磷酸化组蛋白磷酸化的wb时为什么是不能使用pbst

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-19 09:24 标签： 蛋白质磷酸化位点预测
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WB检测磷酸化蛋白时的样品提取
1、WB检测磷酸化蛋白时必须要加入磷酸酶抑制剂吗？
2、WB检测磷酸化蛋白时的蛋白上样量一般为多少？
3、WB检测磷酸化蛋白时的蛋白提取过程，一般直接加入裂解液到培养板上嘛？还是先收集再加入裂解液（贴壁细胞）？
最近做蛋白的磷酸化检测，总是检测不到，非磷酸化的及内参可以检测到，比如探测CDC25的磷酸化，一般处理后多长时间提取蛋白？
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WB检测方法及常见问题分析 艾碧康生物市场部
钟兴兰 主要内容 WB的基本操作过程和注意事项 WB需要的主要试剂 WB的常见问题及分析 WB基本操作和注意事项 Western Blotting简介 1、标本提取 确定电泳条件 根据待测蛋白状态确定电泳条件： 确定电泳的凝胶浓度
分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF，硝酸纤维素或尼龙膜）
选择合适的膜 WB实验原则 设置合适的对照： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参对照：检测标本的质量和二抗系统、进行半定量 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 Western Blot 需要的主要试剂 WB需要试剂－膜 常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜 WB需要试剂－封闭试剂 BSA或者脱脂奶粉
商业化的封闭试剂：如abcam的Protein Block （ab64226） WB需要试剂－一抗 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例 WB需要的试剂－内参 内参的选择 杂交需要试剂－二抗 二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。
二抗的使用： 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:00）。 孵育条件一般为室温1-2小时。
杂交需要试剂－底物 显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成
正在加载中，请稍后...TBST PBST 有什么不同？thx~_百度知道
TBST PBST 有什么不同？thx~
提问者采纳
具体用哪种得看你所研究的是蛋白的哪种功能。PBST的磷酸缓冲液加Tween-20。两种洗液我都用在做磷酸化蛋白的WB时是不能使用PBST的，PBST中也有磷酸基团，加上吐温20有助于蛋白的洗脱，用起来没有什么区别，原因很简单，如研究某种酶的催化作用，而TBST是Tris缓冲液加Tween-20，都是提供一个缓冲的PH值环境，PBST可能会对酶产生抑制作用
提问者评价
这……还是谢谢了……
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做WB总是出现非特异性背景，用牛血清白蛋白是否可以降低背景，该如何配封闭液，还要加奶粉或者别的试剂吗？
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是总出现非特异条带
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我们都是用5%脱脂牛奶封闭的.效果还可以.而且一抗二抗也是溶解在牛奶里.
配方是:5g脱脂奶粉/100mlTBST.
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用牛奶封闭背景肯定比BSA干净得多，因为牛奶中蛋白种类更丰富，更有利于封闭，你说背景深可能是封闭或洗涤条件没摸好，我们的封闭条件：
5%牛奶 in PBS 4度封闭过夜，特别注意封闭时间要足够长，我们做过37度封闭2个小时效果都没4度过夜好，所以强烈推荐4度过夜
一抗和二抗在2.5%牛奶 in PBS（in PBST中亦可，但是要注意TWeen得量）中孵育。
除了封闭洗涤也是很关键，一般来说只要是特异结合是不容易洗掉的，我们一般一抗用PBST（0.05%-0.1%）洗六次，每次5min，脱色摇床上充分震荡
二抗用PBST（0.05%-0.1%）洗6次，再用PBS洗两次，同上
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出现非特异性背景一般不是blocking的问题, 5%milk, 3%BSA室温一小时效果差不多.应该检测一抗二抗浓度是否过高,另外可增加洗涤次数,时间,TBS可加1%Tween20.
除非是磷酸化的抗体最好用BSA.
Block the membrane in 5% w/v BSA (fractionV) NOT MILK (milk contains casein which This is why it causes high background because the phospho-specific antibody detects the casein present in the milk).
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我用5％ bsa（in TBS）室温1h，做pERK实验挺好的，供参考。注意用TBS溶BSA，比TBST（TBS＋0.1% Tween）封闭效果好。
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注意封闭用的BSA不是全BSA蛋白,而是BSA Fraction V.
不过如果你的一抗是单抗,推荐使用脱脂奶粉封闭,因为这个封闭效果比BSA效果好.
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在western blotting中，蛋白提取试剂RIPA buffer 蛋白裂解液中的去氧胆酸钠的作用是什么？如果没有去氧胆酸钠，是否可以？多谢！！
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你做p-erk 上样量是多少啊？我用的是cell signal的抗体上样量要求比较大60－80ug，做的效果还不好呢！能指教一下是怎么回事吗？
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不好意思回家过年了。我用的是santa－cruz的pERK抗体（1：500），cos-7,12孔板（70－80汇合度，～4×10e5 cells/well）每孔加150ul裂解液裂细胞，离心后取120ul上清加30ul 5×loading，60ul上样，你自己算算大概多少吧。关注今日：3 | 主题：380412
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【求助】请教一下WB胶片的问题
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这个帖子发布于3年零292天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请各位大侠帮帮忙，最近几次做WB显影的时候，加ECL后膜上能看到荧光，但是压片后显影什么都没有，一开始怀疑是显影液的问题，然后重新配制了，但是问题还是没解决，现在怀疑是胶片的问题。我看了一下胶片的保质期，已经过期了，但是前几次使用都没有问题。我看了一下显影后的胶片，在暗室里红灯下是透明的，但是开灯后看又是不透明的了。请问一下是不是因为胶片过期或曝光了导致这样的结果呢？谢谢各位了！
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胶片不见光。过期半年都没问题。我用我师兄剩下的国产的和柯达的都没问题。胶片曝光显影后是黑色的。只要是显影后是透明的就没问题。应该是荧光很快淬灭了，把隔离膜的塑料换一下，因为污染可以迅速消耗掉发光液，或者把二抗浓度降低，过强的二抗也能迅速消耗掉发光液。如果确实看到条带，荧光淬灭可以用TBST(PBST)洗膜后重孵二抗，再次发光看一下。
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不是胶片问题，是你显影技术不好。 荧光信号淬灭了。
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可是我整个曝光过程中都能看到荧光，也是荧光淬灭了吗？今天我又做了，还是一样的结果。今天还用双色红外成像系统做了，结果更可怜，上面什么都没有，我把图传上来，大神们帮我想想办法吧！谢谢了！另外，请问如果是荧光淬灭的原因，有哪些办法解决呢？
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我也同样的情况 尊悲剧 那胶片就跟曝光似的
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