第28届北京青少年科技创新大赛
&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&医药与健康学
他汀类药物增强钙离子拮抗剂保护血管内皮细胞的作用
陈小鸟（北京市中关村中学）
背景与目的：
&&&&高血压及动脉硬化是中国老年人的常见病和多发病，血管内皮细胞功能紊乱参与高血压病和动脉硬化的发生,保护血管内皮功能是抗高血压和动脉硬化的重要环节。他汀类药物辛伐他汀（Simvastatin）和钙离子拮抗剂（CCBs）尼非地平（Nifedipine）联合应用增强内皮细胞的保护效果及其作用机制迄今为止尚未见报道，特设此题予以研究。
&&&&采用不同浓度尼非地平和辛伐他汀孵育H2O2刺激的内皮细胞系ECV304，用共聚焦显微镜动态观察荧光探针标记的细胞内钙离子变化及氧自由基的实时变化，能够更直观、更精确地解析CCBs以及他汀类药物引起一氧化氮合酶 (eNOS)产生的机制。用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测内皮细胞eNOS mRNA的表达；在蛋白质水平利用Greiss方法(分光光度计法)检测内皮细胞NO的分泌。
&&&&H2O2孵育细胞后eNOS mRNA表达降低，而尼非地平能够增加eNOS mRNA表达，这种作用呈剂量依赖关系（p&0.05）；尼非地平加辛伐他汀组与单独应用尼非地平组或单独应用辛伐他汀组相比eNOS mRNA水平显著增高（p&0.05）；联合用药比单独用药也能够增加内皮细胞NO的分泌（p&0.05）；加药前后各组间细胞内钙离子无明显变化（p&0.05），联合用药比单独用药能明显降低细胞内氧自由基的水平（p&0.05），并且与eNOS mRNA表达和NO的分泌相关。
&&&&本项研究在分子细胞生物学水平率先证明，辛伐他汀联合尼非地平比单独用药能显著增加内皮细胞eNOS mRNA表达和NO的分泌，增强内皮细胞的保护作用。其机制在于减少细胞内氧自由基的产生，而不是通过钙离子信号途径介导。同时提示这是有前景的抗高血压及防治动脉硬化的联合用药方案。
&&&&内皮细胞；尼非地平；辛伐他汀；内皮源性一氧化氮合酶；一氧化氮
&&&&“摇啊摇，摇到外婆桥，外婆叫我好宝宝，糕一包，糖一包.........”听着这首古老的江南童谣，我便想起了外婆。我的外婆十分慈祥、和蔼可亲。由于爸妈工作非常忙，又经常出国，从很小的时候就是外婆带我，是外婆把我带大的。暑假我看望外婆的时候发现她经常头痛、头晕，有的时候都不能睡觉，身体很不好。我陪她去医院看病，医生说外婆是高血压病，属于老年收缩期高血压，血压达到了180/90mmHg，出现了头痛的症状。医生马上给她含了个小药片（心痛定，短效尼非地平），半个小时后发现外婆的头不痛了，一量血压140/70mmHg，血压也降了，就又给她开了伲福达（长效尼非地平）等药，同时叮嘱外婆平时规律服用，勤测血压。我看到这样的情景，在痛恨高血压这种讨厌的疾病同时，同样感叹药物的神奇，一片小小的药片居然有那么神奇的效果。后来陪她去医院复查，发现血压控制的很好，但还是有时头晕，血管超声检查后发现颈动脉有斑块同时血脂偏高，医生说头晕是颈动脉粥样硬化引起的脑部供血不足导致，吃降压药的同时需要加用他汀类的调脂药辛伐他汀。
&&&&回家后我就上网查了一些相关的资料[]，原来高血压是一种常见病、多发病，是心脑血管疾病最重要的危险因素。在我国高血压人数很多，增长也很快，我国现有1.6亿以上高血压患者，在近10年就增长了31%。常见的症状有头痛、头晕、耳鸣、健忘、失眠、乏力、心慌等；长期的高血压可造成心衰、脑出血、尿毒症等重要脏器的严重损伤，并且老年高血压人群常常伴有动脉硬化的形成。
