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乳腺上皮细胞条件培养基对人脂肪干细胞增殖和上皮分化的影响
第一部分人乳腺上皮细胞的分离培养和条件培养基的制备　　目的：分离和培养人肥大乳房乳腺上皮细胞,制备分别来自人肥大乳房乳腺上皮细胞和正常乳腺上皮细胞的条件培养基。　　方法：采用胶原酶消化法从人肥大乳房的乳腺组织中分离乳腺上皮细胞,并传代培养至第3代;复苏冻存的人正常乳腺上皮细胞株(HBL-100),并进行培养。MTT法绘制两种细胞的生长曲线,比较其增殖能力的差别。收集两种乳腺上皮细胞的上清液,制备条件培养基。对条件培养基进行质量检测。　　结果：分离和培养的人肥大乳房乳腺上皮细胞,以及复苏的正常乳腺上皮细胞株(HBL-100)生长状况良好,为典型的上皮细胞形态。MTT法显示两种细胞的光密度值(OD值)差异有统计学意义(P<0.05)。制备的条件培养基外观清亮、无菌、PH值7.35±0.06、葡萄糖浓度为100㎎/dl。　　结论：同样培养条件下,HBL-100较肥大乳房乳腺上皮细胞的增殖能力强。成功制备来自于乳腺上皮细胞的符合细胞培养基本要求的条件培养基。　　第二部分不同条件培养基对人脂肪干细胞增殖能力的影响　　目的：观察两种条件培养基对人脂肪干细胞生长和增殖能力的影响,为下一步诱导脂肪干细胞定向分化筛选合适的条件培养基。　　方法：体外分离和培养人脂肪干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105的表达,并体外诱导脂肪干细胞向脂肪细胞和软骨细胞分化。用不同条件培养基培养脂肪干细胞,MTT法绘制细胞的生长曲线,比较不同条件培养基对脂肪干细胞增殖能力的差别。　　结果：体外分离和培养的人脂肪干细胞生长状况良好,呈典型的成纤维细胞形态。流式细胞仪检测结果显示CD13、CD29、CD44、CD90和CD105阳性表达,而不表达CD45,经成脂和成软骨定向诱导,细胞分别出现脂肪细胞和软骨细胞的表型特征。脂肪干细胞经人肥大乳房乳腺上皮细胞和HBL-100的条件培养基培养后,分别出现细胞数目减少和增殖旺盛的现象。　　结论：来自于人肥大乳房乳腺上皮的条件培养基不能促进脂肪干细胞的正常生长和增殖。而来自于人正常乳腺上皮细胞株(HBL-100)的条件培养基可促进细胞的正常增殖,适合于用作脂肪干细胞的培养液。　　第三部分条件培养基诱导人脂肪干细胞向乳腺上皮细胞分化的实验研究　　目的：探讨条件培养基诱导人脂肪干细胞(ADSCs)向乳腺上皮细胞定向分化的可行性。　　方法：实验组和对照组分别采用条件培养基和DMEM/F12﹢10％FBS培养脂肪干细胞,培养16天,Westernblot检测细胞表面标志物卵透明带蛋白1(zonaoccludensprotein1,ZO1)和细胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)的表达。诱导分化后的细胞在体外进行三维培养16天,免疫荧光细胞染色法检测细胞IV型胶原的表达,QRT-PCR检测细胞α-酪蛋白(α-casein)mRNA表达。　　结果：培养后14天,实验组诱导后的细胞形态转变为上皮样的圆形,Westernblot检测上皮细胞抗原标志物ZO1和CK18表达增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05)。诱导分化后的细胞体外三维培养16天后,细胞形成清晰的立体状团块样结构,类似于体内正常的腺泡和导管结构。免疫荧光细胞染色法检测细胞IV型胶原呈阳性表达,QRT-PCR检测实验组细胞α-caseinmRNA表达水平上调。　　结论：使用来自人正常乳腺上皮细胞株(HBL-100)的条件培养基可成功诱导人脂肪干细胞向乳腺上皮细胞分化。
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胰岛素对2型糖尿病状态下脂肪细胞色素上皮衍生因子表达的影响
目的 探讨胰岛素治疗对2型糖尿病状态下脂肪细胞的色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响.方法 对22例初诊2型糖尿病患者进行为期2周的胰岛素强化治疗,分析比较其治疗前后空腹血糖、血甘油三酯及PEDF水平变化.对8周龄雄性SD大鼠进行高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素诱导,建立2型糖尿病大鼠模型,随机数字表法分为糖尿病组、胰岛素治疗组、格列齐特治疗组,另设正常饮食对照组.分化成脂的3T3-L1脂肪细胞加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和(或)胰岛素干预24h.用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western印迹)检测脂肪组织或细胞PEDF表达水平,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清或脂肪细胞培养液上清中PEDF的含量.将3T3-L1脂肪细胞分为对照组、PEDF处理组、抗PEDF抗体处理组,测定各组脂肪细胞对3H-葡萄糖的摄取率.结果 2型糖尿病患者胰岛素治疗后,空腹血糖与血甘油三酯均显著下降[(12.9&#177;2.8)与(5.9&#177;1.4) mmol/L、(3.1&#177;1.8)与(1.7&#177;0.8) mmol/L,P＜0.05],并有血清PEDF水平明显降低[(22.85&#177;5.73)与(18.38&#177;5.28) mg/L,P＜0.05].糖尿病大鼠血清PEDF水平高于对照组和胰岛素治疗组[(28.6&#177;0.5)、(25.4&#177;0.6)、(25.3&#177;0.6) μg/L,P＜0.05],并伴有脂肪组织PEDF、TNF-α的mRNA及蛋白表达升高(P＜0.05),胰岛素治疗后上述指标均下降(P＜0.05),但在格列齐特组并无明显改善.进一步实验发现,TNF-α诱导3T3-L1脂肪细胞PEDF表达及分泌增多(P＜0.05),而该作用可被胰岛素减弱(P＜0.05).此外,PEDF下调3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取率的作用可被抗PEDF抗体拮抗(P＜0.05).结论 胰岛素可下调2型糖尿病状态下脂肪细胞及血清中PEDF的表达,改善脂肪细胞的葡萄糖摄取率,这可能是胰岛素治疗改善胰岛素抵抗的机制之一.
