mosquito& LCP为一个富有挑战性的手动过程提供了高通量、高准确性和无以伦比的重复性。它固有的灵活性使结晶学中其他气相扩散方法得以开展，为科学家们带来了广泛的选择，可满足任一具体项目。它的精确、可靠和易用让更多的科学家有机会使用到这种新颖的膜蛋白结晶技术。
完整的膜蛋白如G蛋白偶联受体（GPCR）和离子通道，是参与细胞信号通路、细胞稳态和人类疾病的关键分子；大约三分之一已批准的药物靶定了这些蛋白。因此，获得膜蛋白的高分辨率结构信息，以便与分子和细胞数据互补，对科学界和药物开发行业相当重要。
众所周知，膜蛋白很难纯化和结晶，因为它们在天然脂双层之外的环境中不稳定，容易沉淀。正因为如此，使用水溶液的结晶学传统方法不适合它们的重新溶解。在1996年，科研人员开发出一种in meso脂立方相（LCP）技术，实现了细菌视紫红质的结晶1，从那以后也彻底改变了膜蛋白的结晶过程。这种方法为膜蛋白的成核和生长提供了一个框架，从而促进了结晶。
LCP结晶是通过两个步骤开展的。首先，蛋白与脂类混合，自发形成脂立方相，产生了果冻状的高粘稠物质。为了加强结晶，还添加了添加剂和沉淀物，取决于不同条件，结晶一般在数日或数周出现。
结晶试验通常包括在样品上试验的大量条件。高效的结晶试验不仅需要尽可能降低样品体积，以确保宝贵蛋白的最大限度利用，还需要自动化开展，以便减少艰苦的体力劳动并加速平板制备过程。自动化减少了手动移液的误差，并确保了样品均一性。
目前与LCP方法相关的多个技术问题为此过程的自动化带来了挑战。然而，主要问题在于很难准确处理小体积且极为粘稠的立方相材料，直到最近，这一问题才成功解决。
脂类/蛋白相的混合和处理
蛋白和脂类的混合问题是由Martin Caffrey成功解决的，这位科学家目前在都柏林的圣三一学院，他开发出一种方法来连接两个注射器，一个含有脂类，而另一个含有蛋白，这两个注射器由体积连接器相连。注射器之间蛋白和脂类的来回反复混合使得脂立方中间相形成2。
mosquito& LCP移液设备旨在将LCP材料和筛选缓冲液的纳升级分液过程自动化。它是通过TTP LabTech、Gebhard Schertler和Pat Edwards之间的合作项目而开发的。
通过一个可选的LCP混合器，mosquito& LCP为in meso（LCP）技术提供了一个全自动的方案，从而显著提高了设置筛选平板的速度。准确分配纳升级LCP溶液的能力，其体积比手动方法要小得多，节省了宝贵的样品，实现了更多筛选条件的评估。
LCP分液准确性和重复性
mosquito& LCP的可靠性是基于其注射器分液臂和mosquito移液器吸头准确分配LCP液滴和筛选溶液的能力，确保了液滴体积和位置的一致，从而避免了手动误差。
mosquito& LCP融合了已被广泛接受的mosquito& Crystal的特征和功能，将mosquito移液头与微注射器分液器相结合，能将25-2000 nl的LCP材料准确分配至载玻片或市售的平板上。mosquito& LCP与所有SBS形式的平板兼容，包括最近由Schertler小组和SWISSCI开发的LCP平板，它能实现晶体的高效成像。
mosquito& LCP分配体积的分析证明了它的高准确性，对于低至25 nl的体积，误差小于10%。图1表明，对于所有检测的体积，液滴体积的变异系数（CV）百分比小于10%，且随体积增加而逐渐降低。
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&&&&&&&&&&&&结晶--艺术？
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|系统分类:|关键词:GLUT1,葡萄糖转运蛋白,结构生物学|
