老芒麦野生种质资源的遗传多样性及群体遗传结构研究--《四川农业大学》2008年博士论文
老芒麦野生种质资源的遗传多样性及群体遗传结构研究
【摘要】：
研究和了解植物种质间的遗传变异对于其在育种上的有效利用非常有益。自然种群的遗传多样性研究可以为物种保护计划的制定和实施提供参考和借鉴。老芒麦(Esibiricus L.)又名西伯利亚野麦草,是披碱草属的模式种,原生于欧亚大陆北部,具有多年生和自花授粉的习性,为具有StStHH染色体组构成的异源四倍体。其自然分布横跨欧洲的瑞典到东亚的日本,甚至到达北美的阿拉斯加和加拿大,向南可以延伸分布至中国青藏高原的海拔4000米以下的地区。老芒麦一般生长于湿润的草地、河滩、灌木丛中或森林边缘地带。国内对老芒麦的研究多集中在资源评价、栽培技术、种子生产、抗性生理生化等方面;国外的研究更多的是集中于其抗寒性的生化与分子生物学机理及包括老芒麦在内的披碱草属物种的系统分类与进化方面。目前对老芒麦种质的遗传多样性几乎没有相关研究。
本研究利用形态-农艺学性状、种子醇溶蛋白和SRAP分子标记评价了来源广泛的老芒麦种质的遗传多样性;同时利用ISSR和RAPD分子标记对青藏高原东南部的8个老芒麦居群进行了群体结构和遗传变异分析。主要结果如下:
1.以栽培品种川草2号为对照,观测34份老芒麦野生种质的13个形态和农艺学性状的基本数据,基于欧氏距离进行UPGMA聚类分析,揭示老芒麦各野生种质间的生物多样性。研究结果表明,老芒麦野生种质间表型差异明显,生物多样性丰富。根据聚类结果,供试种质可以划分成3个具有明显形态和农艺性状差异的类群。类群Ⅲ中3份来自新疆的种质和1份来四川红原的种质具有突出的农艺性状表现,其牧草和种子生产性能远高于其它居群。主成分分析的结果与聚类分析基本一致。另外还对野生老芒麦种质的收集和保护提出了建议。
2.利用基于APAGE的醇溶蛋白标记对来自亚洲和北美的86份老芒麦种质的遗传多样性和遗传关系进行了分析。电泳共检测到52条醇溶蛋白条带,其中47条为多态性条带,多态性比率达90.4%。种质间遗传相似系数的变幅为0.108～0.952,平均值为0.373,这表明种质间的存在较高水平的遗传多样性。利用Shannon多样性指数反映了类似的结果,即供试种质间的多样性指数达到0.460的较高水平。基于多样性指数计算了老芒麦种质地理类群遗传分化程度,地理类群间和地理群内的遗传变异分别占总变异的55.9%和44.2%。对种质和地理类群的聚类分析结果均显示来源于青藏高原的种质与来源于其它地理来源的种质具有较大的差异,可以分成明显的两支。这种聚类结果可能与种质的地理来源与生态适应性有关。同时还就遗传多样性的范围及种质间的遗传关系做了进一步探讨。
3.利用SRAP标记对来自亚洲的84份老芒麦种质的遗传多样性和遗传关系进行了分析。23个引物组合共产生337条扩增带,其中203条为多态性带,多态性比率为60.24%。各种质问遗传相似系数的变幅为0.783到0.965,平均值为0.865。来自于青藏高原和蒙古的种质间的平均GS值最小(0.830),而来自于俄罗斯和和蒙古的种质间的平均GS值最大(0.897)。对84份种质的聚类分析表明,供试种质可以划分成2大类,而且聚类结果与原始相似性矩阵间的具有很高的吻合度(r=0.88)。同时,主向量分析(PCoA)也得到了与聚类分析类似的结果。分子方差分析(AMOVA)表明在总的遗传变异中有79.62%发生在地理类群内,有20.38%发生在类群间(Φ_(ST)=0.204),类群间和类群内的变异均为极显著(P＜0.0001)。基于各地理类群间Φ_(ST)值进行的聚类分析也表明青藏高原类群明显区别于其它地理类群。这种聚类模式可能依赖于种质的地理来源赋予其的特殊生态地理适应性。
4.本研究利用ISSR分子标记对来自青藏高原东南部的8个老芒麦的遗传多样性和群体遗传结构进行了分析和评价。在100个ISSR引物中筛选出13个能扩增出高度重复性条带的引物。这13个引物共扩增出193条可分辨的条带,其中149条(占77.2%)具有多态性,表明老芒麦居群在物种水平上存在较高水平的变异。相反,各居群的多态性位点比率(P_P)在44.04%到54.92%之间变化,表明群体水平的变异较低。群体水平的平均基因多样性(H_E)为0.181(变幅为0.164～0.200),而物种水平的平均基因多样性达0.274。基于Nei.氏基因多样性的群体分化系数达到33.1%,而基于Shannon指数、贝斯叶方法和分子方差分析(AMOVA)的群体分化系数分别为34.5%、33.2%和42.5%。AMOVA分析表明采样地区之间的ISSR变异不存在显著的统计学差异(P=0.08),然而群体间和群体内的变异分别为42.5%和57.5%,均显示为差异极显著(P＜0.001)。各居群间存在较高的Nei氏遗传一致度。这种遗传变异模式不同于已报导的大多数小麦族自交物种。另外,基于聚类分析和主向量分析的结果表明各居群间存在较为明显的地理分化,即8个居群分化为采集地的南部和北部2个分支。总之,本研究结果表明来自青藏高原东南部的老芒麦居群内部存在较高水平的ISSR变异。
