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[求助]人黑色素细胞原代培养
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各位大侠,本人已经养了三个多月的细胞了,可是现在细胞还是未见增长,而且不知道原因在哪,特求高手帮忙分析原因.
来源:成人包皮
方法:先用dispase 酶消化过夜16个小时,分离表皮和真皮,然后将表皮用胰酶消化,含血清的培养基终止,200目过滤,离心,接种.
培养基:为Gibgo M-254专用培养基。
细胞生长很慢，不形成集落，零星散在，请问原因可能哪些？崩溃了
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newway ( 17:45:16)
是基础培养基，购买时买一生长因子HMGS，配套的
血清没有说要加阿
bananapeople ( 17:45:33)
黑色素细胞相对比较好养。看你的步骤大方向没问题。可能是某个细节没处理好。
langlang ( 17:45:58)
我也养了半年多的黑素原代，方法基本与你相同。
细胞生长慢可能原因：
1、消化过度：相对于角质形成细胞，黑素很不耐消化，所以胰酶消化的时间不能太长，否则大部分黑素都死了或状态不佳。我的经验是在镜下观察，表皮碎片边缘有少量细胞出来就终止消化，时间大约5min（37°）。
2、细胞过稀或过密：细胞过稀，则贴壁的黑素少，黑素细胞相互间联系少，进入快速生长期慢。细胞过密，尤其是过筛网时研磨过分，很多纤维结缔组织混入细胞悬液，沉淀至瓶底，影响黑素贴壁。我一般一个成人包皮分两瓶60ML培养瓶。
3、培养基过期：254的保质期不长，且需要避光保存，若过期，则黑素生长缓慢。我们原来也发现原代3个月才长满一瓶，换了新培养基就好了。
vivian4123 ( 17:46:22)
我试过直径3cm培养皿，六孔板都不太好，而培养瓶的细胞第二天都没有贴壁，而且我是新手，操作也不太熟练，所以一直不敢用培养瓶
消化时间我也是一般都5分钟，细胞密度我倒是一直凭感觉。。。培养基我也换新的了，而且看了说明书，添加了生长因子的M254只能保存一个月，所以新订之后分次添加培养基了
想请问下，这个过程的细节有哪些注意的？
vivian4123 ( 17:46:42)
看看我的细胞吧,这是四倍的,一周的时间
vivian4123 ( 17:47:01)
感觉黑色素细胞太少,不会像别人细胞那样成团生长,别人都说长不起来的
vivian4123 ( 17:47:20)
再来一张,中间的细胞应该是黑色素细胞吧
下面只有两极的是吗?我的里面有一些两极的,但也只是散落
还有旁边一些亮点是什么,有的时候有很多在一起,还有会看到比较多的黑色小颗粒,也不清楚是什么,长了一周就这样,是不是太少了?
ffooll ( 17:48:23)
比我的好些哦 至少看到有两极的东西
查看完整回复请点击这里：在小鼠伤口愈合期间，对头发毛囊中黑素干细胞（色素细胞前体）的一种应激激素受体进行刺激，将使皮肤外层中的成熟黑素细胞获得补充。《自然―医学》上的这项研究结论证明了黑素干细胞及通路激活方式是怎么样被用于治疗皮肤色素异常比如白癜风和斑驳病的。
&
皮肤和头发除了通过提供物质屏障来防止来自紫外光的伤害外，也利用黑素细胞产生色素来吸收这类辐射。但是，如果受伤，皮肤中的黑素细胞就需要获得补充，因为这些细胞中新产生的色素能帮助正在愈合的伤口抵挡来自太阳光的损害。&
&
Mayumi&Ito等人通过皮肤切除让小鼠产生伤口，从而导致头发毛囊中的干细胞迁移至皮肤外层并在伤口愈合期间分化成黑素细胞。他们发现在小鼠和人体皮肤组织中，这类干细胞也会发生迁移以应对B型紫外线的照射，而这也与一种应激激素受体Mc1r有关。研究人员推测，由于黑素干细胞为应对应激激素对Mc1r的过量刺激而发生迁移，从而导致头发毛囊中黑素干细胞的消耗，也许可以解释这种矛盾。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#08年07月21日 Surv Ophthalmol. 2008 Jul-A53(4):411-5.