我刚回清华不久，我的同事刘国松教授曾经跟我说过做科学家的三个境界，他的评论对我至今影响颇深：&1.职业：这是最下乘的，不过把科研当成了谋生手段2.兴趣：当时我以为这已经是科学家的境界了，追求自己的兴趣，多么超凡脱俗！3.永生 （immortal）：当国松说到这一点的时候，我有点被震撼，脑子里立即反映出来的是李白杜甫。在我眼里，他们形已灭，神却随着人类历史而永生。&从事基础科研的科学家何尝不是有这么点虚荣心呢？神龟虽寿，犹有竟时；你的发现留在历史上，作为你的一个标志一直传下去，确实是某种意义上的永生。&于是，我便很小家子气地开始追求自己的工作进教科书，因为学术论文毕竟只有极少数人可以理解；而经典的教科书却是可以让一代又一代人领会的。&今天，与一堆学生约好唱卡拉OK，我忙完手头事情赶过去的时候，却没人；打电话，说都喝醉了，撤了。我笑骂几句，竟然敢放我鸽子，但完全理解。我知道，邓东太不容易，背负了各种压力，太多期望。我以他为傲！&是，我们达到了我来清华时候的第一个目标，做出了想做的！()在我的科研生涯翻篇之际，生怕忘掉过去几个月，写下来，作为纪念。第一篇：结晶&我们做结构生物学的，受到的冷嘲热讽可能仅次于从事测序的：“工匠”，“劳动密集型”。对此，我经常一笑了之，懒得辩解，就算现在这一刻，写到了这里，我脑子瞬间涌出十几条驳斥，依旧懒得写出来，因为没必要。可能，人有时候有点骄傲的矫情了，就懒得解释了。不过，我要强调一点，从我进入结构生物学这一领域之初，我难以忘记的还是大四本科生的时候，第一次听当时普林斯顿的助理教授施一公做报告，他强调的一句话：“对于结构生物学，拿到结构仅仅是起点”。这句话对我的科研影响至深，至今。&不过今天既然是说“结晶”，就连结构生物学的起点还没到。可是我确实对于获得人源葡萄糖转运蛋白的晶体结构有点骄傲，因为这个工作完完全全是按照逻辑一步步拿到的结构，而不是靠“筛选”。&什么叫晶体？就是完完全全同样的分子规则反复的空间排列。如果真有克隆人，完完全全的克隆人规规矩矩地按照一定规则排列，那也是大晶体&但事实是，你在地球上根本不可能找到两个完全一模一样的人，更别说获得人晶了（虽然人精很多）&对于无机的水、食盐，到有机的葡萄糖，要想获得一模一样的亿万分子，很容易，所以结晶也很容易；到了氨基酸、核苷酸这些生物小分子，也还好，不难；但是到了蛋白质、核酸这些巨大分子量的生物大分子，要想命令每一个分子处于一模一样的状态，就开始困难了。可是它们又小到不能从显微镜下直接观察，你还就必须得获得它们的晶体，用X-射线去探索它们的结构（嗯，这句话很有可能被电镜的突飞猛进而推翻。至少，我们GLUT1的分子量还不足以被电镜抓住。所以我一直在笑谈“业界良心”啊）。于是，“结晶”就成了最困难的工作。&结晶受到研究对象的状态、环境的温度、pH、饱和度等等一系列不可控因素的影响，迄今对于大分子的结晶依旧是不可预测的，所以我们总是把这个过程称为“艺术”，而不是“科学”。主要原因不过就是这个复杂过程的规律还没被勘破。&膜蛋白是最难对付的一大类蛋白，也许我需要专门写一篇来详述。所以在Nature、Science上过去几年经常看到的就是某个细菌的某个膜蛋白结构出来了。它们的生理意义真都这么巨大么？非也！因为在你说我“想”做什么之前，还得掂量掂量我“能”做什么。技术瓶颈在这摆着，纵然心比天高，也只能无可奈何。&一年前，我痛下决心。作为一枚吃货，就死磕我“想”的，死磕我们能量来源最重要的葡萄糖如何进入每一个细胞，死磕GLUT1--葡萄糖转运蛋白.&虽然，我对于某个蛋白结晶所需要的环境尚不能预测，可是我了解蛋白本身啊。从以前五年的积累，我们已经知道：1. 转运蛋白最“讨厌”的内在性质就是它们高度动态，你很难让亿万分子静止于某一构象，乖乖结晶。对于GLUT1这个高度活泼的转运蛋白更是如此；2. 我以前的工作总是喜欢加上一个小分子来帮助稳定蛋白的状态，可是对于GLUT1我大概猜出它是“人来疯”，你给它小分子只会让它更疯狂地群魔乱舞，所以必须去掉小分子；3. 敝实验室经过六年的练手练兵，已经找出对付膜蛋白的去污剂的不二之选 -- NG (我经常开玩笑Not Good，NG这个词只有做膜蛋白的人知道是什么意思。您不妨看看我所有的论文，其实这已经是我们摸索出来的规律了，就好比GPCR结晶俩法宝：1. fusion protein 2. LCP，也已经是公认的规律了）；&基于这几点，我们意识到，要想让GLUT1结晶，第一要&搞残”它，让它的动态慢一点，再慢一点，老态龙钟一点，我们就可以咔嚓一下截获其中一个状态了。邓东他们阅读大量文献就为了找到这么一个突变，让GLUT1还能工作，但工作速度慢了几千倍。&另外一个常识就是，低温下，分子运动自然降低，所以我们只选择低温去结晶。