5.本研究利用RAPD分子标记对来自青藏高原东南部的8个老芒麦的遗传多样性和群体遗传结构进行了分析和评价。在150个RAPD引物中筛选出25个能扩增出高度重复性条带的引物。这25个引物共扩增出370条可分辨的条带,其中291条(占78.65%)具有多态性,表明供试居群在物种水平上存在较高水平的变异。同时各居群的多态性位点比率(P_P)在46.49%到53.78%之间变化,表明群体水平的变异较低。居群水平的平均基因多样性(H_E)为0.176(变幅为0.159～0.190),而物种水平的平均基因多样性达0.264。基于Nei氏基因多样性、Shannon指数和贝叶斯方法的群体分化系数分别为32.0%、33.7%和33.5%。AMOVA分析表明居群内遗传达到总变异的59.9%,而居群间变异仅有40.1%,但二者均达到极显著水平(P＜0.001)。居群间每世代迁入个体数(基因流)达到1.06个。各居群间存在较高的Nei氏遗传一致度。基于RAPD和ISSR的Nei基因多样性指数间存在显著相关。另外,基于聚类分析、主向量分析及AMOVA的结果均表明各居群间存在较为明显的地理分化,即8个居群分化为采集地的南部和北部2个分支,与RAPD结果存在相似性。对该地区老芒麦应尽量选择遗传多样性高的居群实施就地保护。
【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：S543【目录】：
Abstract7-14
第一章 文献综述14-25
1 遗传多样性概念、意义和研究方法14-18
1.1 遗传多样性的概念14
1.2 遗传多样性研究的意义14-15
1.3 遗传多样性研究的方法15-17
1.3.1 形态标记15
1.3.2 细胞学标记15-16
1.3.3 生化标记16
1.3.4 DNA分子标记16-17
1.4 遗传多样性研究的取样方法17-18
2 老芒麦的遗传多样性及育种研究进展18-23
2.1 老芒麦的地理分布与分类地位18-19
2.2 老芒麦遗传多样性的研究进展19-22
2.2.1 形态和农艺性状水平19-20
2.2.2 细胞学水平20
2.2.3 蛋白质水平20-21
2.2.4 DNA分子水平21-22
2.3 老芒麦在麦类作物遗传改良中的作用22-23
2.4 老芒麦育种概况23
3 本项研究的目的和意义23-25
第二章 老芒麦野生种质的形态和农艺性状多样性研究25-32
2 材料与方法25-28
2.1 供试材料25-26
2.2 研究方法26-27
2.2.1 试验地概况26
2.2.2 播种及移栽26-27
2.2.3 形态学性状测量27
2.2.4 农艺性状测量27
2.3 数据分析27-28
3 结果与分析28-31
3.1 形态及农艺性状测定结果28-29
3.2 老芒麦种质的聚类分析29-30
3.3 主成分分析30-31
4 讨论与结论31-32
第三章 老芒麦种质的醇溶蛋白遗传多样性研究32-41
1 引言32-33
2 材料与方法33-35
2.1 植物材料33
2.2 方法33-35
2.3 数据分析35
3 结果与分析35-39
3.1 醇溶蛋白多态性35-36
3.2 相似性系数36-37
3.3 供试种质间的聚类分析37-38
3.4 不同地理类群的遗传多样性指数38-39
3.5 地理类群的聚类分析39
4 讨论39-41
第四章 利用SRAP标记研究老芒麦种质资源的遗传多样性41-56
1 引言41-42
2 材料与方法42-46
2.1 植物材料42-44
2.2 DNA提取44
2.3 SRAP扩增44-45
2.4 数据分析45-46
3 结果与分析46-53
3.1 SRAP分析46-48
3.2 种质间的遗传相似性48-50
3.3 聚类系统树和主向量分析(PCA)对种质的划分50-51
