活性氧在糖尿病性视网膜病变中作用机制及干预研究--《上海交通大学》2007年博士论文
活性氧在糖尿病性视网膜病变中作用机制及干预研究
【摘要】：
目的阐明活性氧(reactive oxygen species,ROS)在糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中的作用机制,探讨色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对高糖孵育的细胞凋亡的影响以及他汀类药物辛伐他汀和血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)培多普利对糖尿病大鼠视网膜病变的作用。
方法(1)原代培养牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BRECs),分别在正常浓度葡萄糖(5 mM)、高浓度葡萄糖( 30 Mm )、高浓度葡萄糖联合ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)(10 mM)、高浓度葡萄糖联合Janus激酶2(Janus Kinase2,JAK2)抑制剂AG490(10μM)、高浓度葡萄糖联合PEDF(100 nM)以及高浓度葡萄糖联合NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI)(10μM)的DMEM培养基中培养,应用TUNEL检测细胞凋亡率,荧光检测仪测定细胞ROS浓度和NADPH氧化酶活性,RT-PCR及western blot分别检测细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA及其蛋白、JAK2和信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)蛋白及其磷酸化蛋白表达。(2)链脲霉素(streptozotocin, STZ)腹腔注射(60 mg/kg)建立大鼠糖尿病模型,运用免疫组化检测视网膜组织中JAK2/STAT3磷酸化蛋白表达,RT-PCR及western blot分别检测大鼠视网膜组织VEGF mRNA及其蛋白、JAK2/STAT3蛋白及其磷酸化蛋白表达,并作相关关系分析。(3)使用以上糖尿病动物模型,成模后1周,辛伐他汀予以干预(4mg/kg/day溶解于供鼠饮用的水中灌胃)6个月,并设立对照;同时使用高糖联合辛伐他汀(5μM)等孵育BRECs。运用消化铺片评定视网膜血管组织周细胞和无细胞毛细血管数,免疫共沉淀检测组织及细胞聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)活性,运用RT-PCR及western blot分别检测组织和细胞血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)和VEGF mRNA及其蛋白以及细胞解耦联蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP-2)mRNA及其蛋白表达,应用流式细胞术检测线粒体膜电位,ROS浓度和NADPH氧化酶活性检测方法同方法(1)。(4)收集21例1型糖尿病伴增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者和16特发性黄斑裂孔(idiopathic macular hole,IMH)患者玻璃体,运用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)测定玻璃体VEGF和PEDF水平;使用以上糖尿病动物模型,成模后1周,培多普利予以干预(2mg/kg/day溶解于供鼠饮用的水中灌胃)6个月,并设立对照;同时使用高糖联合培多普利(10μM)等孵育BRECs。运用透射电镜测定视网膜血管基底膜厚度(capillary basement membrane thickness,BMT),应用ELISA检测细胞膜及胞浆蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)活性,运用RT-PCR及western blot分别检测组织和细胞VEGF和PEDF mRNA及其蛋白以及细胞UCP-2 mRNA及其蛋白和过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-gama,PPARγ)mRNA及其蛋白水平表达。视网膜血管组织周细胞和无细胞毛细血管形成数、ROS浓度、NADPH氧化酶活性和线粒体膜电位检测方法分别同方法(1)、(2)和(3)。
