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中兴对讲机总台说完话，抢不过别人，怎么办，我接不上话
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出门在外也不愁http://dx.doi.org/10.-00008
do solvente na extra&&o de &cidos clorog&nicos, cafe&na
e trigonelina em Coffea arabica
Solvent effects
on extraction of chlorogenic acids, caffeine and trigonelline in Coffea arabica
Guilherme Luiz S Pedro Henrique H Ieda Spacino Scarminio
Departamento de
Qu&mica, Universidade Estadual de Londrina, CP -990 Londrina
- PR, Brasil
In this research
work the effects of four solvents and their mixtures on the extraction of chlorogenic
acids, caffeine and trigonelline in crude extracts of four coffee cultivars,
traditional red bourbon, IAPAR59, IPR101 and IPR108 cultivars, were investigated
by UV spectrophotometry and UV spectra obtained from RP-HPLC-DAD. The experimental
results and the principal component analysis of UV spectra showed that the effect
of solvent extraction of the metabolites does not depend on cultivars, because
the spectral characteristics are similar, but the concentrations are different.
The UV and UV-DAD spectra for four simplex centroid design mixtures were also
similar but the concentrations of caffeine, trigonelline and the chlorogenic
acids are different and depend on the solvent used in the extraction.
Keywords: Coffea arabica.
INTRODU&C&AO
do caf& cont&m proteinas, lipidios, &cidos nucleicos, carboidratos,
clorofila, caroten&ides, enzimas e horm&nios. Quando torrados,
estes constituintes s&o destruidos ou podem ser transformados em uma
grande variedade de novos compostos.1 Os gr&os do caf&
verde tamb&m cont&m compostos biologicamente ativos como a cafe&na,
&cidos clorogenicos (ACG), trigonelina, entre outros. Estes metab&litos
s&o alguns dos precursores do aroma do caf&.2 A trigonelina
& rapidamente decomposta na torra do caf& em muitos componentes
vol&teis, mas mesmo assim & encontrada no caf& torrado
em concentra&&es mais baixas.1 Os ACG s&o os
principais compostos fen&licos encontrados no caf&, sendo &steres
de &cidos trans-cin&mico tais como, &cidos cafeico, fer&lico
e p-cum&rico com &cido qu&nico.3 S&o
metab&litos secund&rios de grande interesse econ&mico porque
tamb&m contribuem na forma&&o de pigmentos e sabor dos
gr&os do caf&, determinando assim a qualidade e aceita&&o
da bebida. A cafe&na, por ser o principal metab&lito fisiologicamente
ativo e o alcal&ide quantitativamente mais importante do caf&,
foi e ainda & o mais estudado desde a sua descoberta e identifica&&o.1
As duas variedades
comerciais mais importantes de caf& s&o a Coffea arabica
e a Coffea canephora syn. Coffea robusta, sendo C. arabica
de qualidade superior. Por esta raz&o, v&rios trabalhos relatam
m&todos para discriminar as duas esp&cies.4-9 Embora
existam milhares de artigos na literatura sobre caf&s defeituosos e n&o-defeituosos,10,11
propriedades antioxidantes dos metab&litos,12 os efeitos do
caf& na sa&de,13-15 os efeitos da torrefa&&o
dos gr&os de caf&,12 a qualidade da bebida,16-20
entre outros, poucos s&o os relatos na literatura sobre o efeito do solvente
na extra&&o de &cidos clorog&nicos, cafe&na
e trigonelina, principalmente na variedade Coffea arabica.
Nos programas de
melhoramento gen&tico do caf& o objetivo & desenvolver
diferentes cultivares para promover ganhos na produtividade e tamb&m
agregar caracter&sticas agron&micas de resist&ncia &s
pragas e doen&as. Por outro lado, a composi&&o qu&mica
e atributos sensoriais destes novos cultivares poder&o ser afetados.
