菊芋叶片化学成分分析及抑菌活性成分研究--《南京农业大学》2013年博士论文
菊芋叶片化学成分分析及抑菌活性成分研究
【摘要】：菊芋(Helianthus tuberosus L.)属于菊科(Compositae)向日葵属多年生草本植物,广泛的分布在我国大部分地区,是一种适应性极强,具有生态和经济双重价值的作物。菊芋广泛用于造纸业以及食品、药物、饲料、糖和酒精的工业生产。目前菊芋产品的开发多是利用块茎和茎秆,而在我国多数菊芋叶片未能得到开发和利用,同时也加重了环境污染和资源浪费。由于菊芋地上部分具有抗逆性强,极少病虫害的特点,引起了人们对其化学成分及生物活性的关注。本文对菊芋叶片中抑菌活性成分进行了系统性研究,并开发其防治植物病害的新应用。这对于有效利用和开发菊芋这一自然资源具有重要的意义。本文主要研究结果如下：
1.菊芋叶片化学成分中,总糖和总蛋白含量比总酚和总黄酮要高的多。南芋叶片中各成分含量除总黄酮差异不明显外,总糖、总蛋白和总酚均显著高于野生型和青芋。花期是菊芋叶片各化学成分积累的重要时期,总酚、总黄酮、总糖和总蛋白含量均显著高于现蕾期和块茎膨大期。菊芋叶片中水解氨基酸的总含量,可达叶片干重的12.445%,其中脯氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸为菊芋叶片中氨基酸的主要组成成分。游离氨基酸中脯氨酸含量最高。
2.本文分析并鉴定了菊芋叶片中的酚类物质,有10种属于绿原酸类(CGAs)化合物,包括3种绿原酸异构体、4种二咖啡酰奎尼酸异构体、咖啡酸、P-香豆酰奎尼酸、阿魏酰奎尼酸,还有4种其他化合物,分别是异鼠李素-O-葡萄糖苷、咖啡酰葡萄糖、山奈酚葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷。本文研究发现在所有菊芋品种中咖啡酸的含量最低,绿原酸与4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量最高。南芋叶片各酚酸类物质的含量显著高于野生型和青芋,因此南芋品种可作为酚酸类物质开发和利用的重要资源。以南芋为例,花期的各种酚酸含量普遍高于现蕾期和块茎膨大期,且差异极显著。
3.本文采取的乙醇减压回流法作为抑菌活性物质的提取方法,具有提取效率高、抑菌效果好以及对环境友好等的优点,适合大规模生产的需要。减压回流法所得提取物浸膏的总酚和总黄酮含量显著高于回流法和室温浸提法,绿原酸含量也显著高于其他两种方法。乙酸乙酯层浸膏总酚和总黄酮含量最高,分别可达306.38mg/g和97.33mg/g,这说明菊芋叶片中的黄酮类和酚类物质属于极性中等偏大的活性成分。正丁醇层浸膏的绿原酸含量最高可达76.09mg/g,占6种酚酸总含量的55.70%。乙酸乙酯层浸膏中除绿原酸外的其他酚酸含量均为最高。
4.菊芋叶片乙醇粗提物(减压回流法)具有广泛的抑菌谱,可以用于多种植物病害的防治。尤其对半知菌亚门的番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌、小麦纹枯菌和鞭毛菌亚门的辣椒疫霉病菌的抑制效果较好,在供试浓度10g.L-1下,抑制率分别可达98.22%、89.77%、74.62%和87.85%。石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇浸膏对四种植物病原真菌均有一定的抑制效果。氯仿层对辣椒疫霉病菌的抑制效果最好,EC50值仅为0.875g.L-1；乙酸乙酯层对小麦纹枯病菌的抑制效果最好,EC50值仅为0.300g.L-1；正丁醇层对小麦纹枯病菌的抑制效果最好,EC50值仅为0.232g.L-1,对辣椒疫霉病菌的抑制效果次之,ECs0值为0.839g.L-1。菊芋叶片浸膏用于番茄灰霉病的防治,在有效浓度相同的情况下,与商品化的杀菌剂多菌灵的防效相当,且差异不显著,安全无公害。因此开发菊芋叶片作为果蔬保鲜剂,对于菊芋资源的综合利用具有重要意义。
5.结合生物活性追踪试验,包括生长速率法和生物自显影法,筛选菊芋叶片中抑菌活性较好的正丁醇层中活性物质,通过柱层析(AB-8柱、聚酰胺柱、ODS柱、Toyopearl HW-40凝胶柱)和制备液相色谱分离得到10种化合物,通过HPLC-ESI-MS、1H-NMR结合化学性质和标准品对照,鉴定了6种化合物为已知酚酸类物质,分别是绿原酸、咖啡酸和4种二咖啡酰奎宁酸的同分异构体。