Abstract：
Objective To explore the effects of insulin therapy on the expression of pigment epithelium-derived factor (PEDF) in adipocytes of type 2 diabetic mellitus (T2DM) in rats.Methods A total of 22 newly diagnosed type 2 diabetics received a 2-week intensive insulin therapy.The levels of fasting plasma glucose (FPG),serum triglyceride and PEDF were measured before and after therapy.T2DM was induced by a high-fat diet and a low-dose streptozotocin (STZ).The Spraque-Dawley rats were divided randomly into diabetic,insulin treatment and gliclazide treatment groups.Another group with a chow diet was designated as normal controls.Differentiated 3T3-L1 adipocytes were then incubated with tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and(or) insulin for 24 h.Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression of PEDF in adipose tissue or adipocytes.The PEDF levels in both sera and cell supernatant were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Glucose uptake was detected after treatment of PEDF or anti-PEDF antibody simultaneously together with insulin in mature 3T3-L1 adipocytes.Results Insulin therapy decreased the serum levels of FPG and triglyceride of T2DM patients ((12.9 &#177; 2.8) vs(5.9 &#177; 1.4) mmol/L,(3.1 &#177; 1.8) vs(1.7 &#177;0.8) mmol/L,P ＜ 0.05) while the serum level of PEDF decreased significantly after therapy ((22.85 &#177;5.73) vs (18.38 &#177; 5.28) μg/L,P ＜ 0.05).Consistently the serum level of PEDF of diabetic rats was remarkably higher than that of normal controls and insulin-treated group ((28.6 &#177; 0.5) vs (25.4 &#177; 0.6)and (25.3 &#177;0.6) μg/L,P ＜ 0.05).And the elevated levels of PEDF,TNF-α mRNA and protein in adipose tissue (P ＜ 0.05) could be reduced by insulin treatment (P ＜ 0.05).However,no obvious change was detected in gliclazide treatment group.Further evidences suggested that TNF-α could induce more secretion and expression of PEDF in 3T3-L1 adipocyte while this effect became ameliorated by insulin treatment.Furthermore,decreased capacity of glucose uptake by PEDF might be reversed by anti-PEDF antibody in 3T3-L1 adipocytes (P ＜ 0.05).Conclusions Insulin can down-regulate the expression of PEDF in adipocytes of T2DM and improve the glucose uptake of adipocytes.It may be one of the mechanisms through which insulin therapy improves peripheral insulin resistance.