医学空间（）7月21日消息-美国俄亥俄州克利夫兰医院科尔眼科研究所的Qian Y及其同事日前报道了一例发生虹膜肿瘤的眼（皮肤）黑素细胞增多症和长期虹膜痣患者。该患者为一名50岁的白人男性。肿瘤切除后进行病理组织学检查提示为混合细胞型恶性黑素瘤。围绕整个黑素瘤的肿瘤周边存在良性痣细胞。
白人眼（皮肤）黑素细胞增多症患者容易发生葡萄膜黑素瘤，其多源于脉络膜。文献回顾显示在这种情况下仅有三例确诊的虹膜黑素瘤病例。另外两例最初被确定为纺缍型A黑素瘤的病例根据修订后的葡萄膜黑素瘤Callender分类法被重新分类为虹膜痣。
Qian等建议，眼（皮肤）黑素细胞增多症患者应接受随访以防葡萄膜黑素瘤的发生。
日期：日 - 来自[]栏目
【关键词】& 白癜风
&&& 白癜风是一种常见的后天性色素脱失性皮肤病,本病主要影响美观, 给患者精神上带来巨大的压力。由于病因尚不完全清楚,目前尚无特效的根治方法。有关其病因及发病机制学说众多，有自身免疫学说、黑素细胞自身破坏学说、神经化学因子学说、黑素细胞生长因子缺乏学说、遗传因素等［1］。鉴于此，对于白癜风目前的实验中尚无针对病因制造的病理模型。但是对白癜风模型的研究仍在不断进步发展，建立一个合理的模型有助于我们攻克白癜风这一顽疾。本文对目前常用于白癜风的动物模型及模型制备方法进行综述。
&&& 1& 常用模型
&&& 适宜的动物模型可成为研究治疗药物中有用的药理学工具，白癜风的动物模型在研究白癜风的发病机制和治疗方法上可发挥重要的作用。
&&& 1.1& SL鸡& Smythline(SL)鸡［2,3］是人类自身免疫性白癜风的动物模型，由美国马萨诸塞州大学Smyth教授在20世纪70年代创立。SL鸡白癜风的发生是由两个相互影响的因素造成，即黑素细胞固有的缺陷和针对黑素细胞的自身免疫，最终导致黑素细胞缺失。这一模型在疾病病理的许多方面，特别是在免疫学方面与人类的白癜风极为相似。
&&& SL鸡最早是在一笼褐色鸡中被偶然发现的一只白色母鸡，从它翅膀上的标记看，在孵化出壳时为褐色。经过反复遗传选择实验，Smyth发现，其色素的脱失并不遵循孟德尔法则。SL鸡与它的双亲有各自不同的主要组织相容性复合物(MHC)抗原。SL鸡一般在孵化后6～12周其羽毛发生色素脱失。SL鸡可伴有不同程度的与鸟类换毛时不同的斑秃样或普秃样外观改变，酷似人类的斑秃。
&&& 人类许多白癜风患者体内有循环抗黑素细胞抗原的自身抗体，抗体的存在与疾病的活动性和皮损面积相关。这些自身抗体能通过补体介导途径和抗体依赖的细胞毒作用破坏黑素细胞。在SL鸡模型中，SL鸡在发生色素脱失的前几周，血清中可检测到抗黑素细胞抗体，这种自身抗体可与人和鼠黑素细胞发生交叉反应。经免疫印迹法测定，这一循环自身抗体能与黑素细胞中65～80kD中的多种蛋白结合，而正常色素的Smyth鸡却没有这种抗体。已知哺乳动物的3种黑素细胞蛋白亚型即酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2均在65～80kD这一分子量范围内。经RNA印迹证实哺乳动物TRP-1是SL鸡自身抗体的主要靶抗原［4］。细胞介导的免疫反应在这一模型中也能很好的体现。SL鸡在发生色素脱失前和色素脱失的整个过程中，其新生羽毛毛囊中的T细胞浸润大量增加，&T细胞受体与&T细胞受体之比增加。在淋巴细胞浸润的早期，浸润细胞主要为CD4+T细胞，在色素脱失发生后，CD4+／CD8+比值下降，浸润细胞主要为CD8+细胞，血液中淋巴细胞无改变，但中性粒细胞在色素脱失前增加［5，6］。
&&& 1.2& C57BL小鼠& C57BL小鼠［7～10］是由Little从Abby Lathrop小鼠近交培育而得,有C57BL /6、C57BL /6J、C57BL /10等亚系。其中C57BL /6JLer-vit/vit小鼠是C57BL /6J的同源突变系,是白癜风的鼠模型。与白癜风相关的研究主要有毛囊黑素细胞增殖与分化的调节与白癜风复色的研究以及鼠白癜风的遗传等。C57BL小鼠适合于研究毛发色素形成,以及在毛发生长过程中角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞之间的相互作用研究。如果在这一模型中加入某些干扰因素,通过组织学、生物化学、分子生物学、免疫学等技术对毛发生长状态进行研究,可直接了解皮肤黑素细胞黑素形成的能力和皮肤色素的变化情况。有人将处于毛发休止期延长期的C57BL /6J小鼠部分毛发拔除,刺激局部的毛囊从休止期进入生长期,同时在局部应用胎盘提取物,通过对毛发生长过程的观察了解胎盘提取物对黑素细胞增殖和分化的作用。其机制可能因为白癜风皮损表皮中黑素细胞消失,但局部毛囊外根鞘存在多巴阴性的黑素母细胞,通过刺激或调节这些细胞的生长、迁移和黑素生成是白癜风复色的必要条件。