3.4 老芒麦地理类群的遗传结构分析51-52
3.5 老芒麦地理类群的聚类分析52-53
4 讨论53-56
4.1 SRAP标记的多态性和变异53-55
4.2 供试种质间及其地理类群间的遗传关系55
4.3 供试种质间及其地理类群间的遗传关系55-56
第五章 利用ISSR标记评价青藏高原东南部老芒麦居群的遗传多样性56-69
1 引言56-57
2 材料与方法57-61
2.1 植物材料57-58
2.2 DNA提取和ISSR扩增58-60
2.3 数据分析60-61
3 结果与分析61-65
3.1 ISSR多态性61-62
3.2 群体遗传结构62-64
3.3 种群间的亲缘关系64-65
4 讨论65-69
4.1 遗传多样性65-66
4.2 群体遗传结构66-68
4.3 保护遗传学意义68-69
第六章 利用RAPD标记分析青藏高原东南部老芒麦居群的遗传结构69-84
1 引言69-70
2 材料与方法70-74
2.1 植物材料70-71
2.2 DNA提取和RAPD扩增71-73
2.3 数据分析73-74
3 结果74-80
3.1 RAPD多态性及居群内遗传多样性74-76
3.2 基于RAPD和ISSR的基因多样性的比较76-77
3.3 居群遗传结构77-78
3.4 居群间的亲缘关系78-80
4 讨论80-84
4.1 遗传多样性80-81
4.2 居群遗传结构81-83
4.3 保护生物学意义83-84
参考文献86-99
致谢99-100
攻读学位期间发表的学术论文目录100-101
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京公网安备75号b超单上写子宫后下方见44*13mm不规则液性暗区，左侧附件区探及一36*29mm类圆形团块，内为无...
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病情描述：b超单上写子宫后下方见44*13mm不规则液性暗区。左侧附件区探及一36*29mm类圆形团块，内为无回声暗区。超声提示左侧附件区囊性灶，陶氏腔积液是怎么回事。谢谢
因不能面诊，医生的建议仅供参考
病情分析：根据这个检查结果来看，说明有盆腔的炎症感染和附件囊肿情况，这都是由于平时局部炎症感染没有彻底治愈或者是治疗不及时所导致的。
指导建议：建议平时就应该注意局部的清洁卫生，特别是月经期间和性行为前后的卫生，出现白带异常时及时检查治疗，以免导致慢性感染，现在的情况可以采用输液抗炎、腹部理疗等方法治疗，定期做复查。
因不能面诊，医生的建议仅供参考
病情分析：陶氏积液又称盆腔积液，若是在排卵期或是妊娠期时会出现生理性积液，这是不用管的他可以自行吸收。若是病理性的大多是有炎症引起的。
指导建议：若是没有得到积极的正确治疗是会引起受孕困难，严重的将会导致不孕，需要我们注意。建议查看积液性质，在根据病因采取治疗方案。
副主任医师
因不能面诊，医生的建议仅供参考
病情分析：现在主要是有附件囊肿，陶氏腔积液，附件囊肿是良性病变，出现了腹部的包块形成，伴有了腹胀，腹部不适，影响了正常的生活，对于陶氏腔积液先观察为宜。
指导建议：附件囊肿可以服用桂枝茯苓胶囊治疗，一般在月经后可以恢复正常的，对于陶氏腔积液大多数是可以自行吸收的。
没有满意答案？看看更多相关问答亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成--《江南大学》2013年博士论文
亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成
【摘要】：共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，由于其多样的生理活性而受到广泛关注。为了满足CLA在医药及营养领域的应用需求，通过生物技术生产单一、安全的CLA活性异构单体成为CLA合成技术的发展趋势。本论文将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli）、高山被孢霉（Mortierella alpina）和耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）中进行异源表达，确定耶氏解脂酵母作为合适的trans-10，cis-12-CLA生物合成系统，在此基础上，通过基因工程手段构建了一株trans-10，cis-12-CLA的高产菌株，并对发酵条件进行初步优化，进一步提高CLA产量。论文的主要研究结果如下：