Zhou Yinli
Deng Hongrong
作者单位：
中山大学附属第三医院内分泌与代谢病学科广东省糖尿病防治重点实验室,广州,510630
南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科
年，卷(期)：
Keywords：
在线出版日期：
基金项目：
国家自然科学基金青年基金，广东省自然科学基金，中央高校基本科研业务费专项资金，南京市医学重点科技发展项目
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β－羟丁酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂肪合成及其相关基因相对表达量的影响
本试验主要研究了不同浓度的β－羟丁酸（ BHBA）对奶牛乳腺上皮细胞（ BMECs）活力、甘油三酯（ TAG）含量、脂滴形成以及乳脂肪合成相关基因转录水平的影响。将传至第3代的BMECs悬液（1&#215;105个／孔）接种于细胞培养板上，每孔加入含10％胎牛血清（ FBS）的DMEM／F12培养液，于37℃的5％二氧化碳（CO2）培养箱培养48 h。再将培养48 h的BMECs随机分配到6个组，各组向培养孔中加入含不同浓度BHBA的DMEM／F12培养液，培养液中的FBS用1 g／L无脂肪酸的牛血清白蛋白（ BSA）代替，并使反应体系中BHBA的最终浓度分别为0（对照）、0．58、1．16、2．32、4．64和9．28 mmol／L。置于37℃的5％CO2培养箱继续培养48 h。试验结果显示：随着BHBA浓度的增加，BMECs活力[（相对增殖率（ RGR）]呈显著的二次曲线增加（P＝0．041），其中BMECs活力以0．58～4．64 mmol／L BHBA组较高，9．28 mmol／L BHBA组较低；低浓度（0．58～2．32 mmol／L）的 BHBA 可促进 BMECs 内脂滴的形成，而较高浓度（4．64～9．28 mmol／L）的BHBA对脂滴形成的促进作用减弱；BHBA与TAG含量及乳脂肪合成相关基因脂肪酸合成酶（ FASN ）、乙酰辅酶 A 羧化酶α（ ACACA ）、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（ SCD）、脂肪酸结合蛋白3（ FABP3）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ PPARG）和分化抗原簇36（CD36）的相对表达量均无显著的一次线性或二次曲线关系（P＞0．05）。综上，BHBA 对BMECs活力的促进作用呈显著的二次曲线增加，即BHBA对BMECs活力呈显著浓度依赖关系；BHBA对细胞内乳脂肪的合成有提高的趋势。
作者单位：
内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018
年，卷(期)：
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学年七年级(下)期中生物试卷调研报告.doc21页
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学年云南省保山市腾冲八中七年级（下）期中生物试卷
一．选择题（每题2分，共60分）
1． 现代人猿和人类共同起源于（　　）
　 A． 森林古猿 B． 猕猴 C． 猩猩 D． 长臂猿
2． 就青春期开始的年龄来说（　　）
　 A． 男孩和女孩同步 B． 男孩比女孩早两年
　 C． 没有明显的规律 D． 男孩比女孩晚两年
3． 人一生中身体和智力发展的黄金时期是（　　）
　 A． 童年时期 B． 幼儿时期 C． 青春期 D． 成年期
4． 男性的主要生殖器官是（　　）
　 A． 睾丸 B． 输精管 C． 附睾 D． 精囊腺
5． 受精作用发生在（　　）
　 A． 卵巢 B． 输卵管 C． 子宫 D． 盆腔
6． 女性卵巢的作用是（　　）
　 A． 受精作用发生的场所 B． 输送卵细胞
　 C． 胚胎发育的场所 D． 产生卵细胞和雌性激素
7． 胚胎大约在母体子宫中发育（　　）天就发育成熟．
　 A． 280天 B． 360天 C． 300天 D． 266天
8． 人的生命是宝贵的，你知道新生命的起点是从哪里开始？（　　）
　 A． 卵细胞 B． 精子 C． 受精卵 D． 婴儿出生
9． 下列叙述中，错误的一项是（　　）
　 A． 每日三餐要按时进餐，晚餐不能吃太饱
　 B． 已变质的食物不能食用
　 C． 饭后不宜进行剧烈的体育锻炼，会抑制消化功能
　 D． 鲜艳的蘑菇都含有毒的物质
10． “绿色食品”指的是（　　）
　 A． 富含叶绿素的食品 B． 新鲜的蔬菜
　 C． 无污染，安全，优质的食品 D． 贴有“绿色”防伪标记的食品
11． 吃饭时不能说笑的原因是（　　）
　 A． 流经消化器官的血流量减少 B． 肺内压小于大气压
　 C． 消化腺的分泌能力下降 D． 食物易从咽误入气管
12． 学生的早、午、晚三餐摄入的热量比例，比较符合健康要求的是（　　）
正在加载中，请稍后...人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞隔离共培养后向尿路上皮样细胞分化--《中华临床医师杂志(电子版)》2012年08期
人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞隔离共培养后向尿路上皮样细胞分化
【摘要】：目的研究人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞体外隔离共培养后向尿路上皮样细胞转化的可行性。方法从人抽脂术后脂肪组织中提取脂肪干细胞,同时从猪膀胱中获取尿路上皮细胞,两种细胞体外培养扩增后,通过"Trans-well"体系进行体外隔离共培养3周。倒置显微镜下观察脂肪干细胞形态变化。RT-RCP鉴定诱导后人脂肪干细胞中尿路上皮特异性标记Uroplakin-Ⅱ在基因水平的表达,免疫荧光鉴定AE1/AE3和Uroplakin-Ⅱ在蛋白水平的表达情况。结果人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞体外隔离共培养3周后,倒置显微镜可见细胞折光性变强,细胞触角缩短,依然保持良好的增殖状态,但未见典型的尿路上皮细胞"铺路石样"改变。免疫荧光发现AE1/AE3和Uroplakin-Ⅱ均有表达,RT-PCR检测发现Uroplakin-Ⅱ基因表达阳性。结论人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞隔离共培养后,可以表达成熟尿路上皮特异性标记,说明脂肪干细胞可以向尿路上皮样细胞分化。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R329【正文快照】：
临床上多种疾病可以导致膀胱结构缺损和功能障碍,如膀胱肿瘤、先天性畸形、神经源性膀胱、外伤等,都需要进行膀胱解剖结构重建和功能恢复。传统上常用胃肠道进行膀胱缺损的修复,虽然在一定时间内可以代替膀胱的功能,但是由于胃肠解剖结构与膀胱的差异,许多较严重的并发症不可
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