怎么使用Vector NTI 11.5设计引物.急，求详细步骤_百度知道
怎么使用Vector NTI 11.5设计引物.急，求详细步骤
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VECTOR设计引物必须为特异性性引物首先需要注意酶切位点位置.其次为了保证得到完整的酶切位点及准确性一般距离位哗肌糕可蕹玖革雪宫磨点50-100BP碱基处设计引物.设计引物具体原则如下：测序用引物要求非常严格,不同于PCR用引物.PCR用引物一般只要能和模板结合,3’端的几个碱基能完全配对,即使引物长达80～100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应.而测序用引物便不一样了,必须严格符合以下要求.(1)长度在18～25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整),(2)3’端尽量选择G或C碱基(但不绝对),以增加与模板的结合能力.(3)Tm温度应选择50℃～70℃左右.(4)GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续结构.(5)避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构.(6)保证引物和模板100%匹配,特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配.同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点.
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出门在外也不愁急！！！请教：关于PCR进行点突变时的引物设计 - 实验交流 - 生物秀
标题: 急！！！请教：关于PCR进行点突变时的引物设计
摘要: 急！！！请教：关于PCR进行点突变时的引物设计各位大虾，我马上要用pcr做点突变，现在正设计引物。我首先要在两边加上酶切位点，然后再在中间引入突变碱基。问题1：是否只需要在5`端加入酶切位点后在加上保护碱基，酶切位点的3`端碱基如果与NEB目录上的不同 ，影响大不大？问题2：我想设计两对引物，做3次PCR。一对引物批突变位点往5`端的片断，第二对引物批突变位点往3`端的片断。然后这两个产物退火后，批全长。但我不清楚在中间的点突变的引物设计中， 关键词:[引物 碱基 酶切位点 引物设计 点突变]……
各位大虾，我马上要用pcr做点突变，现在正设计引物。我首先要在两边加上酶切位点，然后再在中间引入突变碱基。
问题1：是否只需要在5`端加入酶切位点后在加上保护碱基，酶切位点的3`端碱基如果与NEB目录上的不同 ，影响大不大？
问题2：我想设计两对引物，做3次PCR。一对引物批突变位点往5`端的片断，第二对引物批突变位点往3`端的片断。然后这两个产物退火后，批全长。但我不清楚在中间的点突变的引物设计中，需要几个碱基才能让这两个产物退火？
问题3：在 中间的要有突变位点的位置设计引物时，有二聚体和二级结构，可是又必须在该位置设计引物，那怎么办呢？
问题4：如果我想在3`再加上一个tag，那这样又要引入酶切位点，又要加上tag，引物如何设计才合理呢，这样引物岂不是会很长。
那位PCR和引物设计的大拿能帮帮我，不胜感激！
问题1：是否只需要在5`端加入酶切位点后在加上保护碱基，酶切位点的3`端碱基如果与NEB目录上的不同 ，影响大不大？没有关系，
问题2：我想设计两对引物，做3次PCR。一对引物批突变位点往5`端的片断，第二对引物批突变位点往3`端的片断。然后这两个产物退火后，批全长。但我不清楚在中间的点突变的引物设计中，需要几个碱基才能让这两个产物退火？我建议你先将两段连接起来再连接第三段，
问题3：在 中间的要有突变位点的位置设计引物时，有二聚体和二级结构，可是又必须在该位置设计引物，那怎么办呢？不会把你的序列船上来我看看
问题4：如果我想在3`再加上一个tag，那这样又要引入酶切位点，又要加上tag，引物如何设计才合理呢，这样引物岂不是会很长。根据你的载体，对好读码筐回复:
非常感谢shuwolf！还有几个问题，你说的先将两段连接起来，再做第三段，是什么意思呢？是不是把两段pcr产物做成平端，连接后再作为模板扩全长？那这样和重叠法相比有什么优缺点呢?做平端的时候用klenow酶吗？平端有什么要求呢？如果我的载体没有tag，我又要加个tag上去。那直接把tag的序列加到引物上引入片段，可行吗？回复:
先扩增出二段产物，这二段产物之间至少要有15bp左右的重叠，然后在进行重叠延伸。回复:
我也想要。回复:
比如，这是我的序列，突变位点在598－600碱基，在这附近总是有二聚体，而且会形成cross dimer，怎么办呢？我不知怎么在这里传文件，我把序列copy上来了。在第一个碱基前点一下鼠标，再拖动滚动条到最后，按住shift键，点最后的碱基后面，就全部选中了，再copy &paste就可以了。哪位引物设计的高手能不能帮忙看看。真是不胜感激。我的上游引物设计为：ggaacttgggctatggctgacgcta，红色为插入的酶切位点。TAGCTGGAAGACTGTGAAGCAGAGGCGCCCAGGGCTATGGCTGACGCTATCACGTATGCAGACCTGCGCTTTGTGAAAGTGCCCCTGAAGAACAGCGCATCTAACCATCTAGGACAGGACTGTGAGGCCTATGAAGATGGGGAACTCACCTACGAGAACGTGCAAGTGTCTCCAGTCCCAGGAGGGCCACCAGGCTTGGCTTCCCCTGCACTAGCGGACAAAGCAGGGGTCGGGTCAGAGCAACCAACTGCGACCTGGAGCTCTGTGAAGTCGTCTGCTCTCAGGCAGATTCCCCGCTGTCCTACGGTCTGCTTGCAAAACTTCTTGCTTGGCCTTCTCCTGTCCTGTCTGATGTTAGGGGTGGCTGTCATCTGCCTGGGAGTTCGCTATCTGCAGGTGTCTCAGCAGTTCCAGGAGGGGACCAGGATTTGGGAAGCCACCAATAGCAGCCTGCAGCAGCAGCTCAGGGAGAAGATAAGTCAGCTGGGGCAGAAGGAGGTGGAGCTTCAGGAGTCTCAGAAAGAGCTGATCTCGAGCCAGGACACATTACAGGAGAAGCAGAGGACTCACAAGGACACTGAGCAGCAACTACAAGCCTGCCAGGCTGAGAGAGCGAAGACCAAGGAGAACCTGAAAACTGAGGAGGAGCGGAGGAGGGACCTGGACCAGAGGTTGACAAGCACGCGGGAGACACTGAGGCGCTTGTCCTCCTGTTCATCAGACACCTGCTGTCCATGCGGATGGATTCCATATCAGGAAAGGTGCTTTTACATCTCACATACCCTCAGAAGTCTGGAGGAGAGCCAAAAATACTGCACATCTCTGTCCTCCAAACTGGCAGCATTCGATGAACCTTCTAAGTATTACTATGAAGTTTCTCTGCCCAGCGGCTTAGAGGAGTTGCTAGATCGTTCGAAGTCATATTGGATACAGATGAGCAAGAAGTGGAGGCATGACTATGACTCTCAAAGCCGATATTGTGACAAGATAAAAAAATATTACCAGAAGTGGAAAAGAACATTTTCTGAGTGTGCAGAGCTTCACCCCTGCATTTGTGAGTCGGAGGCTTTCAGGTTTCCTGATGGGATCCATCTGAACTGAACCGGATACTTGAACAAGACCTTGTGACCTACATCCTTAACCTAAGGCCTGCCAATTTTTAAGACTGCTATTCCTCCAGCACTCCCTCACTCTCGGGCATGCCCAGCTAAGGGATGACCTGCTGCTTGCTTGAAAGCTGCTCCAGAAACTGGACTACTCTTGGGAAGAGTAAAGAAGCCTCCAGAAAAGACTTGACCTTCCTTAAATACTTCCCAAACTAGAGATGGGTCAGGGGAGGGCGCTCCGCTGAGTGGATGGATGGCCCGGAGCCAGCCAGGCAGTTTTATTGAAATATTTTTAAATACTT