&&&&为什么这样一个小药片对外婆的病治疗这么有效？药物是通过什么机制起效的呢？加用他汀类药物对她的头晕有效吗？是否对降压也有好处呢？带着这些问题我走访了军事医学科学院基础医学研究所和中日友好医院，那里的叔叔、阿姨们看我这么小的年纪就对如此深奥的科学问题感兴趣，都十分热情的帮我解答疑问；同时通过进一步检索文献[, ]和请教专业老师，知道了心痛定和伲福达都是钙离子拮抗剂，其成份是尼非地平；知道了高血压的产生与血管内皮细胞的功能失调密切相关，内皮细胞能够释放一种叫内皮素（endothelin-1，ET-1）的物质，释放的越多血压越高；同时内皮细胞还能够释放一种叫一氧化氮（NO）的物质，能够对抗ET-1的作用，由于各种原因引起细胞NO释放减少，就能够导致血压增高。而细胞内的一氧化氮合酶（eNOS）则负责调节NO的产生。同时还发现钙离子拮抗剂（CCBs）对内皮细胞有保护作用，发挥防治高血压和动脉硬化的治疗效果。而他汀类药物在调脂作用外也能增加eNOS产生[,]。我想，老年人常常既有高血压又伴有动脉硬化，是不是CCBs联合他汀类药物比单用CCBs时能够更好的保护内皮细胞，加用他汀类的药物是不是能够在发挥调脂作用之外，增强CCBs的内皮细胞保护效果而达到理想的抗高血压及防治动脉硬化的联合用药呢?我在文献中查不到我要的答案。于是，我萌生了自己尝试对这个问题进行深入研究的念头。经学校与军科院基础医学研究所协商，我很荣幸地获得了在该所做实验的宝贵机会。选题经过论证后，根据分子细胞生物学原理和方法[, ]，在老师指导下设计出研究方案（图1），我利用节假日，通过一系列分子细胞生物学实验进行探索并初步得出科学的结论。
[材料与方法]
试剂与药物
&&&&尼非地平（Nifedipine，心痛定及伲福达中所含的成份)、辛伐他汀（Simvastatin，舒降之）均为Sigma 产品。钙离子探针Fluo-3/AM、增强剂Pluronic F-127及细胞内氧自由基探针CM-H2DCFDA购自Invitrogen公司；胎牛血清(FCS)、DMEM培养基购自Gibco公司；H2O2 (AR级)，上海桃浦化工厂产品，临用前稀释，并在5 分钟内使用，避光保存。Greiss法NO检测试剂盒购自北京康晖煜科技有限公司。正常细胞外缓冲液选择Hanks’缓冲液（Hanks’buffered saline solution，HBSS)，配制的HBSS溶液包含: 1.3mM CaCl2, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2?6H2O, 0.6 mM MgSO4?7H2O, 137 mM NaCl, 4.2 mM NaHCO3, 0.4 mM KH2PO4, 0.3 mM Na2HPO4?7H2O, 加入5.6 mM D-glucose，用去离子水配制而成。最后用NaOH调整pH到7.4。
内皮细胞系ECV304的培养
&&&&人脐静脉内皮细胞系ECV304（军事医学科学院二所赠送）应用10％胎牛血清的DMEM培养液，370C、5％CO2条件下在25×25cm培养瓶中培养，每隔2－3天传一代。
实验分为7组：
&&&&（1）对照组；
&&&&（2）刺激组（100uM H2O2刺激细胞30min）；
&&&&（3）100 uM H2O2＋0.1uM Nifedipine组（100uM H2O2＋0.1uM Nifedipine孵育细胞30min）；
&&&&（4）100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine组（100uM H2O2＋1.0uMNifedipine孵育细胞30min）；
&&&&（5）100uM H2O2＋10uM Nifedipine组（100uM H2O2＋10uMNifedipine孵育细胞30min）；
&&&&（6）100uM H2O2＋1.0uM Simvastatin组（1.0uM Simvastatin 孵育细胞2小时后，加100uM H2O2孵育细胞30min）；
&&&&（7）100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine＋1.0uM Simvastatin组（1.0uM Simvastatin 孵育细胞2小时后，加100uM H2O2和1.0uM Nifedipine孵育细胞30min）