(1)构建了三种重组大肠杆菌重组菌株，分别表达三种重组PAI：C端融合6×His-tag的PAI、N端融合6×His-tag的PAI和不带有6×His-tag的PAI。将经镍柱纯化后的PAI免疫兔子，得到PAI多克隆抗体。通过SDS-PAGE和western blot分析三种重组菌的蛋白质表达情况，并利用气相色谱检测胞内相对酶活。结果显示，在相同的培养及诱导表达条件下，三种重组大肠杆菌均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组PAI，6×His-tag的融合表达对于重组菌株的生长及PAI的表达总量没有影响，但减少了PAI可溶性表达量，并且降低酶活，而C端添加亲和标签比N端对此影响更为显著。为了获得更多的活性PAI，在产油真菌中异源表达PAI基因时，应不添加任何亲和纯化标签。
(2)对M. alpina ATCC32222的孢子产量、孢子萌发率、孢子收集方法和孢子对抗生素敏感性进行了研究，确定最佳产孢培养条件是28℃、 PDA斜面上静置培养30天；为了去除菌丝并减少孢子的损失，采用60目滤布和20μm滤膜结合的两步法过滤孢子液；选择潮霉素作为筛选标记，潮霉素的最佳使用浓度为0.8-1.5mg/mL。构建了两种带有PAI基因的重组质粒：pD4-pai和pBIG-pai，分别用于基因枪轰击和农杆菌介导两种转化法。对转化实验条件进行摸索，最终通过农杆菌介导转化法获得稳定的转化子。以转化子的基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增证实了PAI基因成功整合在M.alpina转化子基因组上并发生转录，同时证明M. alpina表达系统构建成功。但M. alpina重组菌未能成功表达亚油酸异构酶。来源于细菌的PAI基因和真核生物M. alpina在密码子使用偏好性方面的差异可能是导致PAI异源表达失败的重要原因。
(3)鉴于PAI基因在M. alpina中异源表达失败，首先根据Y. lipolytica的密码子偏好性，优化了PAI基因，并在PAI基因的起始密码子前加上了Kozak序列。天然的PAI基因（pai）和优化后的基因（opai）分别以单拷贝整合方式整合到Y. lipolytica基因组上。通过对重组蛋白表达量分析及产物trans-10，cis-12-CLA含量测定，发现在七个整合了pai的重组Y. lipolytica菌株中，只在两个转化子中检测到了PAI蛋白，而十二个带有opai的重组菌株中全部检测到了PAI。脂肪酸分析的结果与蛋白表达结果一致，带有天然PAI基因的转化子只有两个检测到产物trans-10，cis-12-CLA。经过密码子优化后，trans-10，cis-12-CLA平均产量提高了10倍，为2.1mg/L。这些结果证明PAI基因的优化是在真核生物中成功实现异源表达的前提。通过多拷贝整合方式，进一步提高了PAI表达量和trans-10，cis-12CLA含量，其平均含量为14.3mg/L，是opai的单拷贝重组菌中CLA平均产量的6.8倍。
(4)从增加底物LA和提高PAI表达量两方面对酵母菌株进行改造。以带有单拷贝opai的Y. lipolytica重组菌株为出发菌株，将来源于M. alpina的delta-12脱氢酶基因在Y. lipolytica中进行异源表达，胞内亚油酸（LA）含量从总脂的27.8%提高至62.2%，底物的增加使得产物trans-10，cis-12CLA含量从2.3mg/mL升至3.8mg/L；在opai的原启动子hp4d上游插入12个UAS1B调控元件，得到新启动子hp16d，opai在新启动子调控下，PAI表达量提高了3倍，trans-10，cis-12CLA产量也提高至7.0mg/L；将以上两个基因改造策略结合使用后，二者的效果得到了叠加，trans-10，cis-12CLA产量提高了4.8倍，至11.0mg/L；最后通过多拷贝整合方式，进一步增强了二者的作用，trans-10，cis-12CLA产量为36.8mg/L，是出发菌株的16倍。经过分子改造后的最优菌株Polh-pINA1292-spopai-d12-16中CLA产量为44.9mg/L，占总脂肪酸的9.8%。
