Blue&native&PAGE&(BN-PAGE)&can&be&used&for&one-step&isolation&of&protein&complexes&from&biological&membranes&and&total&cell&and&tissue&homogenates.&It&can&also&be&used&to&determine&native&protein&masses&and&oligomeric&states&and&to&identify&physiological&protein–protein&interactions.&
Blue native PAGE (BN-PAGE) can be used for one-step isolation of protein complexes from biological membranes and total cell and tissue homogenates. It can also be used to determine native protein masses and oligomeric states and to identify physiological protein&protein interactions. Native complexes are recovered from gels by electroelution or diffusion and are used for 2D crystallization and electron microscopy or analyzed by in-gel activity assays or by native electroblotting and immunodetection. In this protocol, we describe methodology to perform BN-PAGE followed by (i) native extraction or native electroblotting of separated proteins, or (ii) a second dimension of tricine--PAGE or modified BN-PAGE, or (iii) a second dimension of isoelectric focusing (IEF) followed by a third dimension of tricine--PAGE for the separation of subunits of complexes. These protocols for 2D and 3D PAGE can be completed in 2 and 3 days.
INTRODUCTION BN-PAGE was developed for the separation of mitochondrial membrane proteins and complexes in the mass range of 10 kDa to 10MDa1&3, as exemplified in Figure 1. It is used for the one-step isolation of microgram amounts of membrane protein complexes from biological membranes4&8 and total cell and tissue homogenates9& 13; for clinical diagnostics of human mitochondrial disorders10,11,13&15; to determine native masses and oligomeric states2,14&18; to determine the stoichiometry of a multiprotein complex by an antibody-based gel-shift method19; to identify physiological protein&protein interactions20&25; for 2D crystallization and electron microscopy26, in-gel activity assays27&30, native electroblotting and immunodetection15; for studies of neurotransmitter assembly31, protein import32,33 and apoptosis research9; to isolate supramolecular physiological protein assemblies15&25, and many more tasks. It is a convenient and inexpensive technique based on a few simple principles.
Nonionic detergents are used for solubilization of biological membranes. The choice of a specific nonionic detergent depends on the detergent stability of the protein complexes of interest. One of the mildest detergents is digitonin. It has been used to isolate supramolecular associations of multiprotein complexes, thus identifying physiological protein&protein interactions without using chemical crosslinking. Dodecylmaltoside has stronger delipidating properties compared to digitonin. It is a mild neutral detergent that is suited for isolation of membrane proteins and inpidual complexes but commonly dissociates labile hydrophobic interactions. Triton X-100 shows intermediate behavior with mitochondrial protein complexes. Under high-detergent conditions, it solubilizes membrane protein complexes, similar to dodecylmaltoside21. Under low-detergent conditions, it preserves respiratory supercomplexes21 and dimeric ATP synthase20, similar to digitonin.
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Tris-Gly Native-PAGE预制胶
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Tris-Gly Native-PAGE预制胶是进行垂直电泳的理想选择，使用标准Tris-glycine电泳缓冲液可获得与传统Laemmli类似的分离模式。