&&&&通过半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）测定eNOS mRNA 表达。ECV304细胞传代至六孔板上，进行不同组刺激后，细胞用HBSS清洗一次，用Trizol（GIBICOL公司）按操作说明提取总RNA。取总RNA 1.0μg，用逆转录试剂盒（Promega公司）按操作说明合成cDNA。取cDNA在PTC200 PCR扩增仪上（美国MJ公司）进行半定量PCR。扩增人eNOS及GAPDH基因，GAPDH 基因的扩增产物为内对照。引物序列根据Genbank数据库提供的人eNOS全长cDNA序列，应用Prime5.0软件设计PCR引物，上游引物为5-AAG ATC TCC GCC TCG CTC A-3；下游引物为5 CGCT GTT GAA GCG GAT CTT A-3，扩增产物长度为336bp；扩增条件如下：cDNA 1.0μl，25mmol/LMgCl2 5.0μl，dNTP 1μl，正向引物0.25μl，反向引物0.25μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，Taq 酶0.5μl，加去离子水至终体积25μl，扩增产物94℃变性5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，循环数35；72℃延伸7min。内参照选用人GAPDH，上游引物为5- GAA TTT GGC TAC AGC AAC AGG GT G -3；下游引物为5 CTCT CTT CCT CTT GTG CTC TTG CTG -3，扩增产物长度为204bp；扩增条件如下：cDNA 1.0μl，25mmol/LMgCl2 2.0μl，dNTP 1.0μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，Taq 酶0.25μl，加去离子水至终体积25μl，扩增产物94℃变性5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s，循环数35；72℃延伸7min。
&&&&扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照。于凝胶成像系统（ALPHA IMAGER2200）下分析各条带灰度，所得数据用均数±标准差（±s）表示并进行t检验做统计学处理。
共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度变化
&&&&将培养的ECV304细胞接种到直径为35 mm的共聚焦专用培养皿（美国MatTek公司）中。根据荧光探针使用说明书及文献[]进行下列实验。细胞贴壁生长后用无血清培养液同步12小时，HBSS液清洗2次（37℃孵育温热的HBSS），将储备的1mM Fluo-3（钙离子探针）和4％的Pluronic F-127（荧光增敏剂）用含Ca2+，Mg2+的HBSS缓冲液稀释到终浓度7.5μmol/L的Fluo-3和0.02％ Pluronic F-127，加入细胞中，置37℃的培养箱中孵育15分钟；后HBSS洗3次；暗室静止细胞10分钟，置于60倍油镜观察区域及层面。使用Radiance 2000型激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy,LSCM）（美国Zeiss公司）。采用49mW的氩离子激光，激发波长为488nm。用LSCM观察并采集 Fluo-3染色细胞的某一层面的荧光图像。在time-course程序下开始扫描，动态扫描数据采集间隔时间为5min，采集次数为7次（即连续检测30min）。高速计算机逐帧储存观察到的动态荧光图象并绘制钙离子荧光强度变化曲线，后用LSCM自带的Lasersharp 2000 软件（version 6.0）分析数据。每组实验至少选择40－45个细胞。细胞内Ca2+ 浓度用细胞内平均荧光强度表示（荧光强度无单位）。