还好是冬季，大家本来穿衣服就多，否则蛋白没结晶，人先冻傻了。&事实证明，以上的分析恰恰好。一旦严格按逻辑做事，结晶不过是水到渠成了。&所以，结晶真的是艺术吗？&我很高兴，因为这是一次严密逻辑的胜利。做出来，回头看，不过如此。但在此之前，当你面前有几十几百条路可以走的时候，选哪条路？听从逻辑分析吧。&哦，至于GLUT1到底是啥，还是贴一下科普新闻吧（奉LB之命，为宣传清华大学医学院做贡献，咳咳，敝院成立于2001年，首任院长吴阶平先生，常务副院长也是招我回清华的敬爱的赵南明教授；第二任常务副院长施一公教授；第三任也是现任常务副院长鲁白教授；敝院目前有基础医学系、药学系、生医工程系、临床医学系、以及艾滋中心、公共健康中心等。嗯，要了解更多，请访问敝院主页）&葡萄糖（D-glucose）是地球上包括从细菌到人类各种生物已知最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质；据估算，大脑平均每天消耗约120克葡萄糖，占人体葡萄糖总消耗量的一半以上。葡萄糖代谢的第一步就是进入细胞：亲水的葡萄糖不能自由穿透疏水的细胞膜，其进出细胞需要通过镶嵌于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白完成。其中一类属于主要协同转运蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily，简称MFS）的转运蛋白是大脑、神经系统、肌肉、红细胞等组织器官中最重要的葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，简称GLUTs）。在人体的14个GLUTs中，GLUT1、2、3、4这四种蛋白生理功能最重要，研究最广泛，其中GLUT1因发现最早而得名。&GLUT1几乎存在于人体每一个细胞中，是红细胞和血脑屏障等上皮细胞的主要葡萄糖转运蛋白，对于维持血糖浓度的稳定和大脑供能起关键作用。在已知的人类遗传疾病中，导致GLUT1功能异常的突变会影响葡萄糖的正常吸收，导致大脑萎缩、智力低下、发育迟缓、癫痫等一系列疾病（GLUT1 Deficiency syndrome,又称De Vivo syndrome）。另一方面，当发生癌变时，葡萄糖是肿瘤细胞最主要的能量来源，但是肿瘤细胞由于缺乏氧气供应而只能对葡萄糖进行无氧代谢，同质量葡萄糖所提供的能量不到正常细胞的10%，因而对葡萄糖的需求剧增（这是被称为Warburg Effect的肿瘤细胞代谢现象），在很多种类的肿瘤细胞中都观察到GLUT1的超量表达，以大量摄入葡萄糖维持肿瘤细胞的生长扩增，这使得GLUT1的表达量可能作为检测癌变的一个指标。&葡萄糖跨膜转运的研究历史基本上代表了人类理解物质跨膜运输的历史。将近100年前，就观测到红细胞对葡萄糖的饱和性吸收；起初认为葡萄糖是通过自由跨膜扩散进入细胞的，随着实验证据的积累，1948年，LeFevre等首次提出葡萄糖的进入红细胞的跨膜扩散需要细胞膜上的特定组分（蛋白质）参与；1952年，Widdas等通过对人体红细胞转运葡萄糖的动力学研究提出了饱和运载体机制（saturable carrier mechanism），理论上揭示了细胞膜上运载体（carrier）的存在（尽管之后的研究并不再支持这转运模型，但至今许多跨膜转运蛋白仍然以carrier命名，转运蛋白家族以SLC分类）；1977年，Kasahara和Hinkle从人体红细胞提纯分离出了参与葡萄糖转运的膜蛋白，并实现了脂质体重构功能实验，证实了葡萄糖转运蛋白的存在；1985年，Harvey Lodish实验室首次鉴定出了人体GLUT1蛋白的基因序列，并根据氨基酸序列预测了其具有12次跨膜区的拓扑结构；1991年，De Vivo等首次报道了与GLUT1突变体相关的疾病症状，并将这一大类与GLUT1突变相关的疾病命名为De Vivo 综合症，展示了GLUT1与人类健康的紧密关联。&自从获得了大量生理、病理、细胞、生化信息之后，获取GLUT1的三维结构就变成了该领域最期待的下一个突破。为了结构生物学研究，科学家尝试了从红细胞中、动物组织中直接提取GLUT1或者通过重组表达的方法获取；同时还尝试通过研究GLUT1-4的同源蛋白结构信息来间接理解这些重要的人源转运蛋白。