Muitos m&todos
t&m sido desenvolvidos para a determina&&o de cafeina em
caf& e outras bebidas, sendo os mais frequentemente usados a cromatografia
l&quida de alta efici&ncia21 (CLAE) e as espectroscopias
no infravermelho com transformada de Fourier22 e UV/Vis.23
Para os ACG os m&todos mais usados s&o CLAE24 e eletroforese
capilar.25 CLAE com espectroscopia UV/Vis & a t&cnica
anal&tica hifenada mais popular baseada na cromatografia. O espectro
UV-Vis de cada pico cromatogr&fico pode ser uma ferramenta &til
para a identifica&&o dos componentes da amostra.
Atualmente, uma
das abordagens mais poderosas para o controle de qualidade de alimentos s&o
as t&cnicas de impress&o digital. Ela descreve uma variedade de
m&todos de an&lise que podem fornecer a identifica&&o
e quantifica&&o aproximada de um grupo de metab&litos.
As varia&&es dos metab&litos s&o observadas principalmente
por varia&&es nos padr&es espectrosc&picos ou cromatogr&ficos,
sem o conhecimento pr&vio das identidades dos compostos investigados.
Geralmente, amostras com impress&es digitais espectroscopica ou cromatogr&fica
semelhantes t&m composi&&es similares.
Para a identifica&&o
de marcadores de qualidade para o caf& & necess&rio examinar
os componentes que determinam as caracter&sticas arom&ticas na
mat&ria prima, juntamente com os componentes gerados durante o processo
de torra. Esta n&o & uma tarefa f&cil, porque na torrefa&&o
n&o ocorre somente a transforma&&o dos compostos originais
individuais, mas eles tamb&m se combinam de forma sin&rgica e
antag&nica contribuindo para a determina&&o do aroma final
da bebida. Mesmo assim, a an&lise qu&mica de cafe&na e
ACG nos gr&os & usada como ferramenta adicional para avaliar a
qualidade do caf&.
Nos &ltimos
anos, o nosso grupo tem mostrado que os planejamentos estat&sticos de
misturas permitem desenvolver procedimento de an&lise rigoroso mas econ&mico,
para mostrar os efeitos das varia&&es dos solventes na extra&&o
de metab&litos em material vegetal.26-31 Considerando a import&ncia
dos &cidos clorog&nicos e cafe&na como padr&o de
qualidade do caf&, nesta pesquisa foi utilizado um planejamento estat&stico
de mistura de quatro componentes etanol, acetato de etila, diclorometano e hexano
para encontrar o solvente extrator mais adequado para a extra&&o
destes metab&litos. Foram comparados gr&os de caf&s verdes
da cultivar Bourbon vermelho e outras tr&s cultivares desenvolvidos no
Instituto Agron&mico do Paran&, s&o elas IPR 101, IPR 108
e IAPAR 59. Todas as cultivares foram produzidas sob as mesmas condi&&es.
O objetivo principal
desta pesquisa foi usar planejamento estat&stico de misturas e an&lise
de componentes principais associados aos espectros UV para avaliar o efeito
do solvente na extra&&o de ACG, cafe&na e trigonelina em
quatro cutivares de caf&, Bourbon, IAPAR59, IPR101 e IPR108.
PARTE EXPERIENTAL
Amostras de
Foram analisados
os gr&os verdes de quatro diferentes cultivares de Coffea arabica,
a cultivar Bourbon vermelho, e tr&s cultivares desenvolvidas pelo Instituto
Agron&mico do Paran& (IAPAR), IAPAR 59, IPR101, IPR108. Na cultivar
Bourbon n&o h& cruzamento com outras cultivares e foi usada como
refer&ncia neste trabalho. A cultivar IAPAR 59 originou-se do cruzamento
entre Coffea arabica, Villa Sarchi 971/10 e o Hibrido de Timor 832/2
(Sarchimor); a cultivar IPR101 originou-se do cruzamento cultivar Catua&
x Sarchimor (com genes SH2, SH3 resistentes a ferrugem);
a cultivar IPR 108 originou-se do cruzamento cultivar IAPAR 59 x (Catua&
x Icatu). Todas as amostras foram cedidas pelo Instituto Agron&mico do
Paran&, IAPAR.