共聚焦显微镜检测细胞内氧自由基（ROS）变化
&&&&将培养的ECV304细胞接种到直径为35mm的共聚焦专用培养皿中。根据荧光探针使用说明书及文献[]进行下列实验。细胞贴壁生长后用无血清培养液同步12小时后，HBSS液清洗2次（37℃孵育温热的HBSS），将储备的10mM CM-H2DCFDA用HBSS缓冲液稀释到终浓度5.0 μmol/L加入细胞中，置37℃的培养箱中孵育30分钟；后HBSS洗3次；暗室静止细胞10分钟。使用Radiance 2000型激光共聚焦显微镜扫描。采用49mW的氩离子激光，激发波长为488nm，接收波长505－530nm。倒置显微镜在60X油镜下动态观察胞内氧自由基变化（暗室操作）。在time-course程序下开始扫描，动态扫描数据采集间隔时间为5min，采集次数为9次（即连续检测40min）。高速计算机逐帧储存观察到的动态荧光图象。数据整理后根据图象绘制钙离子荧光强度变化曲线，后用LSCM自带的Lasersharp 2000 软件（version 6.0）分析数据。每组实验至少选择35－45个细胞。
Greiss法检测内皮细胞上清分泌NO的情况
&&&&用培养的ECV304细胞制成细胞悬液，调整细胞数至1×106个/ml，接种于24孔培养板，每孔1mL，37℃、CO2培养箱培养。24小时后，细胞贴壁，弃去上清液。换新鲜培养液1ml，按上述实验组进行分组，药物作用4小时后，收集细胞培养上清用于检测NO的水平。NO水平测定采用Greiss法，操作按说明书进行。
统计学处理
&&&&所有计量资料使用均数±标准差（±s）表示，数据的统计用t检验及方差分析，使用SPSS10.0软件进行统计分析。组间比较以P & 0.05表示显著性差异。
一、辛伐他汀增强尼非地平对内皮细胞eNOS mRNA表达上调的作用
&&&&通过对RT-PCR结果及eNOS/GAPDH灰度比值的分析显示（图2），与对照组相比，100uM H2O2刺激内皮细胞ECV304 30min后，eNOS mRNA的表达明显降低；加入尼非地平后，能够明显增加eNOS mRNA的表达（*p & 0.05 v.s. H2O2刺激组；n=3），并且这种作用成剂量依赖关系（# p & 0.05 v.s.100uM H2O2＋0.1uM Nifedipine组；n=3）。
&&&&根据图3所示，1.0uM尼非地平+1.0uM 辛伐他汀组与单独加1.0 uM尼非地平组和1.0uM 辛伐他汀组相比明显增加细胞内eNOS mRNA的表达，是单独应用尼非地平效果的1.8倍（*p & 0.05 v.s.H2O2刺激组；#p & 0.05 v.s. 100 uM H2O2＋1.0 uM Simvastatin组和100 uM H2O2＋1.0 uM Nifedipine组；n=3）。这些结果提示，尼非地平能够保护内皮细胞免受H2O2刺激的损伤，增加细胞内eNOS mRNA水平的表达；而加入辛伐他汀后能够明显增强这种作用，从而增强了内皮细胞的保护作用。
二、辛伐他汀增强尼非地平抑制内皮细胞氧自由基（ROS）产生的效果
&&&&上述结果已经证明，100uM H2O2刺激内皮细胞ECV304能够降低eNOS mRNA的表达，而尼非地平和辛伐他汀能够抑制这种损伤作用。文献报道[3, 4]，钙离子拮抗剂和他汀类药物能够通过多种途经影响eNOS的表达，比如，细胞内的氧自由基信号，钙离子信号，缓激肽系统途径等等。
[参考文献]
&&&&李为民; 刘巍。2005年中国高血压防治指南评介。中国实用内科杂志, 9-902。
&&&&Ton J. Rabelink and Thomas F. Luscher. Endothelial Nitric Oxide Synthase: Host Defense Enzyme of the Endothelium? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Feb 7 C 271.