&&& C57BL小鼠的应用范围较广，与白癜风相关的研究主要有毛黑素细胞增殖与分化的调节和白癜风复色的研究，以及鼠癜风的遗传等［2］。
&&& 1.3& 豚鼠［10～11］& 远交群豚鼠，按其毛色可分为白色、黄褐色、黑色等。其中黄褐色豚鼠表皮中有适量的对UVB和PUVA敏感的功能性黑素细胞，经紫外线照射后的皮肤可产生清晰可见的色素沉着过度，表皮中多巴阳性黑素细胞数量较未照射部位增加3～4倍，黑素细胞树突增加。这一现象和过程类似于人类紫外线诱导的色素沉着，特别是黄种人的晒黑现象。因此，这一模型常用于研究紫外线诱导的色素沉着和白癜风治疗中的补骨脂素光化疗法，以及用于酪氨酸酶抑制剂和防晒剂的药效学研究。
&&& 1.4& 其他
&&& 1.4.1& 其他动物& 除SL鸡外,还有白癜风狗、猫和马等动物体内有抗黑素细胞抗体,这些抗体识别的黑素细胞抗原与人类白癜风自身抗体所识别的黑素细胞抗原相似,说明动物白癜风与人类白癜风有相似的免疫反应。除C57BL小鼠和豚鼠外,还有无毛小鼠、无毛狗和无毛豚鼠等动物,表皮中均有活性黑素细胞,对环境因素的刺激敏感,在白癜风相关研究领域中也是可选择的动物模型［12］。
&&& 1.4.2& 体外试验模型［3，12，13］& 有研究利用小鼠黑素瘤细胞或环切术后患者包皮制备单细胞悬液,培养传代,经DOPA染色为阳性的,证明为黑素细胞,经体外系统给药,观察药物对黑素细胞的细胞毒作用及药物对黑色素细胞增殖的影响。并观察药物对黑色素细胞中酪氨酸酶活性、黑素含量的影响,以及对黑色素细胞中酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白基因表达的影响等。
&&& 2& 常用模型制造方法
&&& 2.1& 化学脱色法
&&& 2.1.1& 过氧化氢模型& 白癜风动物模型的制备国内较早期就已有报道［13］。根据黑色素不稳定、易受强氧化剂过氧化氢破坏的特性,采用5%过氧化氢外用(每次0.5ml,每天2次,脱毛区涂抹20～40天) ,使豚鼠黑色皮肤脱色,建立动物模型。测定了模型动物血液中胆碱酯酶ChE活性及Ig含量,并取用药部位皮肤进行黑色素染色,观察黑色素毛囊数及皮肤黑色素分布情况。发现用过氧化氢后,MAO明显增加, ChE活性下降, Ig明显增加,豚鼠皮肤表皮基底细胞、棘层黑色素及毛囊黑色素明显减少,用药时间越长,效果越显著,说明用过氧化氢后有模拟白癜风的作用。
&&& 因皮肤发生局部病变后可生成过量的自由基,使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化,形成脂质过氧化产物,从而使膜结构及其功能发生障碍。因此,测定过氧化脂质的代谢产物MDA含量可反映其结构和功能的变化。
&&& 因酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,该酶催化黑色素在黑色素细胞中合成。在合成中首先由酪氨酸转变成多巴,多巴在酪氨酸酶作用下氧化成多巴醌,多巴醌经环化成某些中间产物,最后生成黑色素。如果酪氨酸酶活性减弱,将影响黑色素的生成。据报道,白癜风患者的酪氨酸酶活性降低,血液粘稠度明显增加。因此,有人［15］利用上述化学脱色法复制的白癜风动物模型,观察了动物血液中酪氨酸酶含量及血液流变性指标的变化,发现连续50天外涂过氧化氢后,动物血中酪氨酸酶含量减少,血液流变性指标明显升高。说明用化学脱色法复制的白癜风动物模型与临床证型相一致,有代表性。另有人［16，17］利用该模型评价内服或外用中药对酪氨酸酶含量和血液流变学的影响,发现用药后不但可使模型动物黑色素毛囊数明显增多,而且可使胆碱酯酶活性恢复接近正常,使血液中酪氨酸酶含量明显增加,使血液流变性改善,提示该模型可作为评价药物治疗白癜风的模型。
&&& 2.1.2& 氢醌模型［18～20］& 氢醌：氢醌又名对苯二酚。它由苯胺氧化成苯醌，再经还原而成。有人选用性质更为稳定的氢醌建立了豚鼠皮肤涂抹脱色模型。氢醌对皮肤具有脱色素作用,其机制可能是通过阻断了酪氨酸酶,使酪氨酸不转化为多巴和多巴醌,从而抑制黑色素合成,造成在形态上黑色素的表现与白癜风相似。但也有人认为,氢醌脱色实质上是一酪氨酸酶介导的细胞毒作用。氢醌分子易扩散进入黑素细胞的黑素小体,阻断黑素生成途径的一个或多个步骤,同时氢醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半醌基物质,后者使细胞膜发生脂质过氧化,破坏细胞膜性结构,最终导致细胞死亡。氢醌临床上主要用于黄褐斑和炎症后色素沉着的治疗。各个国家使用的浓度不一样，从4%～8%。一般低浓度时，不良反应少，但其效果稍差，起效时间也长，浓度高时，则结果相反。氢醌应用的局部不良反应有局部刺激性、接触性皮炎、色素减退斑。色素减退一般可以复色，但有时会持久存在，特别在高浓度时更易发生［21］。