Todos os regentes
utilizados na extra&&o foram de grau anal&tico: &lcool
et&lico comercial (dR), acetato de etila (Vetec), hexano (Vetec), diclorometano
(F Maia), clorof&rmio (Vetec), KBr (Synth), Para as an&lises cromatogr&ficas
foram usados acetonitrila e metanol grau cromatogr&fico (Vetec) e &gua
ultrapura Milli-Q.
Equipamentos
Os equipamentos
e aparelhos utilizados foram: balan&a Anal&tica Shimadzu AY220,
evaporador rotativo Fisaton 801, aparelho de ultra-som (Unique, modelo Ultracleaner),
moinho de disco Perten-3600, peneira Granutest ABNT 25 com abertura de 0,71
mm, purificador de &gua Millipore Plus, cromat&grafo a l&quido
de alta efici&ncia SPD-M10AV Finnigan Surveyor com detector de arranjo
de fotodiodo (PDA) da Termo-Electro Corporation.
As medidas de absor&&o
foram realizadas em uma cubeta de quartzo de 1 cm, por meio de um espectrofot&metro
UV-VIS Genesys2, com varredura no intervalo de 200-900 nm e resolu&&o
de 1 nm. N&o houve necessidade de dilui&&o. Os solventes
puros, bem como suas misturas, apresentados na , foram
usados como branco.
Preparo dos
verdes dos caf&s foram previamente imersos em nitrog&nio l&quido
para facilitar a sua moagem e em seguida foram peneirados.
As misturas de
extra&&o foram escolhidas de acordo com um planejamento centr&ide
simplex para quatro componentes,32 totalizando 15 diferentes misturas,
. Cada extrato foi preparado pesando-se 10 g com adi&&o
de 150 ml de uma das misturas listadas na . Estas
misturas foram colocadas num banho de ultra-som durante 30 min. A &gua
do banho foi trocada a cada 15 min para evitar o aquecimento. Os extratos foram
filtrados em papel de filtro para separar a solu&&o das amostras
de caf&. Este procedimento foi repetido mais duas vezes. Ap&s
a extra&&o foi retirada uma al&quota de 15 mL do extrato
bruto que foram armazenadas sob refrigera&&o para as an&lises
UV-VIS e CLAE. Os extratos foram concentrados em evaporador rotativo a uma temperartura
de 60 &C (&3 &C) e mantidos sob ventila&&o for&ada
at& atingir peso constante, para obten&&o dos rendimentos
Preparo das
amostras para CLAE
Pipetou-se uma
al&quota de 20 µL de cada uma das solu&&es de extra&&o
de 15 mL e nesta adicionou-se 800 µL da fase m&vel. As amostras
foram filtradas em filtro Milipore Millex de 0,22 &m
e analisadas em seguida. As condi&&es cromatogr&ficas foram:
coluna cromatogr&fica Phenomenex C18, Kinetex 2,6 &m
Hilic 100 &A, com dimens&es de 150 mm x 4,6 mm, volume de inje&&o
vaz&o da fase m&vel a 1,0 mL min-1 em modo isocr&tico.
A elui&&o foi monitora nos comprimentos de onda de 210, 240 e
254 nm. Os dados foram processados usando o Software ChromQuest 4.2.
RESULTADOS E
DISCUSS&AO
Na primeira parte
deste estudo foi avaliado o efeito das diferentes propor&&es dos
solventes no rendimento do extrato bruto das quatro cultivares de caf&
ar&bica, . Ao se comparar os rendimentos do
extrato bruto em g/10 g da amostra, nota-se que aqueles preparados em etanol
puro apresentaram rendimentos maiores que aqueles com diclorometano, enquanto
que em acetato de etila e hexano os rendimentos foram similares e menores que
em etanol e diclorometano puros.