(5)基于对重组蛋白和脂质底物的双重需求以及Y.lipolytica高效吸收利用脂类物质的特性，采用添加了2%亚油酸的培养基YNBDL6，定向增加PAI底物。在摇瓶培养的72h，trans-10，cis-12CLA产量达到最高，而且在培养基上清中检测到产物CLA，胞内含量为0.2g/L，培养基上清中为0.1g/L，总产量是YPD培养基中CLA产量的6.7倍。通过提高培养基中氮含量，抑制了Y.lipolytica产酸，提高了菌体生长速度、脂质吸收效率及PAI表达量，在高氮培养基YN20BDL6中培养72h，trans-10，cis-12CLA的产量达到2.6g/L，为低氮培养基中CLA产量的8.7倍。在高氮培养基配方的基础上，考察不同纯度的LA对Y.lipolytica重组菌产CLA的影响。结果显示，LA纯度的提高对于Y.lipolytica重组菌株的生长和产脂没有影响，而且trans-10，cis-12CLA的产量随着LA纯度的增加而提高，添加了纯度为33%、65%、96%LA的培养基中Polh-pINA1292-spopai-d12-16的CLA总产量分别为0.9g/L、2.6g/L和3.7g/L。大豆油价格低廉，来源广泛，其中LA的含量占总脂肪酸的56%，用大豆油替代培养基中的亚油酸，Y.lipolytica重组菌的生长、产脂及CLA产量与添加65%LA的结果相近，trans-10，cis-12CLA的最高产量同样出现在摇瓶发酵的72h，总产量为2.5g/L，证明Y.lipolytica重组菌能够高效转化大豆油为CLA。在5-L发酵罐中，Polh-pINA1292-spopai-d12-16利用添加大豆油的培养基，在发酵38.5h，CLA产量达最高，胞内为3.1g/L，培养基中为0.9g/L。经过培养条件的初步优化，CLA的总产量达到4g/L，为YPD培养基中CLA产量的90倍，是迄今为止报道的最高水平的20倍。通过胞外酶活检测及显微镜观察细胞完整性，结果显示胞外并未检测到PAI酶活，也并未观测到细胞碎片，说明培养基上清中的产物CLA不是由PAI分泌或细胞裂解引起，推测其原因是胞内外发生脂质交换。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q93;Q78【目录】：
摘要3-5Abstract5-9目录9-13第一章 绪论13-21 1.1 概述13-14 1.2 共轭亚油酸的主要生理功能14-15
1.2.1 抗肿瘤功能14
1.2.2 减少脂质积累功能14-15 1.3 共轭亚油酸的生物合成机理15-17
1.3.1 单酶催化15-16
1.3.2 复合酶催化16-17 1.4 共轭亚油酸生物合成技术的国内外研究现状17-18
1.4.1 cis-9，trans-11-CLA 及 trans-9，trans-11-CLA 的生物合成17-18
1.4.2 trans-10，cis-12-CLA 的生物合成18 1.5 本课题的立题意义与依据18-19 1.6 本课题的主要研究内容19-21第二章 His-tag 对大肠杆菌表达重组亚油酸异构酶的影响21-31 2.1 前言21 2.2 实验材料21-23
2.2.1 菌株与质粒21
2.2.2 培养基及相关溶液21-22
2.2.3 实验试剂22
2.2.4 主要仪器22-23 2.3 实验方法23-26
2.3.1 大肠杆菌质粒 DNA 的提取23
2.3.2 重组质粒的构建23
2.3.3 大肠杆菌的化学转化23-24
2.3.4 转化子的筛选与鉴定24
2.3.5 重组亚油酸异构酶的诱导表达24-25
2.3.6 重组大肠杆菌生长曲线测定25
2.3.7 重组亚油酸异构酶的纯化25
2.3.8 多克隆抗体的制备及 westen blot 检测25
2.3.9 重组亚油酸异构酶的酶活检测25
2.3.10 脂肪酸提取及分析25-26 2.4 结果与讨论26-30
2.4.1 用于表达亚油酸异构酶的大肠杆菌重组菌株的构建26
2.4.2 重组亚油酸异构酶的纯化及多克隆抗体的制备26
2.4.3 His-tag 对重组菌株生长状态的影响26-27
2.4.4 His-tag 对重组亚油酸异构酶表达的影响27-28
2.4.5 His-tag 对重组亚油酸异构酶酶活的影响28-30 2.5 本章小结30-31第三章 高山被孢霉基因操作系统的构建及亚油酸异构酶基因的整合31-41 3.1 前言31-32 3.2 实验材料32-33
3.2.1 菌株与质粒32