&&&&张庆斌；刘伏元。血管内皮细胞和原发性高血压。心血管病学进展，）：481-484。
&&&&张志杰; 胡申江。他汀类药物血压调节机制的研究进展。国外医学.内科学分册, ）：203-205。
&&&&邱国应。他汀类药物的临床应用新进展。中国心血管病研究杂志, ）638-640。
&&&& J.莎姆布鲁克著，黄培堂译。分子克隆实验指南（第三版）2002。
&&&&D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，黄培堂等译。细胞试验指南。，717-722。
&&&&王海燕; 何韶衡; 林珏龙。激光扫描共聚焦显微镜观察胰蛋白酶对肺上皮细胞游离钙离子的影响。激光生物学报, ）：377-379。
&&&&Keith R. Brunt, Keith K. Fenrich, Gholam Kiani et al. Protection of Human Vascular Smooth Muscle Cells From H2O2-Induced Apoptosis Through Functional Codependence Between HO-1 and AKT. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Sep 27 C 2034.
&&&&为了明确这种保护作用的机制，用特异性荧光探针CM-H2DCFDA标记细胞内的ROS，通过激光共聚焦显微镜进行动态实时检测。结果显示，100uM H2O2刺激内皮细胞能够明显增加细胞内CM-CDFDA荧光强度，30min时达到最强，说明H2O2刺激能够引起细胞内ROS产生的增加。而加入尼非地平能够抑制ROS的产生，随着尼非地平浓度的增高这种抑制作用逐渐增强，呈计量依赖关系（图4，*p&0.05 v.s.B组，n=35-45个细胞）。而加入辛伐他汀后，1.0 uM 尼非地平+1.0uM 辛伐他汀组与单加1.0uM 尼非地平组以及1uM 辛伐他汀组相比细胞内荧光强度明显减弱（图5，A,C,E,G组之间无统计学差异，p & 0.05；*p & 0.05 v.s.B组；# p & 0.05 v.s. D,F组；n = 40-45个细胞），说明辛伐他汀联合尼非地平能够增强对胞内ROS产生的抑制作用。
三、辛伐他汀及尼非地平对内皮细胞钙离子浓度（[Ca2+]i ）变化的影响
&&&&由于钙离子是引起内皮细胞生物学改变最主要的第二信使，是细胞内传递信息的“神经系统”。而尼非地平又是钙离子拮抗剂，其保护内皮细胞的作用是否通过抑制细胞内钙离子的增加目前还有争议。先用100uM H2O2刺激细胞，发现能够诱发ECV304细胞[Ca2+]i增加（图6, p&0.05，n＝40-45个细胞），在刺激10min时增加已经十分明显，持续至30min；加入不同浓度的尼非地平（0.1uM、1.0uM、10uM）孵育细胞后，再加100uM H2O2仍能够引起细胞[Ca2+]i增加，这种[Ca2+]i增加不能被尼非地平抑制，加药前后其[Ca2+]i增加幅度无统计学意义（表1，p&0.05，n＝40-45个细胞）。说明尼非地平对ECV304细胞的保护作用与钙离子信号无关。进而把1.0uM辛伐他汀+1.0uM尼非地平组与单独应用1.0uM的尼非地平组及单独应用1.0uM辛伐他汀组分别比较，100uM H2O2刺激[Ca2+]i增加幅度仍无统计学意义。说明辛伐他汀增强尼非地平的内皮细胞保护作用也不是通过改变细胞内钙离子变化起作用的。
100 uM H2O2刺激组
34.08±4.50
80.82±9.16
82.43±15.22
81.45±14.13
100uM H2O2＋0.1uM Nifedipine
27.99±12.25
82.65±8.75