Observou-se que
os maiores rendimentos foram obtidos em extratos preparados nas misturas bin&rias
etanol:acetato de etila, etanol:diclorometano e etanol:hexano do que nos solventes
puros. Para a mistura etanol:acetato de etila o maior rendimento foi obtido
para o IPR 108, enquanto que para a mistura etanol:diclorometano o maior rendimento
foi para o IAPAR 59 e o menor para o IPR 108. Na mistura bin&ria etanol:hexano
os rendimentos foram similares para o IAPAR 59 e IPR 101. Os efeitos dos solventes
foram calculados no nosso trabalho anterior e mostraram-se significativos.33
Embora a espectroscopia
de absor&&o UV n&o seja uma ferramenta para elucida&&o
estrutural, o espectro traz informa&&o relacionada & estrutura
dos produtos naturais. Estas estruturas cont&m muitas liga&&es
duplas e absorvem na luz ultravioleta (200-400 nm) ou na luz vis&vel
(400-800 nm).
Os espectros de
absor&&o nas diferentes propor&&es dos solventes
para as amostras do caf& Bourbon foram submetidas & an&lise
de componentes principais (ACP).34 Para ACP os dados espectrais foram
colocados na forma de uma matriz 15 linhas e 201 colunas (240 a 400 nm), onde
cada linha corresponde a um espectro de um extrato do planejamento e as colunas
s&o as absorb&ncias nos diferentes comprimentos de onda. Esta faixa
foi escolhida devido ao ru&do em alguns espectros abaixo de 240 nm e
n&o conter informa&&o acima de 400 nm. Os dados foram autoescalonados
antes da an&lise das componentes principais. As tr&s primeiras
componentes principais explicam 93,5% da vari&ncia total dos dados. A
mostra o gr&fico dos escores da CP1&CP3
(~83% de vari&ncia). Observam-se dois grandes grupos ao longo da CP1.
O grupo 1 & formado com os espectros dos extratos que contem etanol puro
ou misturas com etanol, enquanto que o grupo 2 contem os espectros dos extratos
preparados em acetato de etila e diclorometano puros, suas misturas bem como
misturas com hexano. O espectro preparado em hexano & discriminado na
CP1 e CP3. Como os pesos caracter&sticos na regi&o de absor&&o
de ACG foram positivos na CP1, ent&o quanto mais para a direita (mais
positivo) na CP1 maior a concentra&&o de ACG. Este resultado fica
mais f&cil de interpretar quando se associa estas informa&&es
com os espectros originais, .
Os espectros preparados
em etanol puro ou misturas contendo mais que 50% de etanol (parte superior do
tetraedro) mostram forte absor&&o na regi&o de 225-375
nm. Os espectros com forte absor&&o entre 220-250 nm indicam a
presen&a de duas liga&&es insaturadas conjugadas, enquanto
que a absor&&o entre 250-290 nm indica a exist&ncia de benzeno
ou heterociclico arom&tico. Absor&&o acima de 300 nm indica
a exist&ncia de um sistema conjugado longo.35 Para amostras
de caf&, estas regi&es est&o associadas &s transi&&es
eletr&nicas das mol&culas de trigonelina, cafe&na e &cidos
clorog&nicos.