&&& 有研究结果表明不同浓度的氢醌其脱色作用的机制可能不同,低浓度时以抑制酪氨酸酶活性为主,高浓度时主要是细胞毒作用。有人［20］利用上述模型比较评价了8-甲氧补骨脂素( 8-MOP)脂质体凝胶与其等浓度的其他剂型(酊剂、凝胶剂)对白癜风模型豚鼠的疗效,考察了各种药物对动物表皮毛囊黑色素生成、血清胆碱酯酶及皮肤丙二醛(MDA)含量等指标的变化。结果发现8-MOP各种剂型均对造模动物毛囊黑色素生成、血清胆碱酯酶及MDA含量等有明显影响,其中尤以8-MOP脂质体凝胶效果更好。本模型制作中应注意两点:一是脱毛要及时,一般3～4天脱毛1次;再者在涂药时要反复擦,尽量使之渗透,增强脱色效果。
&&& 2.2& 其他常用脱色剂［21］
&&& 2.2.1& 壬二酸& 又名杜鹃花酸，是天然的直链饱和二羧酸-C9 二羧酸。1978年它从糠秕马拉色菌培养液中分离出，并认为花斑癣患者的脱色斑是由它引起的。它可选择作用于功能活跃的黑素细胞，对正常的黑素细胞影响较小。体外试验表明它能抑制酪氨酸酶活性，减少黑素的形成，并对黑素细胞的超微结构有损伤。
&&& 2.2.2& 曲酸& 又名麴酸，使用浓度一般为1%-3%，其脱色机制是酪氨酸酶含有金属铜离子，曲酸能与铜离子螯合，影响酪氨酸酶活性， 从而减少黑素的合成。曲酸的脱色效果比2%氢醌差。
&&& 2.2.3& 油溶性甘草提取物P-T（LPT）及甘草根亭（liquiritin）& 它们均为甘草提取物，它具有脱氧皮质酮样作用，但没有皮质类固醇的副作用。该药脱色原理：（1）甘草根亭的黄酮原子团可离解黑素分子的吡喃环；我们的体外实验研究表明：中药单体甘草酸单胺盐和18a- 甘草酸双胺盐能够抑制酪氨酸酶的活性。（2）抑制黑素的转运功能。LPT在抑制酪氨酸酶活性上比氢醌强16倍。
&&& 2.2.4& 熊果苷（arbutin）& 1988年日本学者Akiu 等从杜鹃花科植物熊果的叶中分离到的具有脱色作用的单体。它是氢醌的一种天然存在形式，分子结构为氢醌-B -D- 葡萄吡喃糖苷，因它含有氢醌基团，其脱色作用可能与此有关。研究发现熊果苷能明显抑制人黑素细胞和B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素产生。
&&& 2.2.5& 皮质类固醇& 皮质类固醇可影响细胞因子和炎症介质的产生，也可能直接作用于黑素细胞影响黑素合成。
&&& 2.2.6& 维A酸& 1975年Kligam 发现痤疮患者用维A 酸治疗数月后局部皮肤颜色减退，以后应用维A酸与氢醌联合应用治疗色素增多性皮肤病取得较好的效果。维A酸脱色作用的机制可能是：（1）在体外培养B16 和S91恶性黑素瘤细胞加入维A酸，会抑制细胞黑素的形成；（2）加速表皮的更替时间，促进含有较多黑素颗粒的表皮，特别是角质层的剥脱，同时，角质层的剥脱更利于脱色药物的渗透；（3）可使黑素细胞和角质形成细胞的接触减少，黑素细胞中黑素颗粒不能及时地输送到角质形成细胞中。
&&& 2.2.7& 维生素C衍生物& 维生素C通过黑素形成的多个环节抑制黑素的产生，如还原黑素中间体和黑素的聚合物，减少多巴和多巴醌类物质形成。但是维生素C在水溶液中和在热与碱性环境中能被快速氧化而失去活性，因此很难用于外用。
&&& 2.2.8& 其他可以产生脱色作用的物质& N-乙酰基-4-S-半胱胺基酚、不饱和脂肪酸、桂皮酸、没食子酸、纤维蛋白溶酶抑制剂、SOD、胎盘蛋白、蛋白多糖、蛋白激酶抑制剂、紫芝、半胱氨酸、蔷薇科植物（如樱花、大叶桂樱）的提取物、山茱萸及西洋甘菊的提取物等均有脱色之效。国外有学者还发现5-氟尿嘧啶与某些增白剂合用，能增强其脱色效果。汞剂原来一直作为常用的脱色剂，但因汞剂能引起外源性褐黄病及对肾及神经系统有较大毒性，目前已弃用。
&&& 以上物质虽然有脱色的作用，但是并没有报道将其用于白癜风模型的制备，目前在临床用于治疗色斑、黄褐斑等。
&&& 3& 脱色法制备动物模型的应用
&&& 龙子江等［22］采用5％氢醌对豚鼠黑色皮肤脱色，初步建立白癜风动物模型，为研究该病提供病理模型，取体重250～300g黑或黑花毛豚鼠60只，随机分成模型组和正常对照组。脱去背部黑毛5cm&8cm。模型组每天涂5％氢醌0．5ml两次，正常组涂自来水。分别于涂药后20、30和40天，各组随机选10只用20％乌拉坦麻醉，腹主动脉抽血做有关生化检测，并于用药部位中心取皮肤1cm&1cm，用中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片，用硫酸亚铁Lillie法进行黑色素染色，随意观察50个毛囊，计算其中有黑色素毛囊数。选用5％氢醌对黑或黑花毛豚鼠实验，结果表明：用5％每醌后，豚鼠皮肤黑色素减少，MAO、Clue、IgG、IgM 和IgA均升高，与临床报道相符。说明用氢醌后，使动物有模拟白癜风的作用。