6.咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸和1,5-二咖啡酰奎宁酸能有效的抑制小麦赤霉病菌的生长,MIC值分别可达108、60和4.2μgmL-1。总酚含量与各粗提物对辣椒疫霉病菌和小麦纹枯病菌的EC50呈现明显的负相关性,咖啡酸的含量同各粗提物对小麦纹枯病菌的EC50值呈显著负相关性,咖啡酸和1,5-二咖啡酰奎宁酸含量同各粗提物对辣椒疫霉病菌的EC50值呈现显著的负相关性,推测菊芋叶片中这些酚酸类抑菌物质可能单独、也可能协同抑制植物病原真菌。氯仿层萃取物和正丁醇层萃取物处理的辣椒疫霉病菌菌丝形态和细胞超微结构发生一些变化：菌丝凹陷,局部断裂或者出现裂纹,生长点异常；菌丝体细胞壁显著增厚,出现质壁分离,氯仿层萃取物处理还能使菌丝细胞器大量降解。
通过本文的研究将菊芋叶片提取物应用于防治植物病害,不仅从废物利用的角度,大大提高了菊芋产业的经济附加值,而且开拓了植物源农药的新用途及新思路,具有十分重要的研究价值。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：S482.292【目录】：
摘要7-9ABSTRACT9-12缩略词12-13第一章 文献综述13-37 1.1 植物源杀菌剂的研究概况13-31
1.1.1 植物源杀菌剂的研究进展13-20
1.1.2 植物源有效成分提取、分离与结构鉴定20
1.1.3 杀菌剂生物测定技术研究进展20-21
1.1.4 植物中抑菌活性成分21-30
1.1.5 植物源杀菌剂抑菌机理的研究进展30
1.1.6 植物源杀菌剂的应用研究30
1.1.7 植物源杀菌活性物质构效关系研究30-31 1.2 菊科向日葵属化学成分及其生物活性31-32 1.3 菊芋化学成分及抑菌活性研究32-34 1.4 研究内容与意义34-37第二章 菊芋叶片中主要化学成分含量测定37-51 2.1 材料与方法37-41
2.1.1 试验材料37
2.1.2 试剂37-38
2.1.3 主要仪器与设备38
2.1.4 菊芋叶片中总酚含量测定38-39
2.1.5 菊芋叶片中总黄酮含量测定39
2.1.6 菊芋叶片中总糖含量的测定39-40
2.1.7 菊芋叶片中总蛋白含量的测定40
2.1.8 菊芋叶片中氨基酸分析40-41
2.1.9 数据处理与分析41 2.2 结果与分析41-47
2.2.1 菊芋叶片中总酚含量分析条件的建立41-43
2.2.2 菊芋叶片中的总黄酮含量测定43
2.2.3 菊芋叶片中总糖含量测定43
2.2.4 菊芋叶片中总蛋白含量测定43-44
2.2.5 菊芋叶片中游离和水解氨基酸成分分析44-45
2.2.6 不同菊芋品种及不同生长期各种成分含量比较45-47 2.3 讨论47-49 2.4 本章小结49-51第三章 菊芋叶片中主要酚类物质的LC-MS和HPLC分析51-69 3.1 材料与方法51-54
3.1.1 试验材料51-52
3.1.2 试剂52
3.1.3 主要仪器与设备52
3.1.4 酚类提取液的制备52
3.1.5 酚类物质的液质联用(LC-MS)分析52-53
3.1.6 紫外扫描图谱(UV)和紫外检测波长的确定53
3.1.7 菊芋叶片中主要酚类物质的高效液相色谱分析53
3.1.8 数据处理与分析53-54 3.2 结果与分析54-66
3.2.1 菊芋叶片中主要酚类物质的LC-MS分析54-62
3.2.2 菊芋叶片中主要酚酸类物质的HPLC研究62-66 3.3 讨论66-68 3.4 本章小结68-69第四章 菊芋叶片粗提物抑菌活性研究69-87 4.1 材料与方法69-73
4.1.1 试验材料69
4.1.2 试剂69
4.1.3 主要仪器与设备69-70
4.1.4 供试菌种70
4.1.5 菊芋叶片提取物制备方法70-71
4.1.6 抑菌活性试验71-72
4.1.7 提取溶剂及方法的选择72
4.1.8 数据处理方法72-73 4.2 结果与分析73-83
4.2.1 菊芋叶片活性物质提取方法的研究73-74
4.2.2 菊芋叶片提取物对植物病原真菌的抑制活性试验74-80
4.2.3 菊芋叶片提取物对番茄灰霉病的防治试验80-81
4.2.4 粗提物及各萃取层浸膏的化学成分含量分析81-83 4.3 讨论83-85 4.4 本章小结85-87第五章 抑菌成分的分离与结构鉴定87-109 5.1 材料与方法87-89
5.1.1 试验材料87
5.1.2 试验仪器87
5.1.3 主要试剂87
5.1.4 菊芋叶片抑菌活性物质分离与纯化87-88
5.1.5 菊芋叶片抑菌活性单体的结构鉴定88-89
5.1.6 数据处理与分析89 5.2 结果与分析89-106