上个世纪80年代，Henderson等报道了数个与GLUT具有序列同源性的细菌糖转运蛋白；90年代，一系列工作报道了GLUT1蛋白在多种表达体系中的重组表达；真正的结构生物学突破发生于2012年，颜宁研究组首次解析了GLUTs的大肠杆菌同源蛋白XylE与葡萄糖结合的高分辨率晶体结构，并利用同源建模预测了GLUT1-4的三维结构；时至今日，人源GLUT1蛋白的晶体结构的捕获为理解这个具有历史研究意义的转运蛋白掀开了新的一章。&颜宁研究组能够在激烈的国际竞争中率先解析GLUT1的晶体结构源于她们对于MFS家族的深入理解和研究积淀。颜宁的实验室在2007年成立之日就将GLUTs作为主要研究对象，然而作为结构生物学领域最为困难的膜蛋白、尤其是真核膜蛋白的研究，首先要培养一支研究队伍。因此她们从相对简单的细菌同源蛋白开始着手，边培养学生边积累经验教训，2010年解析了大肠杆菌中岩藻糖转运蛋白FucP的晶体结构（Dang et al, Nature, 2010），2012年解析木糖转运蛋白XylE的晶体结构（Sunet al, Nature, 2012）。在研究这些同家族糖转运蛋白的结构与机理过程中，她们对于MFS家族的工作机理有了深入了解，分析出GLUT1结晶的瓶颈在于高度动态、结构不稳定。针对这一问题，她们别出心裁，寻找可以将GLUT1锁定于某一构象的致病突变体，同时利用低温结晶进一步稳定蛋白构象，终于克服了GLUT1重组表达、纯化结晶的一系列技术障碍，获得了GLUT1的晶体结构。&GLUT1的三维晶体结构呈现经典的MFS家族折叠方式----12个跨膜螺旋组成N端和C端两个结构域。两个结构域之间的腔孔朝向胞内区，即该结构呈现向内开放构象。而在结晶中用到的去污剂头部恰好是葡萄糖苷，其结合位点与此前XylE中观测到的葡萄糖结合位点基本重合，证实了MFS家族具有单一结合位点。有趣的是，GLUT1在胞内可溶区还具有一个由4个α螺旋组成的结构域（简称ICH），这一序列只在MFS中的糖转运蛋白亚家族中(Sugar Porter subfamily)观察到，因此ICH是属于该家族蛋白的特有结构特征。&利用GLUT1的晶体结构可以精确地定位与疾病相关的突变氨基酸，揭示其致病机理。分析显示，三十余个突变氨基酸基本集中于三个区域：底物结合区域、胞外门控区、胞内门控区，它们的突变或者影响了底物识别，或者影响转运蛋白的构象变化。晶体结构使得理解这些致病突变的机理一目了然。与之前获得的向胞外半开口的XylE晶体结构比较揭示出ICH在GLUT1的构象变化中起关键作用。鉴于ICH在糖转运蛋白亚家族的保守性，这一发现可能适用于该亚家族所有成员。&至此，颜宁实验室分别捕获了FucP向胞外开放，XylE结合底物半开放，GLUT1向胞内开放的三个MFS家族最具有代表性的转运状态结构，结构比对初步揭示出MFS糖转运蛋白在转运循环中的构象变化，对于理解MFS家族糖转运蛋白的转运过程提供了重要的分子基础。&本工作的第一作者邓东博士是PTN博士研究生项目的第一位毕业生，其博士阶段针对TAL effector特异识别DNA分子机制的研究曾经入选2012年Science评选的年度十大进展及2012年度中国科学十大进展。目前邓东为清华-北大生命科学联合中心（CLS）的博士后；共同第一作者徐超和吴建平2012年于清华大学生命学院获得本科学位后加入CLS博士研究生项目，目前为博士二年级；共同第一作者孙鹏程来自生命学院01班，于大二暑假加入其班主任颜宁实验室，即开始参与GLUT1 的结构生物学研究，目前已被CLS录取，将于今年9月正式成为CLS的博士研究生。此外，本科来自于化生基科班、现为生命学院五年级博士研究生的闫创业和本科来自于数理基科班、现为CLS一年级博士生的胡名旭也对本工作做出重要贡献。&本工作获得了自然科学基金委、科技部、CLS的经费支持。颜宁自2012年起受到国家自然科学基金委杰出青年基金和HHMI国际青年科学家项目资助、2013年获得青年拔尖人才计划资助。特别值得一提的是，上海同步辐射光源（SSRF）为及时收集高质量衍射数据提供了必不可少的保障。
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