&&& 另外，龙子江等［15］还用过氧化氢脱色制备了动物模型，用于评价模型中酪氨酸酶含量及血液流变性改变，具体做法如下：取黑色或黑花色豚鼠40只，随机均分为正常组、模型组。脱去黑毛约4cm&4cm后，正常组在脱毛区涂1ml蒸馏水，每天2次；模型组涂5％过氧化氢lml，每天2次，两组连续用药50天，末次用药后40min，用乌拉坦麻醉，自腹主动脉取血。用5%过氧化氢复制白癜风动物模型,该动物血中酪氨酸酶含量明显下降,血液流变性指标明显升高,与正常组比较,有明显差异。说明用化学脱色法复制的白癜风动物模型与临床证型相一致,有代表性。在本模型制作中应注意两点：一是脱毛要及时，一般3～4天脱毛1 次；再者在涂药时要反复擦，尽量使之渗透，增强脱色效果。
&&& 谢勇等［18］用5％过氧化氢制备白癜风动物模型，查考自制祛白酊对白癜风动物模型的治疗效果。杨淑清等［23］用氢醌脱色法制备白癜风动物模型，考察补骨脂素脂质体凝胶对黑素生成及丙二醛含量的影响。
【参考文献】
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作者单位：830002 新疆乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区药物研究所日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年09月06日 中华皮肤科杂志 2007年 40卷 4期210-212
医学空间（）9月6日消息，自体黑素细胞体外培养移植治疗白癜风具有效果好、安全、取较小表皮可以治疗较大面积皮损区的优点。
白癜风(vitiligo)是一种常见多发的色素性皮肤病，该病以局部或泛发性色素脱失，形成白斑为特征。
中华皮肤科杂志四月第四期刊登一项研究，研究者用负压吸疱法在白癜风患者正常皮肤区吸疱取皮，用胰蛋白酶消化皮肤制成细胞悬液，在M2黑素细胞选择性培养基中培养，每周传代1次，经4～5次传代，以免疫荧光和多巴胺染色检测培养细胞的纯度和生物学特性。观察培养的自体黑素细胞移植到白癜风患者皮损区后色素生成效果。探讨自体黑素细胞体外培养扩增和移植治疗白癜风的疗效。
解放军空军总医院临床实验中心王雅静等研究人员研究显示，黑素细胞能在培养基中选择性生长，经4～5周培养，获得纯的黑素细胞，无成纤维细胞和角质形成细胞污染。16例患者28个皮损区接受了移植治疗，病变皮肤面积从2cm^2到200cm^2，1个月后移植区出现部分色素，呈淡红色。所有皮损区在移植后3～5个月均有色素再生，色素水平较周围正常皮肤略深或稍浅，6～8个月时色素恢复稳定。颜色与临近正常皮肤接近。87．5％皮损区色素再生面积超过50％。未见瘢痕和其他不良反应。
因此可见自体黑素细胞体外培养移植治疗白癜风具有效果好、安全、取较小表皮可以治疗较大面积皮损区的优点。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年04月26日 中华皮肤科杂志 2006 Vol.39 No.11 P.639-641
（南京）为了探讨丹皮酚对人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。研究者培养人表皮黑素细胞及人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力，采用酶学方法测定酪氨酸酶活性，475 nm比色法测定黑素含量。结果 50，l00和200μ，mol/L丹皮酚对于黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性抑制作用，100及200μmol/L丹皮酚与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。可见 丹皮酚对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性抑制作用。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年03月30日 中华皮肤科杂志 2006 Vol.39 No.10 P.596-599