结果(1)同对照组比较,高糖诱导BRECs ROS产生显著性增加,JAK2/STAT3大量磷酸化,使得VEGF mRNA及其蛋白表达上调,同时伴随高糖孵育BRECs凋亡显著性增加(p0.01);PEDF治疗可显著性抑制这些变化(p0.05)。(2)糖尿病大鼠与对照组大鼠比较,视网膜组织JAK2/STAT3磷酸化蛋白表达显著性上调(p0.01),而JAK2/STAT3表达无显著性变化。同时,VEGF mRNA及其蛋白表达增加(p0.01),且VEGF蛋白表达与STAT3蛋白磷酸化呈显著性正相关(p=0.01)。糖尿病组视网膜JAK2/STAT3磷酸化蛋白免疫光斑主要位于神经节细胞层及内核层,且糖尿病组阳性斑点强于对照组。(3)辛伐他汀治疗显著性降低糖尿病大鼠视网膜组织PARP活性以及Ang-2和VEGF mRNA及其蛋白表达(p0.05),且伴随其周细胞凋亡和无细胞毛细血管形成减少(p0.05)。糖尿病大鼠视网膜聚腺苷二磷酸核糖化PARP蛋白免疫光斑主要位于神经节细胞层及内核层,在外界膜和色素上皮层也可见弱的光斑。糖尿病组阳性斑点强于对照组,辛伐他汀治疗后,其阳性斑点变弱。体外实验结果显示,辛伐他汀可上调高糖孵育的BRECs UCP-2 mRNA及其蛋白表达以降低线粒体膜电位以及抑制NADPH氧化酶激活,从而减少ROS生成,抑制PARP激活,使得Ang-2和VEGF mRNA及其蛋白表达下调。(4)同IMH患者比较,PDR患者玻璃体VEGF水平显著性升高,PEDF水平显著性下降(p0.01)。与之形成鲜明对比的是,糖尿病大鼠视网膜组织VEGF和PEDF mRNA及其蛋白水平均显著性上调(p0.01),培多普利可显著性抑制这些变化(p0.01),并伴随视网膜血管周细胞凋亡及无细胞毛细血管形成减少和BMT变薄(p0.05)。体外实验结果显示,培多普利通过上调高糖孵育的BRECs PPARγ/UCP-2表达,抑制ROS调节的PKC激活,导致VEGF/ PEDF比值下降(VEGF下调且PEDF上调)。
结论(1)ROS可通过JAK2/STAT3/VEGF通路、PARP/Ang-2、VEGF通路以及PKC/VEGF、PEDF通路等激活在糖尿病大鼠视网膜病变发病中发挥重要作用。ROS以及与之相关的这些通路可能成为DR防治的有效靶点。(2)PEDF通过对NADPH氧化酶的抑制,减少高糖诱导的细胞ROS生成,使得JAK2/STAT3磷酸化蛋白下调,从而防止高糖诱导的血管内皮细胞凋亡。JAK2/STAT3可能是PEDF的有效靶点。(3)他汀类和ACEI分别通过对NADPH氧化酶和线粒体通路调节的ROS/PARP轴和ROS/PKC轴的抑制,显著缓解糖尿病大鼠视网膜血管组织损伤。他汀类和ACEI可能是DR防治的有效药物,具有潜在的临床应用前景。本研究的这些系列发现,将为DR的防治提供科学依据,具有一定的理论意义和现实价值。
【关键词】：
【学位授予单位】：上海交通大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：R587.2;R774.1【目录】：
中文摘要4-9
英文摘要9-16
缩略词表16-18
第一部分 活性氧在高糖孵育的牛视网膜血管内皮细胞凋亡中的分子机制及在糖尿病鼠视网膜病变发病中的意义24-55
材料和方法24-41
参考文献52-55
第二部分 色素上皮源性因子抑制高糖孵育的牛视网膜血管内皮细胞凋亡的作用机制55-66
材料和方法55-57
参考文献64-66
第三部分 辛伐他汀对糖尿病鼠视网膜病变的作用及其机制66-88
材料和方法67-71
参考文献85-88
第四部分 培多普利对糖尿病鼠视网膜病变的作用及其机制88-114
材料和方法89-96
结果96-105
讨论105-109
参考文献109-114
综述114-130
糖尿病并发症统一机制学说与糖尿病性视网膜病变114-122
参考文献122-130
致谢130-132
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我母亲高血压 长期服用复方利血平片 降压...
我母亲高血压 长期服用复方利血平片 降压效果不错 但担心副作用 能否推荐一种更合适的药？突然换药身体能适应吗？有什么注意事项？
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问题分析： 建议低盐饮食,低脂肪饮食.一定要禁烟,酒,避免情绪激动.如果有高血脂必须同时治疗啊.否则降压效果不好.意见建议：在当地医生指导下选择降压药如:心痛定.最好选择缓释片如波依定或硝苯地平缓释片口服,血压更平稳.多吃些果蔬是有好处的.