3.2.2 培养基及相关溶液32-33
3.2.3 实验试剂33
3.2.4 主要仪器33 3.3 实验方法33-36
3.3.1 重组质粒的构建33-35
3.3.2 孢子收集方法35
3.3.3 抗生素敏感性测试35
3.3.4 基因枪转化法35
3.3.5 农杆菌介导转化法35-36
3.3.6 转化子的筛选与鉴定36
3.3.7 SDS-PAGE 及 western blot 分析36
3.3.8 脂肪酸提取与分析36 3.4 结果与讨论36-40
3.4.1 培养条件对高山被孢霉孢子得率的影响36-37
3.4.2 过滤方法对高山被孢霉孢子得率的影响37-38
3.4.3 不同抗生素对高山被孢霉孢子萌发的抑制效果38
3.4.4 基因枪转化法和农杆菌介导转化法的比较38
3.4.5 用于表达亚油酸异构酶的高山被孢霉重组菌株的筛选38-40 3.5 本章小结40-41第四章 共轭亚油酸在耶氏解脂酵母中的生物合成41-53 4.1 前言41-42 4.2 实验材料42-43
4.2.1 菌株与质粒42
4.2.2 培养基与相关溶液42
4.2.3 实验试剂42
4.2.4 主要仪器42-43 4.3 实验方法43-46
4.3.1 密码子优化43
4.3.2 重组质粒的构建43-44
4.3.3 酵母菌感受态制备及乙酸锂转化44-45
4.3.4 酵母菌基因组的提取45
4.3.5 转化子的筛选与鉴定45
4.3.6 定量 PCR 分析45
4.3.7 SDS-PAGE 及 western blot 分析45
4.3.8 脂肪酸提取及分析45-46 4.4 结果与讨论46-51
4.4.1 共轭亚油酸异构酶基因的密码子优化46
4.4.2 重组耶氏解脂酵母菌株的构建46-47
4.4.3 多拷贝整合菌株中 opai 表达单元的拷贝数分析47-48
4.4.4 密码子优化及多拷贝整合对重组亚油酸异构酶表达水平的影响48-49
4.4.5 密码子优化及多拷贝整合对共轭亚油酸产量的影响49-51 4.5 本章小结51-53第五章 基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸53-65 5.1 前言53-54 5.2 实验材料54-55
5.2.1 菌株与质粒54-55 5.3 实验方法55-58
5.3.1 重组质粒的构建55-57
5.3.2 酵母菌感受态制备及乙酸锂转化57
5.3.3 酵母菌基因组和总 RNA 的提取57
5.3.4 转化子的筛选与鉴定57-58
5.3.5 定量 PCR 分析58
5.3.6 SDS-PAGE 及 western blot 分析58
5.3.7 脂肪酸提取及分析58 5.4 结果与讨论58-64
5.4.1 重组耶氏解脂酵母菌株的构建58-59
5.4.2 多拷贝整合菌株中 opai/d12 表达单元的拷贝数分析59-61
5.4.3 启动子改造、opai/d12 共表达及多拷贝整合对 opai 的转录及表达水平的影响61-62
5.4.4 启动子改造、opai/d12 共表达及多拷贝整合对共轭亚油酸产量的影响62-64 5.5 本章小结64-65第六章 重组耶氏解脂酵母合成共轭亚油酸的发酵条件初步优化65-76 6.1 前言65-66 6.2 实验材料66
6.2.1 菌株与质粒66
6.2.2 培养基与相关溶液66
6.2.3 实验试剂66
6.2.4 主要仪器66 6.3 实验方法66-67
6.3.1 培养条件66-67
6.3.2 生物量的测定67
6.3.3 pH 及葡萄糖含量的测定67
6.3.4 胞内及胞外酶活的检测67
6.3.5 脂肪酸提取及分析67 6.4 结果与讨论67-75
6.4.1 氮含量的提高对 CLA 产量的影响67-70
6.4.2 不同浓度的亚油酸含量对 CLA 产量的影响70
6.4.3 培养基中添加大豆油替代亚油酸对 CLA 产量的影响70-72
6.4.4 重组耶氏解脂酵母菌株在 5-L 发酵罐中的 CLA 合成72-74
6.4.5 培养基中 CLA 的来源分析74-75 6.5 本章小结75-76论文主要结论76-77论文创新点77-78致谢78-79参考文献79-88附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文88
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