5.2.1 菊芋叶片抑菌活性物质的分离纯化路线89-93
5.2.2 各单体化合物的结构鉴定93-106 5.3 讨论106-107 5.4 本章小结107-109第六章 菊芋叶片活性物质抑菌作用及初步机理研究109-119 6.1 材料与方法109-111
6.1.1 试验材料与试剂109
6.1.2 生物活性测定109-110
6.1.3 菊芋叶片活性物质抑制辣椒疫霉病菌的初步机理研究110
6.1.4 数据处理与分析110-111 6.2 结果与分析111-115
6.2.1 单体化合物的抑菌活性111-112
6.2.2 各类物质与抑菌效果相关性分析112
6.2.3 菊芋叶片活性物质对辣椒疫霉病菌菌丝形态的影响112-114
6.2.4 菊芋叶片活性物质对辣椒疫霉病菌菌丝体细胞超微结构的影响114-115 6.3 讨论115-117 6.4 本章小结117-119第七章 全文总结119-121展望121-123创新点123-125附录125-129附图129-137参考文献137-157攻读博士期间已(拟)发表的论文目录157-159致谢159-160
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Rapsyn抑制神经肌肉接头部位Calpain的活性
神经肌肉接头突触形成过程受到两种信号分子的作用：其一是agrin，通过其下游MuSK/rapsyn通路诱导乙酰胆碱受体(AChR)聚集:其二是乙酰胆碱(ACh)，通过激活Cdk5促使已形成的AChR聚集体消散。两种作用相互拮抗的最终结果使突触后膜AChR聚集，突触以外部分AChR聚集体解体。但是，目前对agrin和ACh相互拮抗的分子机制仍不清楚。
本研究揭示了calpain与rapsyn的相互作用住神经肌肉接头突触后分化中的作用。发现钙依赖蛋白酶calpain能够被胆碱能激动剂激活，并且参与Cdk5介导的乙酰胆碱受体聚集体的消散过程。用calpain的抑制剂或siRNA处理肌细胞，能够稳定AChR聚集。另一方面，与AChR结合在一起的agrin的下游信号分子一偶联蛋白rapsyn也能与calpain结合并抑制其活性，这种相互作用受到agrin的调节。下调rapsyn的表达能提高calpain的活性。通过转基因技术使agrin基因突变小鼠的肌肉组织特异地过量表达calpain的内源性抑制剂calpastatin可以挽救agrin突变小鼠的表型，减少AChR聚集体的消敞。这些结果显示calpain参与了ACh诱导的AChR聚集体的消散过程，而agrin通过rapsyn抑制calpain的活性，稳定AChR聚集。
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常见症状和体征
◆历年考点： 1、发热病因多由病毒引起。2、稽留热24h内体温波动范围不超过1℃，常见于大叶性肺炎、伤寒。3、弛张热24h内体温波动范围超过2℃，常见于败血症、风湿热。4、病程少于2周者为急性发热，主要由感染引起，2周以上体温超过38℃为长期发热，体温在38℃以内的非生理性发热，持续1个月以上为慢性发热。
一、正常体温与生理变异：正常人体温36～37℃。但应注意：①下午较上午略高；②精神紧张、剧烈运动、劳动或进餐后体温也可略升高，但波动范围不超过1℃。③妇女月经前及妊娠初期体温略高；④高热环境中，体温略升高；⑤老年人体温略低。
二、发生机制 （熟悉）
（一）致热源性发热
1、外源性致热源:⑴多为大分子物质，特别是细菌内毒素，包括：①各种微生物病原体及其产物；如细菌、病毒、真菌及细菌毒素等；②炎性渗出物及无菌性坏死组织；③抗原抗体复合物；④某些类固醇物质，特别是肾上腺皮质激素的代谢产物原胆烷醇酮；⑤多糖体成分及多核苷酸、淋巴细胞激活因子等。
⑵分子大，不能通过血－脑屏障；通过激活血液中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核一吞噬细胞系统，使其产生并释放内源性致热源。内毒素是外源性致热源。
2、内源性致热源：由白细胞产生，如白介素（IL－1、6）、肿瘤因子（TNF）和干扰素，（种干白）通过血－脑屏障直接作用体温调节中枢，通过骨骼肌阵缩（临床表现为寒战），使产热增多。可通过交感神经使皮肤血管及竖毛肌收缩，停止排汗，散热减少。综合调节作用使产热大于散热，体温升高引起发热。
（二）非致热源性发热
①体温调节中枢受损―颅脑损伤、出血、炎症。
②引起产热过多
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