74.64±9.25
75.33±13.29
100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine
30.86±9.13
81.33±12.46
84.07±14.76
81.67±11.09
100uM H2O2＋10uM Nifedipine
26.53±3.29
79.80±4.90
72.73±6.11
74.83±13.77
100uM H2O2＋1.0uM Simvastatin
26.48±3.88
80.58±7.13
71.13±4.24
76.46±15.27
100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine＋1.0uM Simvastatin组
31.32±5.51
75.88±7.61
77.98±7.81
78.13±9.28
四、辛伐他汀增强尼非地平对内皮细胞NO分泌增加的作用
&&&&上述结果显示尼非地平及辛伐他汀能够增强eNOS mRNA的表达，但是eNOS增加并不能直接说明这两种药物对细胞的保护作用。因此，我们进一步通过Greiss法（分光光度计法）在蛋白质水平检测了不同药物处理后的ECV304细胞分泌NO情况。表2显示，与对照组相比，100uM H2O2处理的细胞NO产生明显降低（69.43±6.80 umol/L v.s. 40.22±6.70 umol/L，P & 0.01，n=6）；加入1.0uM 尼非地平及1.0uM辛伐他汀使NO的分泌分别增加到60.80±6.67 umol/L和52.74±5.40 umol/L（P & 0.01，与100uM H2O2处理组相比，n=6）；联合用药后，ECV304分泌的NO增加到82.68±6.51 umol/L（P & 0.01，与加1.0uM尼非地平组及1.0uM辛伐他汀组相比，n=6）。结果说明联合用药组比尼非地平及辛伐他汀单独用药更能增加内皮细胞NO的分泌，起到更好的保护内皮细胞作用。
表2，各实验组对ECV304细胞分泌NO的影响
细胞上清NO水平（umol/L）
69.43±6.80*
100 uM H2O2刺激组
40.22±6.70
100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine组
60.80±6.67*
100uMH2O2＋1.0uMSimvastatin组
52.74±5.40*
100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine＋1.0uM Simvastatin组
82.68±6.51*#
&&&&（*P & 0.01 与100 uM H2O2刺激组相比；#P & 0.01 与100uM H2O2＋1.0uM Nifedipine组及100uMH2O2＋1.0uMSimvastatin组相比）
&&&&内皮细胞是血液与血管壁之间的物理屏障。血管内皮细胞功能失调会引起血管活性物质平衡的紊乱，这对于高血压、动脉硬化等许多心血管疾病的发生发展起着促进作用。同时血管内皮细胞通过合成、释放的一氧化氮（NO）、前列环素和内皮素（ET）形成血管内在的调节体系。NO具有舒张血管，抗血小板聚集，阻止血细胞之间以及血细胞与内皮细胞间的粘连，有利于血流顺利通过，对预防高血压和动脉粥样硬化的形成有着保护作用。而内皮细胞eNOS表达的多少是影响NO产生的关键。高血压病人血管内皮细胞合成释放NO明显减少。所以通过药物调节eNOS表达，增加内皮细胞NO分泌是抗高血压和防治动脉硬化新的重要途径。