（蚌埠）为了研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用。研究者利用胰酶消化游离毛囊和包皮的表皮，分别获取纯化的角质形成细胞和黑素细胞，第3代毛囊角质形成细胞接种于6孔板中，48 h后以表皮黑素细胞：毛囊角质形成细胞为1:2、1:10和1:20的比例接种黑素细胞。在1:10接种体系中，加α-黑素细胞刺激素和烟酰胺，干预6 d后，NKI/beteb单抗染色。结果 毛囊角质形成细胞定植后接种黑素细胞，两种细胞均增殖迅速。以1:10比例接种更能模拟生理状态。1:20接种可清晰观察到黑素细胞树突与角质形成细胞的接触方式。1:2接种可获大量黑素细胞。在单纯黑素细胞和共培养体系中，α-黑素细胞刺激素对黑素细胞增殖无明显影响，但树突明显增多、伸长。烟酰胺对单纯黑素细胞培养无影响，共培养状态下，黑素细胞树突收缩，黑素体聚集在胞体周围。可见 毛囊角质形成细胞与皮黑素细胞接触性共培养，适用于人色素系统的研究。
日期：日 - 来自[]栏目 【概述】
头发的部分或全部变白称白发症（Canities）。
【治疗措施】
目前尚无特殊有效疗法，多以染发为主。
【病因学】
白发是由于黑色素的的生成因黑素细胞、黑素体较少或因酪氨酸酶活性降低所致。
老年头发灰白或变白是一种生理现象，是由于黑素细胞中酪氨酸酶活性进行性丧失而使毛干中色素消失所致。灰发中黑素细胞数目正常，但黑素减少，而白发中黑素细胞也减少。
未到老年的早期灰发或白色常有家族史，表现为常染色体显性遗传，也可见于某些综合征，如早老症（progeria）、Rothrnund综合征和Werner综合征，Waardenbur综合征、肌强直性营养不良（dystrophia myotonia）和B&&k综合征等。
一结严重性疾病，如恶性贫血、甲亢，心血管疾病，如冠心病、心梗，外周动脉疾患，高血压，结核，伤寒，梅毒等可出现白发。
【临床表现】
遗传性白发通常出生时即有，或在儿童期迅速出现。包括全身性毛发变白的白化病和局限性毛发变白的斑驳病等。
老年性白发（Canities Senilis），其白发常从两鬓角开始，慢性向头顶发展。数年后胡须、鼻毛等也变灰白，但胸毛、阴毛和腋毛即使到老年也不变白。
青年人或中年人的早老性白发（Canities prematura），初起只有少数白色，以后逐渐增多。
在一些疾病中，如白癜风，Vogt-Koyanagi综合症、Alezzandrini综合症可有局部白发。
日期：日 - 来自[]栏目 【概述】
白癜风（Vitiligo）是一获得性、局限性或泛发性皮肤色素脱失症，是一影响美容的常见皮肤病。易诊断而治疗难。祖国医学称之为“白癜”或“白驳风”。
【治疗措施】
本病治疗较困难，药物和方法虽多，但疗效不佳，疗程也长，愈后可能复发。
1.补骨脂素（psoralen）及其衍生物& 早在13世纪埃及就有人用一种叫大阿美的植物治疗白癜风。1947年后从中提出三种结晶物质：①δ-甲氧基补骨脂素（δ-methoxypsoralen，δ-MOP,ammoidin）；②δ-异戊烯氧基补骨脂素（δ-isoamylenoxypsoralen,ammidin）；③5-甲氧基补骨脂素（5-methoxypsoralen,majudin）。其中以δ-MOP对产生色素疗效最好。上述均匀光敏性化合物，需辅以日光或紫外线照射。其治疗白癜风机理可能是作用于表皮中与受损细胞邻近尚未完全破坏或正常黑素细胞，刺激其功能，使酪氨酸酶催化黑素合成，促进黑素细胞分裂及移动，使皮色恢复正常。
（1）δ-MOP口服法& 适于白斑多、范围广的患者。每日10～20mg，分2次饭后服，服药2小时后照射阳光和长波紫外线（UVA），称之光化学疗法（PUVA）。一般阳光照射不超过5分钟为宜。一般治疗16～24次才有色素出现，治疗10次以上可达到最佳效果，如连续治疗6～12个月仍无效，可认为无效。药物副作用为食欲减退、贫血、白血细胞减少及中毒性肝炎。故糖尿病、SLE、卟啉病及肝功能不良者忌用。户外活动时间较长时，于活动前3日停止内服。治疗时间忌食酸橙、芹菜、芥菜、胡萝卜等。
（2）δ-MOP外用法&&& 0.2%～0.5%的δ-MOP溶液涂患处，1～2小时后进行光疗。也可用0.1%δ-MOP洗剂或酊剂涂患处，1～2小时后日光或紫外线照射。
（3）三甲基补骨脂素（δ-trimethylpsoralen,trisoralen,TMP），为人工合成，毒性反应较δ-MOP低，其口服剂量每日10～50mg，每日1次，服后2～4小时照射阳光或长波紫外线，儿童酌情减量。无明显副作用，但疗效不可靠，再生色素不持久而需长期治疗。
用光敏性药物时应保护眼，免受紫外线损伤，为此于服药后24小时内带防紫外线的太阳镜，并于傍晚服药。
（4）补骨脂& 为治疗白癜风常用的中药。含补骨脂素，研细后按每100mL含生药30g浸于95%酒精中，5～6天后取其滤液涂患部，之后照射日光或长波紫外线。
2.皮质激素& 皮质激素可能有抑制黑素细胞抗体的作用，使黑素细胞免遭破坏。
（1）系统用药& 以强的松为例，5mg每日3次口服，1.5～2月，显效后2～4周递减1片，至隔日1片，维持3～6月。用药3个月如无效，终止治疗。该法对暴露部位及泛发性损害，尤其对应激状态下皮损发展迅速及伴发自身免疫性疾病者疗效较好。有时用补骨脂素无效者加用激素后可望收效。