Os espectros das
solu&&es de diclorometano ou misturas contendo mais do que 50%
de diclorometano (lado direito do tetraedro) apresentam altos valores de absor&&o
entre 225-325 nm, mas com m&ximo em torno de 272 nm indicando maior contribui&&o
de cafe&na e/ou trigonelina. Os espectros das solu&&es
de acetato de etila puro ou misturas bin&rias com mais de 50% de acetato
de etila (lado esquerdo do tetraedro) apresentam m&ximos em torno de
280 nm sugerindo presen&a de &cidos benz&icos de baixo
peso molecular. Os comprimentos de onda para an&lise dos principais metab&litos
do caf& s&o 326 (max) e 300 nm atribu&dos aos &cidos
clorog&nicos,36 272 nm & cafe&na,37
265 (max) e 272 nm & trigonelina.38
Comparando-se a
raz&o da absorb&ncia em λ
= 326 nm para a mistura bin&ria etanol:acetato de etila em rela&&o
ao etanol puro, ela & 2,5 vezes maior para a mistura bin&ria,
enquanto que nas misturas etanol:diclorometano e etanol:acetato de etila:hexano
em rela&&o ao etanol puro esta raz&o & 2,08 vezes
maior. Considerando que maior o sinal anal&tico, maior a concentra&&o,
este resultado segue a mesma propor&&o. &E interessante
observar que misturas contendo diclorometano puro ou misturas com mais de 50%
de diclorometano apresentam maiores valores de absor&&o em 272
nm associado & cafe&na e/ou & trigonelina. A raz&o
entre a absorb&ncia em λ
= 272 nm da mistura tern&ria etanol:diclorometano:hexano & 2,26
vezes maior que para o diclorometano puro. Os espectros das misturas contendo
acetato de etila apresentam um m&ximo em λ
= 280 nm, associados aos &cidos de baixo peso molecular.
mostra o gr&fico das componentes principais CP1&CP2 incluindo
todos os espectros dos extratos das quatro cultivares. Observa-se o mesmo padr&o
nos grupos da , dado que o grupo 1 cont&m os
extratos preparados em etanol puro ou misturas contendo etanol, no grupo 3 est&o
os extratos preparados em hexano e no grupo 2 os demais extratos. O gr&fico
dos escores das componentes 2 e 3, embora com menor vari&ncia explicada,
tem uma distribui&&o de pontos exatamente igual &quele
da , mais positivo na CP2, maior a concentra&&o
Para obter mais
informa&&o sobre os metab&litos predominantes nos diferentes
extratos, foi usada a cromatografia l&quida em fase reversa. Nove diferentes
composi&&es de fase m&vel foram testadas na separa&&o
cromatogr&fica, . Estas propor&&es
foram escolhidas usando um planejamento de misturas de tr&s componentes
para se obter um aumento gradativo na for&a do solvente e varia&&o
na polaridade. Tr&s comprimentos de onda foram usados para investigar
o n&mero de picos em cada extrato, 210, 240 e 254 nm. Em geral a fase
m&vel preparada com 51:23:26 (v/v/v) em &gua:metanol:acetonitrila
apresentou maior n&mero de picos em 210 nm, sendo assim, esta fase m&vel
foi selecionada neste estudo.
mostra os espectros DAD correspondentes aos picos cromatogr&ficos
predominantes nos cromatogramas para o caf& Bourbon. Comparando - se
os espectros de absor&&o UV apresentados em cada ponto do planejamento
com os espectros DAD dos picos predominantes dos
cromatogramas apresentados na , observamos um efeito
da fase m&vel nos extratos que contem acetato de etila, que n&o
acontece com os outros solventes. A adi&&o da fase m&vel
provocou uma diminui&&o da absov&ncia e mudan&a no
comprimento de onda de absor&&o, inicialmente na regi&o
de 250-325 nm para 200-240 nm. Este efeito geralmente & produzido por
mudan&as estruturais,39 efeito do solvente e efeito do pH.40
&E bem conhecido que a intensidade e a posi&&o do comprimento
de onda λ
& afetada pela diferen&a entre os n&veis de energias eletr&nicas.