职称：医师
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问题分析： 高血压，女性，60岁，长期服用复方利血平片 降压效果不错，但有可能诱发抑郁症和水电解质紊乱，一般不建议使用。目前常用的降压药物有二氢吡啶类药物如非洛地平胶囊，血管紧张素转换酶抑制剂如培多普利，血管紧张素受体拮抗剂如厄贝沙坦，B-受体阻滞剂如倍他乐克，α-受体阻滞剂，利尿剂如吲达帕按等药物可以根据病情选择治疗。更换药物如果是个体化的没有不合适的，所以是可以突然更换药物的，意见建议：建议低盐饮食，每日运动30分钟有氧运动，戒烟酒，请在心血管医生指导下跟换个体化药物治疗，不建议继续使用复方利血平片
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A、六大类降压药
a&& 利尿药
不良反应：长期服用可致低钠血症、低钾血症、低氯血症而引起恶心、呕吐、腹泻、口渴、头晕、
&&&&&&&&&&
肌痉挛；此外尚上有皮疹、瘙痒、视力模糊及长期服用肝、肾等脏器损害等。
& 氢氯噻嗪& 别名 ：双氢噻嗪 双克
双氢克尿塞&&&&&&
呋塞米&&&&&&&&&&
速尿& 呋喃苯胺酸 呋安酸&
蚓达帕胺&&&&&
寿比山& 伊特安&
曲帕胺&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
复方盐酸阿米洛利&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
胺苯蝶啶&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
b β-受体阻断药
不良反应：四肢冰冷，疲劳，肠胃不适，心动过缓；情绪变化，心脏衰竭；头晕头痛及长期服用肝、
肾等脏器损害等
酒石酸美托洛尔&&&&&
别名：倍他乐克&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
阿替洛尔&&&&&&&&&&&&&&&&&
天偌敏&&&&
富马酸比索洛尔&&&&&&&&&&&
盐酸阿罗洛尔&&&&&&&&&&&&&
盐酸普萘洛尔&&&&&&&&&&&&&
c&& 拮抗药（生理降压药）
不良反应：头晕、头痛、面色潮红、肠胃不适、浮肿、皮疹；偶见房室传导阻滞、严重心动过缓、
窦性停搏；头晕头痛及长期服用肝、肾等脏器损害等。
苯磺酸氨氯地平&&&&
别名：洛活喜
尼群地平&&&&&&&&&&&&&&&&
硝吡乙甲酯&& 硝苯乙吡啶
拉西地平&&&&&&&&&&&&&&&&
乐息平&&&&
三精司乐平
非洛地平&&&&&&&&&&&&&&&&
硝苯地平&&&&&&&&&&&&&&&
(心痛定)（拜新同）(爱地清)
(硝苯吡啶) (弥心平)
盐酸地尔硫卓&&&&&&&&
蒂尔了 合贝爽 盐酸硫氮卓酮
维拉帕米&&&&&&&&&&
缓释异搏定
盐酸尼卡地平&&&&&&
佩尔&& 仙立
乐卡地平&&&&&&&&&&
d& α-受体阻断药（降压又降脂）
不良反应：头晕、头痛、疲乏、心悸、心律失常、瘙痒、失眠及长期服用肝、肾等脏器损害等
卡维地洛&&&&&&&&&&
达利全&& 络德
盐酸特拉唑嗪&&&&&&
高特灵&& 四喃唑嗪
盐酸乌拉地尔&&&&&&
优匹敌& 压宁定& 利喜定
布那唑嗪&&&&&&&&&&
哌唑嗪&&&&&&&&&&&&
ACEI（血管紧张素转化酶抑制药）
不良反应：头晕、疲乏、症状性低血压、胃肠功能紊乱、皮疹、瘙痒、面红、尿频、咳嗽、呼吸道
&&&&&&&&&&
症状、头痛及长期服用造成肝、肾等脏器损害等
盐酸贝那普利&&&&&&
卡托普利&&&&&&&&&&
开博通& 硫甲丙脯酸
希拉普利&&&&&&&&&&
雷米普利&&&&&&&&&&
赖诺普利&&&&&&&&&&
福辛普利纳&&&&&&&&
培哚普利&&&&&&&&&&
马来酸依那普利&&&&
康宝顺& 悦宁定
f&& ARBS（血管紧张素II受体拮抗药）
