如何减少蛋白缓冲液在缓冲液中的溶解量

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-19 08:09 标签： 蛋白电泳缓冲液配方
盐析蛋白质怎么溶解?
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盐析向蛋白质溶液中假如高浓度的中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象,叫做盐析.原理:破坏了蛋白质在水中存在的两个因素(水化层和电荷),从而使蛋白质沉淀.中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶； 盐溶在蛋白质水溶液中,加入少量的中性盐[即稀浓度],如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大.这种现象称为盐溶.稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用.同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔/升浓度为宜.缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液.当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析.将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀.影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外,一般可在室温中进行.一般温度低蛋白质溶解度降低.但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低,更容易盐析.（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低.（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）.因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%.蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等.其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升）,在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性.硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸）,用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行.此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短.变性 能使蛋白质变性的化学方法有加强酸,强碱,重金属盐,尿素,乙醇,丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热,紫外线照射,剧烈振荡等.重金属盐使蛋白质变性,是因为重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐,在变性过程中有化学键的断裂和生成,因此是一个化学变化.强酸、强碱使蛋白质变性,是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂.也可以和游离的氨基或羧基形成盐,在变化过程中也有化学键的断裂和生成,因此,可以看作是一个化学变化.尿素、乙醇、丙酮等,它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键,从而破坏了蛋白质中原有的氢键,使蛋白质变性.但氢键不是化学键,因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成,所以是一个物理变化.加热、紫外线照射,剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性,主要是破坏了蛋白质分子中的氢键,在变化过程中也没有化学键的断裂和生成,没有新物质生成,因此是物理变化.否则,鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了.
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免疫沉淀中常见问题及解答
1. 用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验？&答：抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同，和抗原以及Protein G或Protein A的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。 一般来说，多抗是沉淀反应最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。2. 为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂？&答：从活性细胞裂解出来的样品中，往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，并且在低温下进行实验。3. 溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么？&答：多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱表面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合。4. 免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例？&答：每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清；缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。
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【求助】SDS-PAGE上样缓冲液配方？
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我前面配的5×上样缓冲液，总觉得不对。可否告诉我5×上样缓冲液、2×上样缓冲液的配方、步骤、称量溶解样品顺序？？具体到什么时候调PH、什么时候加热溶解SDS、什么时候加溴芬兰、什么时候加以及如何称量和加甘油？？
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这是我用的SDS-PAGE电泳制胶及上样缓冲液配方，看看吧。上样缓冲液配制无所谓顺序，pH我们通常也不调节，我本人还偏爱那种低pH的红色上样缓冲液，一加蛋白样品后就变为蓝色（pH上升了），很明显区分是否加过蛋白样。
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我还见过，比skykiller 更简洁的方法，直接把胶，Tris, SDS加一起，只用新加APS和TEMED就OK了:):):):):):):):):):):)
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hollyblue_uab edited on
配制5×loading buffer后，需要过滤吗？？？？
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5*loading buffer配方：1mol/L Tris-HCl PH=6.8
2.5ML10%SDS
2ML2-巯基乙醇
0.5ML溴酚蓝
0.01gddH2O
4.4ML共10ML，分装不用过滤
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我是买Huh7和HepG2的那位，消息额已经用完了，所以发你这里了。你ATCC来源的那种传代周期是多少？那种梭形的HepG2就不要了，状态不好使因为聚集生长太严重还是其他。两种细胞发下我形态，具体我看下行不行？。要不先加我微信号：flexible4898.
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