（2）局部外用&
①可用含皮质激素的霜剂或溶液涂于白斑处，常用药物如去炎松霜、氯氟舒松霜、恩肤霜等，近年应用的适确得霜获较好疗效。此类药物可引起毛细血管扩张，皮肤萎缩，因此，面部白斑应慎用；②面部注射，应用去炎松混悬液（10mg/mL）白斑内注射，一般每周1次，每次不超过10mg，为防皮肤萎缩，用药不超过6次。
3.铜和锌制剂& 经测定部分患者体内缺乏某些微量元素，如铜、锌，经补充所缺乏之元素后，病情好转乃至痊愈。常用0.5%硫酸铜溶液10mL，以水或牛奶冲淡后服用，每日3次，儿童酌减。也可用硫酸铜溶液在患部作电离子诱入，每日1次。体内缺锌者可服甘草锌0.25g，每日2～3次；或葡萄糖酸锌0.14g，每日2～3次。
4.免疫调节剂& 应用药物有左旋咪唑、转移因子、胸腺素等。左旋咪唑50mg，每日3次，每两周连服3天。转移因子每次皮下注射1～2U，每周2次。胸腺素，每次5～10mg，每周2次。
最近有人报告用环孢素A治疗六例患者，收到较好效果。也有用异丙肌苷的报告。
5.脱色疗法& 当皮损面积大于50%并对药物治疗无反应时；泛发性皮损，尤其裸露部位仅有小片正常皮肤，患者不愿接受色素再生治疗，为美容可行脱色疗法。常用药物为氢醌单苯醚（MBEH），可使黑素细胞发生不可逆转的破坏。为防止其刺激性，初期浓度为10%，每日外用2次，如无刺激反应可在2～3个月内将浓度提到20%。全部脱色需6～24个月。其副作用是皮炎、瘙痒，重者可皮肤干燥、斑秃、头发早白等。用药后至少2～3小时内避免与他人的皮肤密切接触。
6.遮盖疗法& 白斑影响美容时可用人工色素制成的遮盖剂，涂于患处，使其接近正常皮肤。如市售的天姿遮盖霜。我们曾用0.2%～5%二羟基丙酮酒精溶液涂于患部，达到较好效果。
7.外科疗法& 对药物疗法无效者可考虑外科治疗。其禁忌症为增生性瘢痕及瘢痕疙瘩体质。①自体吸疱表皮移植，用（26.66kPa～39.99kPa
200～300mmHg）负压吸引、水疱，剪下含黑素细胞的疱顶表皮，移植于用液氮或局部用PUVA诱发水疱，而去除表皮的皮损部。该疗法的成功取决于白癜风类型、部位及形成水疱的方法。自体吸疱表皮移植不留瘢痕，但操作复杂，需特殊设备。②自体微移植，也称钻孔植皮法，由大腿外侧或上臂内侧的正常皮肤钻孔取皮片；在患部用同法钻孔去皮，将正常皮肤的皮片移植于患部的去皮处，钻孔直径1.5～2mm，移植皮片间距4～5mm，外用少许抗菌素，再用微孔胶带固定，7天后除去敷料。色素再生需手术后3～4周。③自体黑素细胞移植，由患者正常表皮分离出黑素细胞培养，皮肤白斑处负压吸疱后用25号针头吸出疱液，再将培养的黑素细胞悬液注入疱腔，四周后可有色素再生。
8.其他手术方法& ①5-FU/皮肤磨削术，Tsuji等在磨削过的白癜风皮损处外用5-FU霜剂治疗28例，每日2次，共7～10天，64%取得完全的色素再生，作用机制不清。感染及同形反应为其副作用。②微着色法（纹身法），Halder等利用显微处科技术将氧化铁色素植入真皮，近期疗效好，不久即出现色素明显脱失。副作用同上。③活性颜料（vitadye）可用于染色，且可遮盖明显损害。涂饰剂（covermark）是一种能产生多种色调的化妆品，还具良好的遮盖效果。
【病因学】
本病发病原因尚欠清楚。近年来的研究认为与以下因素有关：
1.遗传学说& 有研究认为白癜风可能是一种常染色体显性遗传的皮肤病。国外作者统计30%患者有阳性家族史，发现单卵双生子中两个均发病。国内报道阳性家族史为3%～12%，较国外报道低。
2.自身免疫学说& 自身免疫学说与白癜风的发病关系日益受到重视。许多学者注意到患者及其家族成员中合并自身免疫性疾病比率较高，常见的有甲状腺炎、甲状腺机能亢进或减退、粮尿病、慢性肾上腺机能减退、恶性贫血、风湿性关节炎、恶性黑色素瘤等。而白癜风患者的血清中，有人检出多种器官的特异性抗体，如抗甲状腺抗体、抗胃壁细胞抗体、抗肾上腺抗体、抗甲状旁腺抗体、抗平滑肌抗体等，而且检出率明显高。另外患自身免疫性疾病者，白癜风发病率较一般人群高10～15倍。近来又发现白癜风病人有抗黑素细胞表面抗原的抗体，称为白癜风抗体，其滴度与患者皮肤色素脱失程度有关，滴度随皮损面积扩大而增加，还发现患白癜风的动物也有类似现象，提出该病是黑素细胞的自身免疫性疾病。Behl（1977）发现在进行期白斑边缘有单核细胞聚集，侵入真皮表皮交界处，由破坏的基底膜进入表皮，使该处的黑素细胞及黑素缺如，认为本病可能是迟发超敏反应的自身免疫性疾病。另外，内服或外用皮质激素，特别是不按皮节分布的皮损疗效较好，也间接证明本病的免疫机理。
