ELISA的操作要点(阳性,阴性对照,温度,显色,判定值) - 免疫实验 - 生物秀
标题: ELISA的操作要点(阳性,阴性对照,温度,显色,判定值)
摘要: [ELISA的操作要点(阳性,阴性对照,温度,显色,判定值)] 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条 件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。 本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试 剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明， [关键词:阳性 阴性对照 显色 温度 判定值 血清 试剂盒 试剂]……
优质的试剂，良好的和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条
件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。
本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试
剂均与特殊配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出 准确的结果。 4.1 标本的采取和保存
可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物 （如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行 测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检 测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制 备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除 特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。 血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活 性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假 阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清 融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和， 不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反 复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰 存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。 4.2 的准备
按盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包 括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出 的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰 箱保存。 4.3 加样
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物 加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发 生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的 血清，可在中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加 入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用 液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4.4 保温
在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完 成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在 ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心 法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最 贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散 才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为 什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用 的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究 时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速 反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需 时间太长，在ELISA中一般不予采用。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板 置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也 可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的 时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅 速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指 20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置 于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操 作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5 洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠 洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固 相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚 苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物 质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重 视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲 洗式两种，过程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔 后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随 意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清 洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本 底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯 乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其 疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助 于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤 液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
（2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用 自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟 后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比 淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于 微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果 更佳。 4.6 显色和比色 4.6.1 显色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时 间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的 反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格 控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判 断。
OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间， 可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时 加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验 结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶 峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十 二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间 （12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变 成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。 4.6.2 比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比 色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在 加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔 （以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用 空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下 角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。 4.6.3 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载 体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小的设计。许多试剂公司配套供应酶标 仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、 线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举 例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01 （1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶 标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标 仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应 注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围 为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注 意。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器 15-30分钟，测读结果更稳定。
测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波 长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长 （W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W2， 最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造 成的光干扰。
各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。 4.7 结果判断 4.7.1 定性测定
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单 回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为 无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一 个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高 稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈 色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴 性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
（1） 间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色 清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因 试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为 不含受检物的正常血清或类似物（见3.6）。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性 对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用测定吸光值，这样可 以得到客观的数据。先读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸 光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值 法两类。
a． 阳性判定值
阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断 结果阳性或阴性的标准。
用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照 品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数 是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒 为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明 为P=9±2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A 值的平均数（NCX ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于 一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX ，并≤1.5 ×NCX ，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX ；如有两个 阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：
阳性判定值=NCX +0.05
标本A值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用， 试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。
b.标本/阴性对照比值
在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本 （S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性 (positive)，而是病人（patient）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N表示。在早 期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一 测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受 检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液， 以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05 （或其他数值），则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。
（2）竞争法
在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物 的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为 敏感。
竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差 异，一般均用测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定 值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值， 现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳 性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值 后，先计算阴性对照A值的平均值（NCX ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数 的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3个阴性对照A值均应 小于2.000，而且应≥0.5×NCX 并≤1.5×NCX ，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另 2个阴性对照重新计算×NCX ；如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性 判定值按下式计算：
阴性判定值=0.4×NCX +0.6×PCX
标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：
抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值
一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。 4.7.2 定量测定
ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间
的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件
下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最
高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为
纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央
较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质ELISA测定的标准曲线示例见图4-1。
测定小分子量物质常用竞争法（参见2.2），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度
呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线 示例见图4-2。注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。 ELISA相关仪器试剂设备
ELISA检测试剂盒
ELISPOT检测
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ELISA设置阴性、阳性、空白对照涉及实验结果有效性评价
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ELISA阴性对照显色问题
原理：检测蛋白与结合蛋白能够相互作用结合，结合蛋白带C-FC标签，最后加入FC抗体（带HRP),TMB显色。
检测蛋白：A1-A8，B1-B8(复孔)
阴性对照：A9-A10，B9-B10(复孔)
说明：1-8中结合蛋白浓度依次减半，阴性对照中所加的结合蛋白浓度与A1相同。阴性对照用BSA包板，其他的操作与检测孔一样。
问题：为什么我的阴性对照颜色这么深？我自己感觉我的封闭和洗脱没有问题，BSA没有污染，但就是找不到原因，折腾了一个月了，哪位大神指点一下，感激不尽！！！小弟的金币数很少，全部拿出。感谢！
具体步骤：
1.& & & & 包被：检测蛋白按1ul/ml的浓度包板，条件4℃过夜。
2.& & & & 洗涤：PBS清洗3次，每次2min。
3.& & & & 封闭：用3% BSA ,室温1h。
4.& & & & 洗涤：PBS清洗3次，每次2min。
5.& & & & 结合：加入结合蛋白，37℃ 1h。
6.& & & & 洗涤：PBST清洗3次，每次2min
7.& & & & 杂交：用1%的BSA配制anti-FC抗体（比例1；10000），37℃ 1h。
8.& & & & 洗涤：PBST清洗3次，每次2min。
9.& & & & 反应：TMB溶液避光37℃15min左右。
10.& & & & 终止：1M HCL终止。
BSA包被浓度跟检测蛋白包被浓度一样，1ug/ml。我感觉这个因素不会影响，因为封闭的时候还用3%的BSA。
洗的时间我看网上也差不多3次 每次2min
1.理论上BSA是不会与我的二抗有反应的（所以用BSA来封闭），无论BSA的包板浓度是多少。就算按照摩尔浓度进行包板，之后的封闭用的BSA浓度更高，按照你的说法，那么非特异性结合就更多了。
2.顺便问一下elisa通常从那个摩尔浓度比进行稀释？
我的阴性对照包被液中没加抗体啊，加的是BSA。你的二抗反应多长时间？
包被不加抗体，加OVA封闭对照一下。先解决是否和BSA有交叉反应，再优化其他条件。
谢谢了 ，我找到大概的原因了 我洗涤的原因
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扫描下载送金币技术解析：ELISA实验设置阴性、阳性和空白对照的重要作用
ELISA检测，要求严格按照试剂说明书要求，每次试验、每块扳上都要设置以下3项对照和用途下面我司技术为您详细介绍ELISA实验设置阴性、阳性和空白对照的作用： 1．空白对照：仅用稀释液代替检测样本、用以观测最终反应的显色“本底”、并用于酶标仪消除、扣除“本底”，即：以本底为“零”读取阳性、阴性对照孔和样本检测孔的吸光值（A）；或者，在计算阴性对照均值（NCx）、阳性对照均值（PCx）、样本读数的S/C.O.值时减去空白对照的本底吸光值。& 2．阴性对照（品）：所谓阴性对照（品），应当是本项检测试验中采用与待捡物（样品、人用试剂就是人的血清等）具有同源性和同质性，又不含有待检物质，并能客观比较和鉴别处理因素（血清免疫学试验中有特异性抗原与抗体反应）之间的差异。&&&&&&&&&&&&&&&&& 3．阳性对照（品）：& （1）阳性对照（品）的概念与要求：同阴性对照（品），只是采用“精选”的含有待检物质的人血清制备而成。所谓“精选”，就是把收集的阳性人血清经过数种试验进行“筛试”、把含有“干扰性物质”的血清剔除、不用，以避免出现“假阳性”干扰试验结果。&& （2）阳性对照（品）设置，也可区分为两种类型与用途：& 一是阳性对照主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性。而所设的阳性对照的测量值不列入Cut off值计算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。& 二是阳性对照的设置，不仅用于评价试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性，而且计入Cut off的计算。此时的Cut off值的含义是代表该标志物在健康（正常）人群中正常值范围的上限。待检样本检测值超过该上限（Cut off）时表示有诊断意义。
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