检测波长为275nm。流动相：甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），理论塔板数按黄芩苷计算，应不低于5000。2、对照品溶液制备&& 精密称取在105℃干燥至恒重的黄芩苷对照品12.5mg，置250ml量瓶中，用少量甲醇溶解，用重蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含黄芩苷50&g），即得。3、供试品溶液的制备&& 取本品装量差异项下的内容物，混匀，研细，取约0.75g，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超声处理10分钟，用重蒸馏水稀释至刻度，取此液离心10分钟，分取上清液，即得。4、阴性样品溶液的制备&& 取缺黄芩的模拟制剂约10g按供试品溶液的制备方法依法测定，结果表明：阴性样品的HPLC图谱中，无呈现与黄芩苷对照品保留时间相同的色谱峰。5、测定法&& 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10&l，注入液相色谱仪测定含量，以峰面积积分按外标法计算。四、线性关系考察&&& 精密吸取对照品溶液（浓度为：0.050mg/ml）2、4、6、8、10、12，依次进样，以进样量（&g）对峰面积进行线性分析，方程为Y=X-117.256，r=0.9945，结果表明黄芩苷在0.0mg间成良好的线性关系。&& 五、精密度试验&&& 精密吸取上述对照品溶液，连续进样6次，每次10&l，测定峰面积积分值，结果RSD为0.96%。　六、稳定性试验&&& 精密吸取上述对照品溶液，在0、2、4、6、8小时进样，共5次，每次10&l，测定峰面积积分值，结果RSD为0.80%，表明黄芩苷在8小时内稳定。&& 七、重复性试验&&& 取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备用6个测定结果进行评价（n=6），按正文含量测定项下色谱条件测定，结果RSD为 1.21%。&& 八、回收率试验&&& 取已测之含量的样品，平行6份，分别精密加黄芩苷对照品适量，按供试品制备方法制备和测定，计算6次的回收率，结果见表2；表2& 回收率测定结果（略）九、讨论1、含量测定中选择色谱条件时，曾对流动相包括溶剂系统组成和比例进行了研究，，根据参考文献对多种溶剂的选择：（1）甲醇-水-磷酸（43：57：0.2）；（2）乙腈-水-冰醋酸（50：50：1）；（3）甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）；甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），根据分离情况，选择甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至2.7）（42：58），流速1ml/min。2、曾对样品的提取方法进行考察，分别采用甲醇回流提取1h，甲醇提取0.5小时、50%甲醇、10%甲醇超声提取3种提取方法，经测定10%超声提取的效果好。3、对提取工艺研究，以上三味，分别加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.25（70℃），喷雾干燥成干浸膏粉；将上述三种浸膏粉加入适量蔗糖与糊精，混匀，制成颗粒，干燥即得，此方法提取效果优于以往三药混合煎煮，而且含量高。相关产品信息：,,,,
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