不良反应：腹泻、血管性水肿、背部疼痛、上呼吸道感染、头痛、头晕及长期服用造成肝、肾等脏
颉沙坦&&&&&&&&&&&&
氯沙坦钾&&&&&&&&&
替米沙坦&&&&&&&&&
伊贝沙坦&&&&&&&&&
安博维&& 吉加
B、性能各异的其他药
利血平&&&&&&&&
血安平& 寿比安& 蛇根碱
&&& 复方降压片
&&& 复方利血平片
&&& 脉舒静
&&& 降压静片
美加明&&&&&&&&
盐酸肼苯哒嗪&&&
盐酸肼酞嗪
双阱屈嗪&&&&&&&
双肼酞嗪&& 血压达静
&&& 地巴唑
门冬氨酸钾镁&&&
脉安定& 潘南金
&&& 硝普钠
北京降压0号&&&
复方降压片
&&& 甲基多巴
盐酸可乐定&&&&&
氯压定& 催压降& 110降压药
清脑降压片、牛黄降压、麝香脑脉康胶囊、心脑静片、镇脑宁、脑立清丸、愈风宁心片、复方羚角降压片
目前高血压病人常用的抗高血压药物，按照药理的作用，可以分为六大系列。
利尿剂是使用最早，最常用的降压药物，降压作用显著，对老年人收缩期高血压和肥胖的高血压病人降压尤为适用，但不适宜痛风、高脂血症及糖尿病病人。可与其他各类抗高血压药物合用，能增加降压的效果。由于长期应用易引起低血钾等不良反应，现在已经很少大剂量地使用。常用的利尿剂按照其降压作用的强弱，分为高效利尿剂（速尿、利尿酸），中效利尿剂（双氢克尿噻、氯噻酮），低效利尿剂（安体舒通、氨苯喋啶、），低效利尿剂都有保钾的作用。利尿剂最大的优势是价格低廉。
β－阻滞剂
β－阻滞剂既能降低血压，又能减慢心率，应用很广泛。这是一类“洛尔”系列，常用的有阿替洛尔（氨酰心安）、美托洛尔（倍他乐克、美多心安）、拉贝洛尔（柳安苄心啶）、比索洛尔（博苏）。β－阻滞剂适用于年轻人和心率偏快的高血压病人，对合并冠心病的高血压病人尤为适合。但是，对心率已经很慢、存在心脏传导阻滞和有哮喘的高血压病人禁止服用。
α－阻滞剂
α－阻滞剂的特点是不影响血脂和血糖的代谢。这是一类“唑嗪”系列，常用的药物有短效的哌唑嗪，长效的多沙唑嗪、特拉唑嗪等。由于α－阻滞剂同时能治疗前列腺肥大，对伴有前列腺肥大的老年男性更为适用。α－阻滞剂主要的不良反应是会引起体位性低血压，所以，服用该药的病人，起床时要格外小心，动作要慢。
血管紧张素转换酶抑制剂
血管紧张素转换酶抑制剂是一类安全有效的降压药，它的种类最多，适应证最广，对血脂和血糖的代谢没有影响，对肾脏有保护作用，是高血压合并心力衰竭和糖尿病理想的首选药物。肾功能不好的病人也能应用，只是要从小剂量开始服用，严重的肾功能衰竭和患有双侧肾动脉狭窄的病人以及怀孕妇女则不能服用。令人遗憾的是，这么好的一类降压药却有咽痒干咳的不良反应，发生率在10％左右，影响了药物的广泛应用。这是一类“普利”系列。根据药物作用时间的长短，可分为短效、中效和长效，短效的有卡托普利（巯甲丙脯酸），中效的有依那普利（依那林），长效的种类很多，有苯那普利（洛汀新）、培多普利（雅施达）、福辛普利（蒙诺）、贝那普利（一平苏）、米达普利（达爽）等等。
血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂
这是一类最新的降压药，是在血管紧张素转换酶抑制剂的基础上开发成功的。不会引起咽痒干咳的不良反应。被认为是不良反应最少的一类降压药，作为“沙坦”系列，最早应用的是氯沙坦，以后不断开发的有缬沙坦、依贝沙坦等。
钙拮抗剂降压效果安全有效，其特点是在降压的同时，不降低重要器官的血液供应，对血脂、血糖的代谢没有影响，适用于老年高血压和已有心脑肾损害的高血压病人。此类“地平”系列种类不少。短效的有硝苯地平（心痛定）、恬尔心，中效的有尼群地平，长效的有氨氯地平（络活喜）、非洛地平（波依定）、尼卡地平。通过对制剂工艺的改进，制成缓释和控释片，使短效的药物具有长效的作用，如硝苯地平控释片（拜新同）、恬尔心缓释片、缓释异搏定（维拉帕米）。常见的不良反应有面红、头痛、心跳加快、脚踝水肿，短效药的不良反应更为显著些。
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