&&&&在内皮细胞功能紊乱影响高血压及动脉硬化发病的分子细胞生物学研究中，有文献证明了CCBs有增加内皮细胞eNOS产生的作用；而他汀类药物主要作为调脂药进行研究，近几年才关注其对内皮细胞eNOS的影响作用，我在检索文献时并没有发现把辛伐他汀与尼非地平联合用药进行探讨其内皮细胞保护分子机制的相关研究。
&&&&本项实验证明了尼非地平能够增加内皮细胞eNOS mRNA的表达，参与内皮细胞的保护；单独应用辛伐他汀也能够上调eNOS mRNA的表达。同时证明联合用药比两者单独用药更能上调内皮细胞eNOS mRNA的表达以及增加NO的分泌，从分子细胞生物学角度证实联合用药比单独用药更能增强其保护内皮细胞的效果，这可对抗高血压及防治动脉硬化提供理论指导。
&&&&在关于调节eNOS水平的作用机制中，有文献显示，老年人内皮细胞内ROS水平的增加能够抑制eNOS的表达，是老年高血压的发病原因之一。在这里，我应用先进的激光共聚焦技术观察了细胞内ROS的情况，因为此项技术能够在显微镜下对同一个活体细胞进行长时间连续不断的扫描，动态观察荧光探针标记的胞内氧自由基的实时变化，能够更直观、方便、精确地解析CCBs以及他汀类药物引起eNOS释放的机制问题。结果显示，H2O2刺激内皮细胞能够明显增加细胞内CM-CDFDA荧光亮度，也就是说能够引起细胞内ROS的产生增加。而加入尼非地平能够抑制细胞内ROS的产生，随着尼非地平浓度增高这种抑制作用逐渐增强。联合用药后，细胞内荧光强度进一步减弱，这与其增加细胞内eNOS mRNA表达和NO分泌水平的趋势相一致，说明辛伐他汀联合尼非地平是通过对内皮细胞内ROS产生的抑制作用而增强胞内eNOS mRNA的表达和增加NO分泌的，发挥着对内皮细胞的保护效果。
&&&&由于胞内钙离子信号是内皮细胞生物学变化的最主要的第二信使，而尼非地平作为细胞膜L型钙离子通道的阻断剂，其保护内皮细胞的作用是否通过抑制细胞外钙离子内流的途径介导，目前还有存在不同的看法。在其它研究中已经证实细胞内钙离子增加可以抑制eNOS的表达。是否尼非地平和辛伐他汀也能够通过抑制细胞内钙离子而发挥增加eNOS mRNA水平的作用呢？在这个实验中发现，加入尼非地平和辛伐他汀与否，内皮细胞内钙离子并没有显著变化，说明辛伐他汀联合尼非地平增加内皮细胞内eNOS的表达不是通过抑制细胞内钙离子变化来起作用的。这种对内皮细胞的保护可能与细胞内钙离子变化无关，也与国外Aono Y等人的研究结果[]相一致。我也请教了相关的研究钙离子信号的专家，认为尼非地平除了阻断细胞膜钙离子通道的作用外，由于其分子结构的特异性，他能够直接与细胞膜脂质层结合发挥抗ROS的作用，而H2O2刺激内皮细胞可能是通过细胞内钙离子（来源于细胞内质网内的钙释放）的释放增加胞浆内的钙离子浓度而发挥后续一系列生物学效应的，与细胞外钙内流关系不大，所以尼非地平不能阻断这样的胞内钙离子增加，此研究结果与尼非地平作为钙离子通道拮抗剂的特征并不矛盾，是通过抑制细胞内ROS发挥保护内皮细胞的作用。
&&&&综上所述，本实验发现并证实辛伐他汀与尼非地平的联合用药比单独用药能够增加细胞内eNOS mRNA的表达以及NO的分泌，得出辛伐他汀能够增加尼非地平内皮细胞保护效果的结论，这将对抗高血压及防治动脉硬化提供理论指导。辛伐他汀与尼非地平联合用药主要通过减少胞内氧自由基产生的途径发挥它们更强的内皮细胞保护效果，而不是通过钙离子信号途径增加eNOS的产生；初步发现了其保护内皮的机制问题。本项研究的结果提示，在临床实际应用尼非地平治疗老年人高血压病时可以加用辛伐他汀，这样既能够带来满意的降压效果，又能够减轻老年人动脉粥样硬化的形成。提示是一种有前景的联合用药策略。
&&&&这几个寒暑假虽然过得短暂而且忙碌，但是我的心情是快乐的，因为我帮助外婆解决了一个健康问题，同时寻找到了我想要的答案。