我是第一次自己设计引物，所以希望大家能帮我一下，示范一下就好！回复:
回答：1,一个保护碱基是不够的，一般在加酶切位点时，如果对保护碱基不太熟悉，选择四个是比较保险的；2,突变位点是固定的，所以引物的位置也是基本固定的，把突变的位点设在引物的中部，然后根据Tm值、二级结构、二聚体等进行位置和长度的微调；3,在突变的地方取相互互补的一对引物，这样一方面增加突变的概率，另外一方面也是为了后面的重叠延伸，引物长度可以取长一些，便于重叠延伸。回复:
打错了，酶切位点是GAATTC,是EcoRI的酶切位点。在NEB目录上加一个保护碱基G，2hr的切割率达到90%。所以我就用了一个保护碱基，这样是不是在实际操作中还是不保险呢？还要再多加两个？的确突变位点固定，引物位置也就相对固定了，但我不知道如果有dimer和cross dimer，pcr的效果会怎样，所以希望在开始阶段尽量设计好引物。回复:
如果软件设计的两条引物Tm值相差较大，如10度，是不是不合理？
在5`端加上额外碱基后，不计算在内的Tm值非常小，和配对引物相差达到40度,怎么看呢？
primer5设计引物时，会给出sense和antisense的rating，然后还给出了product的rating，一般product的rating较低，有时才40-50，我想问问，rating 到多少才合适？
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电话：021-PCR引物设计过程
PCR引物设计过程
（一）设计引物前应的准备工作：
1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分
2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用
3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用
（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’
1．两个酶切位点
2．酶切位点的保护碱基
3．5’端保护碱基
4．3’端保护碱基
5．引物配对区
（三）设计引物所要考虑的问题
1．酶切位点
两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
2．酶的选择
最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。
3．Tm的计算。
Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90
，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false
priming、cross dimer等参数。
4．退火温度
退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，
PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。
5．5’端保护碱基
一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基
6．引物二聚体
关于引物二聚体，最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的△G（自由能）的绝对值，如果小于10，一般是问题的。如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果
PCR没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。
7．引物的设计
在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是28bp左右了。而我们在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp)
的Tm肯定要高一些。如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。
还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚。设计时限制性酶切位点是应该在5’端的顶端。在设计引物时，常在5’端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先用软件设计出合适的引物，引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A（容易错配）。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。目的序列上并不存在的
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各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)
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&&酶​不​同​,​所​需​要​的​酶​切​位​点​的​保​护​碱​基​的​数​量​也​不​同​。​一​般​情​况​下​,​在​酶​切​位​点​以​外​多​出个​碱​基​即​可​满​足​几​乎​所​有​限​制​酶​的​酶​切​要​求​。​在​资​料​上​查​不​到​的​,​我​们​一​般​都​随​便​加个​碱​基​做​保​护​。
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你可能喜欢任何PCR引物都需要加保护碱基嘛?
保护碱基是为了“保护酶切位点”,所以,只有引物5‘端有酶切位点时,而且想直接酶切PCR产物时,才加保护碱基.
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这个一般是构建载体的时候，在引物里面引物酶切位点才会加保护碱基的，这个保护碱基是为了让酶能够正确识别酶切位点，如果你先把PCR连到T载体上再酶切的话，就不用加任何保护碱基都能正确切下来。
不是的。只有在你设计引物时在5‘端引入限制性内切酶位点的时候，才需要在位点前加保护性碱基。
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