Pelo princ&pio de Franck-Condon as transi&&es eletr&nicas
envolvem o movimento dos el&trons, incluindo aqueles do solvente, mas
n&o o movimento dos &tomos. O aumento da polaridade do solvente
provoca um desvio do espectro de absor&&o para o vermelho (deslocamento
batocr&mico) ou para o azul (deslocamento hipsocr&mico). Em geral,
mas nem sempre solventes polares produzem transi&&es π→π*
com deslocamentos para o vermelho, em comprimentos de onda maiores ou seja um
deslocamento batocr&mico.39 Por outro lado, no caso da transi&&o
n→π*
de uma cetona, a intera&&o do par isolado de el&trons da
carbonila no estado fundamental com um solvente polar diminui a energia do orbital
n do par isolado, e assim aumenta a energia requerida para promover um el&tron
para o n&vel de energia π*.40 Consequentemente
ocorre um deslocamento para comprimento de onda menor, ou seja, um deslocamento
hipsocr&mico.
mostra os espectros DAD dos picos predominantes dos cromatogramas dos
extratos do caf& IAPAR 59. Observa-se que a
apresenta um perfil semelhante ao da , inclusive o
mesmo deslocamento hipsocr&mico para os espectros DAD dos extratos que
contem acetato de etila. Este deslocamento foi observado tamb&m para
as cultivares IPR 101 e IPR 108. Os espectros DAD para os quatro planejamentos
s&o similares ocorrendo apenas varia&&es nas concentra&&es
de cafe&na, ACG e trigonelina. Esta diferen&a depende do solvente
usado na extra&&o e era esperada, porque no melhoramento gen&tico
pode mudar a composi&&o qu&mica e atributos sensoriais
do caf&. Com exce&&o do IPR 108 o melhor solvente extrator
para os &cidos clorog&nicos foi o etanol, por outro lado tamb&m
extrai uma quantidade razo&vel de cafe&na e trigonelina. Para
o IPR 108 o melhor solvente extrator para ACG & a mistura bin&ria
etanol:diclorometano (1:1 v/v). Mistura de etanol:acetato de etila:diclorometano
(1:1:1 v/v/v) tamb&m & uma op&&o para extra&&o
de &cidos clorog&nicos. Para a cafe&na os melhores extratores
s&o o diclorometano puro ou a mistura diclorometano:hexano (1:1 v/v)
e para a trigonelina o etanol puro e as misturas etanol:diclorometano (1:1 v/v)
e etanol:hexano (1:1 v/v).
CONCLUS&AO
As diferen&as
nas concentra&&es dos &cidos clorog&nicos, cafe&na
e trigonelina nos extratos das quatro cultivares de caf& s&o fortemente
dependentes dos solventes usados na extra&&o.
Em geral o melhor
solvente extrator para os &cidos clorog&nicos foi o etanol ou a
mistura tern&ria etanol:acetato de etila:diclorometano (1:1:1v/v/v).
Para a cafe&na os melhores extratores s&o o diclorometano puro
ou a mistura diclorometano:hexano (1:1 v/v) e para a trigonelina o etanol puro
e as misturas etanol:diclorometano (1:1 v/v) e etanol:hexano (1:1 v/v). O acetato
de etila mostrou-se eficiente na extra&&o de &cidos fen&licos
de baixo peso molecular mas n&o na extra&&o dos metab&litos
de interesse. Al&m de extrair baixissima quantidade de &cidos
clorog&nicos, a adi&&o de &gua:metanol:acetonitrila
(51:23:26 v/v/v) provoca modifica&&o estrutural em alguns metab&litos,
gerando um deslocamento hipsocr&mico no espectro.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem
os apoios financeiros do CNPq e da Funda&&o Arauc&ria bem
como as bolsas concedidas. Ao Instituto Agron&mico do Paran& e
& Dra. M. B. dos S. Scholz pelo fornecimento das amostras de gr&os
de caf&s usados neste trabalho.
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Recebido em 07/03/2013
aceito em 19/07/2013
publicado na web em 21/08/2013
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