3.精神与神经化学学说& 许多临床学家发现精神因素与白癜风的发病密切相关，据估计约2/3的患者在起病或皮损发展阶段有精神创伤、过度紧张、情绪低落或沮丧。紧张可致儿茶酚胺类增高，如肾上腺素可直接影响脱色；应激也可使ACTH分泌增加，导致皮质激素分泌增加，而动员糖和游离脂肪酸，刺激胰岛素分泌。胰岛素间接刺激大脑的L-色氨酸增加，使大脑5-羟色胺合成增加，而5-羟色胺的代谢产物为褪黑素，褐黑素受体活动过度在白癜风的发病中起重要作用。褪黑素受体活动过度可增加茶碱酶的活性，这些酶抑制黑素生化，但后期又使其生代活化，导致黑素代谢的毒性中间产物在黑素细胞内蓄积，使黑素细胞死亡，最终引白癜风。有学者观察到白斑处神经末梢有退行性变，而且变化程度似与病程有关，这种现象也支持神经化学学说。
4.黑素细胞自身破坏（self-destruction of melanocytes）学说& 白癜风的基本病变是表皮黑素细胞部分或完全丧失功能。Lerner1971年提出这一学说。认为白癜风是因其表皮黑素细胞机能亢进，促之耗损而早期衰退，并可能是由于细胞本身合成的毒性黑素前身物质的积聚所致。实验证明某些化学物质对黑素细胞有选择性的破坏作用，使皮肤脱色，这些物质多属取代酚类化学物质的脱色剂，如氢醌单苯醚、氢醌、叙丁酚、双氧水等，都对皮肤与毛发有脱色作用。白癜风近年来发病有所增加，可能与工业的发展，接触这类化学物质的机会增加有关。
5.微量元素缺乏学说& 有人提出体内铜含量降低与白癜风发病有关，但测定患者血清与毛发的铜含量似乎与一般人群无显著性差异，有关微量元素学说有待进一步研究。
6.其他因素& 外伤包括创伤、手术、搔抓等可诱发白癜风。某些内分泌疾病，如甲状腺机能亢进、糖尿病等，可伴发白癜风。日光曝晒易发生白癜风。
白癜风的发病学说较多，且均有一定依据，但又都有一定的片面性。目前认为其发病是有遗传因素，又在多种内、外因子作用下，免疫功能、神经与内分泌、代谢功能等多方面机能紊乱，致使酶系统的抑制或黑素细胞的破坏或黑素形成的障碍，而致皮肤色素脱失。
【病理改变】
白癜风皮肤显示表皮黑素细胞及黑素颗粒明显减少或缺如。基底层多巴染色阳性的黑素细胞减少或消失。
【临床表现】
世界各民族中男女均可发病，发病率随地区、人种肤色而异，一段肤色越深发病越多，如美国不足1%，而印度高达4%，我国患病率在0.1%～2%。性别无明显差异，各年龄组均可发病，但以青少年好发，发病年龄在20岁以内者约占半数。全身各部位皮肤均可发病，皮损为局部色素脱失斑，常为乳白色，也可为浅粉色，表面光滑无皮疹。白斑境界清楚，边缘色素较正常皮肤增加，白斑内毛发正常或变白。病变好发于受阳光照晒及磨擦损伤部位，如面部、上腿部、颈部、前臂伸侧及手背部、腰腹及骶尾部、腋下及阴部、肘膝关节等均为好发部位，病损多对称分布。白斑还常按神经节段（或皮节）分布而呈带状排列，此类为单侧发病。除皮肤损害外，口唇、阴唇、龟头及包皮内侧粘膜也常受累。白斑可泛发全身，但视网膜、脉络膜及软脑膜的黑素细胞不受累。有时日晒后白斑区可有色素再生；而冬季时白斑中心或边缘又有色素减退。又约20%患者的白斑对紫外线高度敏感，日晒后白斑快速发展。机械性刺激，如针刺、搔抓、对皮肤的压力（紧身衣、疝托等）及其他局部刺激，如烧伤、感染、晒伤、冻伤、放射线等可使患者的正常皮肤发生白斑，或使原有的白斑扩大，甚或泛发全身的同形反应。白斑数目不定，可很少变化或自行消退，但多数病例表现为白斑逐渐增多、扩大，相邻白斑融合为不规则的大片状，甚至泛发全身。
本病多无自觉症状，少数患者在发病前或同时有患部局部的瘙痒感。白癜风常伴其他自身免疫性疾病，如糖尿病、甲状腺疾病、肾上腺功能不全、恶性贫血、风湿性关节炎、硬皮病、异位性皮炎、斑秃等。
据白斑的形态、部位、范围及治疗反应，临床上将其分为四型：①局限型，白斑单发或群集于某一部位；②散发型，白斑散在、大小不一，多对称性分布；③泛发型，常由上述二型发展而来，病损面积大于体表的1/2；④节段型，白斑按神经节段或皮节分布。据病损处色素脱失情况又可将该病分为完全型与不完全型两种。前者对二羟苯丙胺酸（DOPA）反应阴性，黑素细胞消失，治疗反应差。后者对DOPA反应阳性，黑素细胞数目减少，治愈机率大。
【鉴别诊断】
根据病损特征易于诊断，需与下述疾病鉴别：
1.白色糠疹& 面部的小片状白癜风应与白色糠疹鉴别。白色糠疹白斑边界不清，无周边皮肤色素增加，表面有灰白色糠状鳞屑。
2.花斑癣& 损害发生于后发际、前脑、后背、上肢，为淡白色圆或椭圆形斑，边界不清，表面有细鳞屑，真菌检查阳性。
3.贫血痣& 出生时即已存在，因局部毛细血管缺乏，磨擦患部时周围皮肤发红，白斑处无改变。
4.白化病& 为先天性非进行性疾病，常有家族史，周身皮肤、毛发缺乏色素，两眼虹膜透明，脉络膜色素消失而易区别。
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