&&&&可是，在完成上述实验后，我又发现了新的问题，联合用药后eNOS mRNA的增加与NO分泌的增加幅度并不完全是一致的，eNOS mRNA增加的幅度比较大，而NO分泌的情况则增幅较小。这种不一致性又是什么原因导致的呢？是不是增加的eNOS并不是全部都有活性呢？还是其他的某些因素干扰了eNOS的活性，影响NO的分泌？也就是说该联合用药引起NO增加的机制还未完全弄清楚，需要进一步的探索揭示其本质。看来科学实验是发现问题，解决问题，再发现新问题的一个连续不断的探索科学真理的过程。我还要继续努力啊！
&&&&在本实验中，采用先进的分子细胞生物学方法在mRNA水平和蛋白质水平上明确了尼非地平联合辛伐他汀能够显著增加内皮细胞eNOS的产生和NO的分泌，发挥着对内皮细胞的保护作用。同时解析出了这种保护作用是通过减少细胞内氧自由基的产生引起的，而不是通过钙离子信号途径介导的新观点。为临床实践提供指导，提示辛伐他汀联合尼非地平是一种有前景的抗高血压和防治动脉硬化的联合用药方案。
[小结与致谢]
&&&&科学研究的目的是发现真理，解决实际问题，为造福人类服务。这次我从发现问题，进行实验设计，到实验的实施，数据的整理，论文的撰写及不断修改，回想这一幕幕心中十分感慨，科学研究是严谨、客观的，过程也是辛劳的。在实验过程中遇到的重重困难几乎要把我吓倒，是老师们的鼓励以及追求科学真理的执着信念使我坚持下来，终于收获了累累硕果。现在我回想起来心情格外舒畅，因为我脑中的许多问题在这里找到了答案，不仅仅为了外婆，也为千千万万的老年高血压患者找到了答案。我默默地想：奥妙无穷的科学世界呀，现在我要认识你，将来我要探索你，揭开你心底的谜。我坚信，在科学道路上将会留下我攀登的足迹。
&&&&在本实验的研究中，得到了军事医学科学院基础医学研究所老师们的亲切指导和帮助。在实验过程中，内皮细胞的培养是由李明明老师指导的，我功课忙的时候她就帮我传代，换培养液；PCR引物的合成是洪权老师请赛百盛公司设计合成的；eNOS mRNA的提取，RT-PCR反应时间、循环次数等条件的摸索，PCR仪器以及分光光度计的使用是在洪权老师的指导下完成的，最后我已经能自己独立操作了；特别是激光共聚焦显微镜的使用打破了我对显微镜的传统认识----不是放大细胞那么简单，使我开阔眼界。仪器中心的周涛老师和冯哲老师手把手的指导我进行探针的染色，帮助我进行细胞内ROS、钙离子的实时动态检测，从开始的时候什么都不懂到最后可以在老师的指导下进行简单操作，使我了解了这个先进机器的神奇作用。尤其要感谢范明老师,他作为军科院基础医学研究所所长及国家“973”项目的首席科学家，在忙碌的工作之余，还指导我这个懵懵懂懂的孩子如何进行科学研究，如何检索专业文献，以及帮我理清研究思路，设计课题及修改论文，令我受益匪浅；同时感谢徐军老师对我的悉心帮助和指导，是她指导我进行实验数据的统计，是她一遍一遍不厌其烦地指导我修改论文（经常熬到深夜）以致才有现在的成果，令我感动！还要感谢中日友好医院心内科的叔叔阿姨们，是他们帮我解决了临床上那些生涩难懂的医学问题。没有这些老师们的帮助我将无法体会到科学研究的复杂过程和获取结果时的乐趣。最后，我要感谢我的父母、感谢我的学校和所有帮助过我的老师、朋友。
&&&&Y Aono, H Ariyoshi, M Sakon et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) show Ca(2+) mobilization as well as Ca(2+) influx upon hypoxia. J Cell Biochem, June 6, ): 458-64.
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&电话：010-& &E-mail:cx33@&&&&&&&&&&&&&