pcr引物设计的3'端最多有多少个碱基不匹配

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-09-06 03:35 标签： rt pcr引物设计
PCR反应的引物有何种要求？_百度知道PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?如下图：可以的话,会对扩增有影响么?如果不可以,为什么?
可以在引物上添加不配对的碱基,但是在引物的3‘端,至少有三个碱基是严格配对的.但是这样的操作主要是为了添加酶切位点或者flag等.Tm值是根据两条链的退火情况来计算,不配对的碱基不算在内,所以你添加不配对的碱基对于Tm值几乎没有影响.保证长度--没有必要添加不配对的碱基.不产生二聚体--也没有必要,引物自身的碱基配对对于扩增影响不大,引物间的二聚体可以根据引物位置的选择来避免,无法避免时要保证3’端无配对.所以不建议添加不必要的碱基来设计引物.（某些干扰实验除外）
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我觉得不一定需要，但是不配对的碱基数量要尽可能的少，而且关键位置如酶切位点或是活性位点等要尽可能保守。
引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
引物上的碱基不是每一个都必须与模板链互补配对的，但是像你图上所示的那种设计是不行的，一般引物的5‘端可以完全不与模板一样，这样你可以在PCR中引物酶切位点等，但是3’端必须是与模板链结合的，因为Taq酶是按5-3方向延伸的，3‘端如果翘起的话，是不能延伸下去的，如果你的引物3’端一段与模板下游某处能结合，那就变成了deletion某段的PCR了...
扫描下载二维码pcr引物设计时，两条引物GC含量相差多少以内合适，12%可以么
Kyoya道GH7
要看你的引物是做什么用途，一般简单的用途都无所谓的，如果是比较难以扩增的反应和定量试验还是要严格设计。
一般不能但看GC含量，而要由引物的Tm值来综合判断，一般Tm值在2C以内。而Tm值主要由两个因素控制：GC含量和碱基数目。只要GC含量在40－60%都是可以接受的。12%只要Tm值不超过2C，应该是可以的。但是，您为何要选择相差这么大的引物？可以考虑其它引物啊？除非您要特定区域的，比如要包含起始密码子？...
用来做荧光定量PCR的话，设计引物的时候，你还应该考虑到非特异扩增的情况，这个对你的结果影响是很大的。
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扫描下载二维码PCR扩增时,引物与模板配对到什么程度就可以扩出目标片断?不考虑其他因素.请给详细专业的回答我的意思,是不是引物比如说25bp ,要与模板完全配对才可以扩增,还是可以有一个或几个不匹配的也可以扩得到(不要考虑温度和试剂等方面,只单纯从引物与模板相配方面讲).另外,如果差一点也可以扩增出来,那差别多少后就扩不出来了?
惰惰牌啤酒290
这取决与你使用的退火温度,引物浓度,离子强度,引物序列等诸多问题3‘端5个碱基影响扩增效率,当这5个中特别是后3个中有错配特别影响引物扩增的效率,但并不是不能引发,比如ssp引物配合taq酶,当退火温度降低时,即使3’端碱基不互补也能发生扩增.简单的说一个碱基错配会降低引物tm3－5度,当tm严重低于退火温度时便不能引发扩增,所以差多少能扩出来取决于错配碱基的位置,引物长度和tm,退火温度.5’端的修饰,如引入突变或加入酶切位点,这些序列是不计算在引物tm中的,不需要考虑,只要在3‘端有能提供足够tm的序列即可.
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【求助】引物3’端与5’端有差别吗？
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这个帖子发布于9年零232天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠路过请回答下！！
我现在设计的引物5’端和基因组上存在非特异性互补，请问，PCR的时候是不是可以把5’端看成是3‘端，而进行非特异性扩增啊？也就是说引物的结构在两端有差别吗？还是就算5’有互补区，也不能够从5‘开始扩增？
不知道邀请谁？试试他们
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如果你不对引物进行修饰，选择你要扩增的区域，用软件设计引物，选择得分最高的就行了．
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我的引物都已经在用了,我的意思是两端在结构上有什么差别,也就是说合成的时候两端的差别?
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PCR时碱基是往3'-OH端加的,而不是往5'-P端加,这是由聚合酶决定的吧
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zhangyazhen PCR时碱基是往3'-OH端加的,而不是往5'-P端加,这是由聚合酶决定的吧这个规则有一定道理的，假如可以从5'-P合成,在生成磷酸二酯键的时候,5'-P--p-p要水解掉一分子的p-p的,这样看好象也可以.但是发生错配的时候,聚合酶的外切酶活性就会切除错配的碱基,磷酸二酯键断裂,5'端就会形成5'-P,没有高能磷酸键的储存了,也就无法继续和下一个正确的碱基的3'-OH反应了.所以说从3'-OH合成是最合理的.
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我问了TAKARA公司的人，他们说两端都是－OH，那我就不知道怎么办了？有谁知道引物的合成过程？到底是不是两端都是OH,如果两端都是OH，那为什么不可以从5’开始啊？
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亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 　
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去即使引物的5'为羟基，也不大可能从5'合成，碱基的存在会从空间上起到阻碍作用吧我的理解是这样的。
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那么5‘段不严格配对也没有关系，是吗？
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个人感觉酶是可以从两端合成的，要不然，OVERLAP
PCR 就没法做了啊。
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不好意思啊，我说错了。特来纠正一下。酶是从3'端扩的，做OVERLAP-PCR也是这样的。
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5‘端没有羟基，所以不能扩增，因为PCR扩增原理就是聚合酶在引物3’端与脱氧核苷酸脱去一个水分子而不断延长的。具体原理可以参考DNA复制，前导链与冈崎片段的复制。
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