考马斯亮蓝测蛋白质方法
测蛋白质方法
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，
考马斯亮蓝测蛋白质原理：
考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下
1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
材料、仪器设备及试剂
小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料
2、仪器设备
分光光度计、研钵、烧杯、移液管
（1）标准蛋白质溶液：100μg·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
考马斯亮蓝测蛋白质方法：
1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质
浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。
（2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝
G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
（3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/(1000VS·WF)
（参考文献：郝建军，康宗利，于洋，植物生理学实验技术，北京：化学工业出版社，7-109?）
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
（本文转自索莱宝：
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总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）
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总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）Total protein quantitative assay kit【测定意义】总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）是一种氧化能力很强的自由基,其性质很活泼，氧化各种有机物和无机物的反应速率极快,是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的主要因素,与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬能力有关。【测试方法】化学比色法。本试剂盒既可以观察机体的抗氧化能力强弱（测定血清/浆、组织及体液等）以及观察植物组织的氧合作用，并且可用于体外筛选抗活性氧效能强的食品、营养素、中草药、西药等。【所需仪器】秒表、恒温水浴箱等，可见光分光光度计/全自动/半自动生化分析仪/酶标仪(可用其中之一进行比色)。总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）存在于人体各组织器官中。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢，当机体各组织器官病变时，其组织器官本身的LDH要发生改变，并且可引起血液中LDH改变。LDH增高主要见于急性心肌梗塞、病毒性肝炎、肝硬化、肺梗塞、某些恶性肿瘤、骨骼肌病、有核红细胞骨髓内破坏（无效性造血）、白血病尤其是急性淋巴细胞型白血病、恶性贫血。在具有尿毒症的慢性肾病患者，血清LDH一般正常，经透析治疗后活性上升，可能与血清中LDH的抑制剂尿素、草酸盐被除去有关。总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）产品优点如下：1、快速简便：全程约2分钟，可测5例左右样本。2、稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效。3、再现性好：变异系数CV=1.4%。4、回收试验： X =98%。5、受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。6、测试面广：可以观察机体的抗氧化能力强弱（测定血清/血浆及体液等）以及观察植物组织的氧合作用，并且可用于体外筛选抗活性氧效能强的食品、营养素、中草药、西药等总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）所需仪器及自备试剂：1、分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为440nm）2、恒温水浴箱或气浴箱 （孵育温度为37℃）3、漩涡混匀器4、微量移液器总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法）相关产品如下：hz-E12034 中文名称：小鼠N端前脑钠素(NT-proBNP)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12035 中文名称：小鼠纤溶酶抗纤溶酶复合物(PAP)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse plasmin-antiplasmin complex,PAP ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12036 中文名称：小鼠凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse thrombin-antithrombin complex,TAT ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12037 中文名称：小鼠抗凝血酶受体(ATR)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse anti-thrombin receptor,ATR ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12038 中文名称：小鼠凝血酶受体(TR)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse thrombin receptor,TR ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12039 中文名称：小鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse cardiac troponin Ⅰ,cTn-Ⅰ ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12040 中文名称：小鼠磷酸肌醇3激酶(PI3K)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Phosphotylinosital 3 kinase,PI3K ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12041 中文名称：小鼠β内啡肽(β-EP)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Beta-Endorphin,β-EP ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12042 中文名称：小鼠缺血修饰白蛋白(IMA)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Ischemia Modified Albumin,IMA ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12043 中文名称：小鼠蛋白激酶B(PKB)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse protein kinase B,PKB ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12044 中文名称：小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse secretory immunoglobulin A,sIgA ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12045 中文名称：小鼠血红素氧合酶2(HO-2)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse heme oxygenase 2,HO-2 ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12046 中文名称：小鼠骨胶原交联(Cr)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Crosslaps,Cr ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12047 中文名称：小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse follicle-stimulating hormone,FSH ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12048 中文名称：小鼠Ⅰ型前胶原C末端肽(CⅠCP)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse cross-linked C-telopeptides of Type Ⅰ collagen,CⅠCP ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12049 中文名称：小鼠脱氧吡啶酚/脱氧吡啶啉(DPD)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse deoxypyridinoline,DPD ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12050 中文名称：小鼠吡啶交联物(PY)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse pyridinium crosslink/PyriLinks,PY ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12051 中文名称：小鼠骨桥素(OPN)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Osteopontin,OPN ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12052 中文名称：小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse adrencocorticotropic hormone,ACTH ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12053 中文名称：小鼠骨特异性碱性磷酸酶B(ALP-B)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Bone-specific Alkphase B,ALP-B ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12054 中文名称：小鼠转铁蛋白受体(TFR/CD71)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse transferrin receptor,TFR ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12055 中文名称：小鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胱抑素C(Cys-C)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Cystatin C,Cys-C ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12056 中文名称：小鼠第八因子相关抗原(FⅧAg)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Factor Ⅷ-related Antigen,FⅧAg ELISAkit 规格：48T/96Thz-E12057 中文名称：小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒 英文名称：Mouse Pyruvate Kinase,M2-PK ELISAkit 规格：48T/96T
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摘要 : 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝法的突出优点是：
(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g&为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。
试管1.5&15cm(&6)，试管架，移液管管0.5mL(&2);1mL(&2);5mL(&1);恒温
水浴;分光光度计。
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
标准蛋白溶液（mL）
0.15mol/L NaCl（mL）
考马斯亮蓝试剂（mL）
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
作者：青岚 点击：次
热门文章TOP应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量--《中国生物制品学杂志》2000年02期
应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量
【摘要】：目的　应用考马斯亮蓝法检测总蛋白含量。方法　应用考马斯亮蓝法与凯氏法和Ｌｏｗｒｙ法同时 进行不同生物制品的总蛋含量检测。结果　考马斯亮蓝法操作简便，灵敏度高，重复性好，测定蛋白的线性范围为 ５～２５ｕｇ，ｒ＝ ０．９９９５，ｎ＝５，平均回收率为１０１．３％。结论　考马斯亮蓝法是检测生物制品总蛋白含量的理想方法。
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
生物制品总蛋白含量的测定是制品质量控制的重要指标之一，可用以检查有效成分，计算纯度和比活性。目前常用的方法有凯氏法、酚试剂法（ｈｏ法）、紫外吸收法等，其中凯氏法繁琐，费时，且不适合微量蛋白含量测定。Ｉｎｗｒｒ法和紫外吸收法干扰物质较多，不适于硫柳汞做防
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京公网安备75号实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量_中华文本库
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实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一、实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法
2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明：
1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。 2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明：
1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：
（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250
0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％
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