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Tris-Gly Native-PAGE预制胶 Tris-Gly Native-PAGE预制胶是进行垂直电泳的理想选择，使用标准Tris-glycine电泳缓冲液可获得与传统Laemmli类似的分离模式。特点和优势&Tris-Gly Native-PAGE预制胶提供可重复、高分辨率的结果&快速组装、上样和运行&标记了外形和编码的上样孔，轻松地加样和标识样品&使用与Laemmli系统相同缓冲液，并可获得类似的条带分离模式&系统非常稳定，适合于分离复杂样品&在一天内完成双向电泳应用领域：&聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）&评估样品制备条件&准确的分子量计算使用蛋白迁移图选择合适的凝胶浓度，可确保样品具有最佳分辨Tris-Gly Native-PAGE预制胶产品订购信息：10孔（30ul）10孔（50ul）15孔8%NP-08NP-08-50NP-15-0810%NP-10NP-10-50NP-15-1012%NP-12NP-12-50NP-15-1215%NP-15NP-15-50NP-15-1518%NP-18NP-18-50NP-15-184-10%NP-4-10NP-4-10-50NP-15-4-104-12%NP-4-12NP-4-12-50NP-15-4-124-15%NP-4-15NP-4-15-50NP-15-4-154-18%NP-4-18NP-4-18-50NP-15-4-184-20%NP-4-20NP-4-20-50NP-15-4-208-12%NP-8-12NP-8-12-50NP-15-8-128-15%NP-8-15NP-8-15-50NP-15-8-158-18%NP-8-18NP-8-18-50NP-15-8-188-20%NP-8-20NP-8-20-50NP-15-8-2010-15%NP-10-15NP-10-15-50NP-15-10-1510-20%NP-10-20NP-10-20-50NP-15-10-20&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&系统变性预制胶Tris-Gly系统变性预制胶是进行垂直电泳的理想选择，使用标准Tris-glycine电泳缓冲液可获得与传统Laemmli类似的分离模式。特点和优势&提供可重复、高分辨率的结果&快速组装、上样和运行&标记了外形和编码的上样孔，轻松地加样和标识样品&系统非常稳定，适合于分离复杂样品&在一天内完成双向电泳 &Tris-Gly系统变性预制胶使用与Laemmli系统相同缓冲液，并可获得类似的条带分离模式 Tris-Gly系统变性预制胶常应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、2-D凝胶电泳分离、准确的分子量计算等方面。使用蛋白迁移图选择合适的凝胶浓度，可确保样品具有最佳分辨率。产品订购信息：规格10孔（30ul）10孔（50ul）15孔Well孔8%SDS-08SDS-08-50SDS-15-08SW0810%SDS-10SDS-10-50SDS-15-10SW1012%SDS-12SDS-12-50SDS-15-12SW1215%SDS-15SDS-15-50SDS-15-15SW1518%SDS-18SDS-18-50SDS-15-18SW184-10%SDS-4-10SDS-4-10-50SDS-15-4-10SW-4-104-12%SDS-4-12SDS-4-12-50SDS-15-4-12SW-4-124-15%SDS-4-15SDS-4-15-50SDS-15-4-15SW-4-154-18%SDS-4-18SDS-4-18-50SDS-15-4-18SW-4-184-20%SDS-4-20SDS-4-20-50SDS-15-4-20SW-4-208-12%SDS-8-12SDS-8-12-50SDS-15-8-12SW-8-128-15%SDS-8-15SDS-8-15-50SDS-15-8-15SW-8-158-18%SDS-8-18SDS-8-18-50SDS-15-8-18SW-8-188-20%SDS-8-20SDS-8-20-50SDS-15-8-20SW-8-2010-15%SDS-10-15SDS-10-15-50SDS-15-10-15SW-10-1510-20%SDS-10-20SDS-10-20-50SDS-15-10-15SW-10-20&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&高分辨率载体两性电解质 高分辨率载体两性电解质高分辨率载体两性电解质10ml25mlpH3-5CA-3-5CA-3-5SpH3-6CA-3-6CA-3-6SpH3-7CA-3-7CA-3-7SpH3-10CA-3-10CA-3-10SpH4-6CA-4-6CA-4-6SpH4-7CA-4-7CA-4-7SpH5-7CA-5-7CA-5-7SpH5-8CA-5-8CA-5-8SpH5-9CA-5-9CA-5-9SpH6-7CA-6-7CA-6-7SpH6-8CA-6-8CA-6-8SpH6-9CA-6-9CA-6-9SpH7-9CA-7-9CA-7-9SpH8-10CA-8-10CA-8-10S
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【求助】Native -page 胶浓度与蛋白大小的关系
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这个帖子发布于7年零22天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
想问各位：SDS-page胶浓度与蛋白大小有一定关系，跑Native-page的时候，配胶的浓度应该怎么确定？与蛋白大小或蛋白带电荷有关？？？谢谢！
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分子质量范围：30-200
分子质量范围 ：15-100 T=15
分子质量范围 ：10-50T=20
分子质量范围 ：2-5凝胶浓度T（c=5%） 分子质量范围（kDa）T=5
分子质量范围：60-700
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native page上蛋白质的迁移率与蛋白质的大小、形状和带电荷的多少有关，所以没有明确的法则，参考相关的文献吧。
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我也知道有关，但怎么初步确定呢？具体还不是很清楚？
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首先要查阅相关文献，对你的蛋白有一定的了解，比如结构特点，PI，大小等，然后根据其以上特点来选择缓冲液的pH，胶的浓度要保证你的蛋白能够进到胶孔里面，这方面网上有很多文献可供你参考。
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我最近也在做native page
想看目的蛋白（25kd）是否多聚化用12%和5%的时候
western检测有几条带，但是拖尾现象很严重我把转膜后的page胶去考染，发现在积层胶和分离胶交界处有很浓的蛋白，而且有长长的拖尾。今天我换了8%和4%的胶，发现转膜后丽春红染色就漂亮多了，整个pvdf上都有带出现。so，lz多试试几个浓度。希望有交流。
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我最近也在跑native page ，我用的是8%的，我的 目的蛋白是110kd的，可是老在分离胶的顶端。下不去了。，而且蛋白条带的两端比中间粗。还拖尾。我不知道是什么原因。你们有什么好的建议吗？
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谢谢楼上各位，我正准备摸索条件！
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我和说你的情况一模一样，不过目的蛋白25kd所以我现在也不知道到底是多聚化造成的 还是胶做的不好导致蛋白跑不下来。过两天上图看看。fmqzhenzhen wrote:我最近也在跑native page ，我用的是8%的，我的 目的蛋白是110kd的，可是老在分离胶的顶端。下不去了。，而且蛋白条带的两端比中间粗。还拖尾。我不知道是什么原因。你们有什么好的建议吗？
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分子质量范围 ：5-150请问c=2.6%,5%是什么意思啊？？？
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C是与总浓度有关的交联百分浓度。Hjerten教授在1962年引入以下两个公式，为各实验室所常用： T=a+b/m*100%
C=b/a+b*100%a是丙烯酰胺的克数（g）b是双丙烯酰胺的克数（g）m是缓冲液的或水的终体积（ml）
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