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人类NK细胞的亚群及其特征
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体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究
14:12:31 作者：华夏医界网 来源： 浏览次数：0
【摘要】　　本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞（PBMNC）得到纯化的NK细胞，随后在干细胞培液基条件下，通过IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组（不加任何细胞因子），分别培养15天，每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后（CD3-CD56+）NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经：miniMACS阴性免疫磁珠分选后（CD3-CD56+）NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除对照组（CD3-CD56+）NK细胞纯度略下降外，其余4组与扩增前无显著性差异（P＞0.05）。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中， NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01），但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异（P＞0.05）。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组，但两组间无显著性差异（P＞0.05）。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后，应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。 【关键词】NK细胞； miniMACS； 白介素2； 白介素12； 白介素15　　Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral BloodAbstractAdoptive immunotherapy using allogeneic natural killer
cellsprovides to be useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation , but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First, theNK cells were isolatedfrom PBMNC by using miniMACS
and NK Cell Isolation Kit Ⅱ.Then the isolated cells were cultured in SCEM
supplemented with 10% human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12, IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days, and were evaluated for cell expansion, phenotype, and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12, cells were expanded 50.46±4.31 and 52.35±6.72fold respectively, muchhigher than others（P＜0.01), but no significant difference between themselves. And the purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P＜0.01), although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group,but no significant difference between themselves . It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.Key word miniMACS ; IL2, IL12, IL1NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。最近在异基因造血干细胞移植中发现供者异源反应性NK细胞可以发挥移植物抗白血病效应，并减少移植物抗宿主病的发生［1-3］，故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植辅助治疗的新策略［4,5］。然而，外周血中NK细胞含量少（约占淋巴细胞的5%-7%），且目前尚缺乏有效的体外扩增体系，所以NK细胞的广泛临床应用受到了限制。目前的许多体外研究均显示IL2、IL12、IL15对促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。本研究从方法学角度探索提高NK细胞纯度并采用IL2、IL12、IL15等细胞因子的不同组合，以期优化NK细胞体外扩增的效率及纯度，为NK细胞的进一步临床应用奠定基础。材料NK细胞分选试剂盒（NK Cell Isolation Kit Ⅱ，包括荧光标记抗体、磁珠）及miniMACS磁珠分选系统、分离柱（MS Column）均购自德国美天意公司（Miltenyi Biotec,Germany）。造血干细胞扩增培养基为Sigma公司产品，RPMI 1640培养液为Gibco公司产品。人AB血清购自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15为Cytolab公司产品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine）为 Sigma公司产品。流式细胞仪及荧光抗体FITCCD3、PECD56、FITCIgG1、PEIgG1均为Becton Dickinson公司产品。CCK8 试剂盒（Cell Counting Kit8，新型细胞检测MTT法改良试剂）购自日本同仁化工。K562细胞为我科实验室长期保存。外周血来源于我院健康献血者。外周血采集与单个核细胞分离健康献血者10名，采集肘静脉外周血20 ml，肝素抗凝，用PBS等体积稀释后，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离得到单个核细胞（PBMNC），PBS洗涤1次。NK细胞分离纯化将上述PBMNC用溶红素处理，然后用MACS buffer洗涤1次，血细胞计数板计数。每107个细胞重悬于40 μlMACS buffer，加入10　μlNK cell biotinantibody cocktail，4-8℃孵育10分钟，然后依次加入30　μl MACS buffer、20　μlantibiotin micro beads，4-8℃孵育15分钟，再次用MACS buffer洗涤标记好的细胞，重悬于500　μl MACS buffer中。选用MS分离柱，安放于miniMACS分离器磁场中，使用前润湿分离柱，将分离柱放置于合适的细胞收集管上。将细胞悬液上柱，用3×500　μl MACS buffer洗柱，收集细胞。纯化前后计数单个核细胞，并以CD3、CD56荧光标记抗体分析NK细胞数，计算细胞回收效率和纯化效率。细胞培养将分离纯化的NK细胞加入含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、青、链霉素（各100 U/ml）及细胞因子的SCEM培养体系内，调至细胞终浓度2×105/ml，然后接种于24孔板，每孔终体积为1 ml；培养体系按细胞因子的不同组合分为4组： A组：IL2（200 U/ml），B组： IL2+IL12，C组：IL2+IL15，D组：IL2+IL15+IL12，E组：不加任何细胞因子为对照组。每组复种3孔，置37℃、5% CO2、饱和温度培养箱中培养，每3天半量换液并全量补充上述细胞因子。于培养第0、5、10、15天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活性。免疫表型分析将取自不同来源的细胞用荧光抗体CD3FITC、CD56PE标记，流式细胞仪检测及分析，了解NK细胞纯度。白血病细胞系的培养K562细胞种于含有10%FCS的 RPMI1640培养体系中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。NK细胞杀伤活性检测收集对数生长期K562细胞及培养第0、15天NK细胞。以K562细胞为靶细胞，调整细胞密度为1×105 /ml；NK细胞为效应细胞，根据不同效靶比分别调整细胞密度为1×105 /ml、5×105 /ml、1×106 /ml。按不同效/靶比（1∶1、5∶1、10∶1 ）将效应细胞与靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养12小时后每孔加入10μl CCK8（ Cell Counting Kit8：新型细胞检测MTT法改良试剂），混匀，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定每孔450 nm波长处的OD值。细胞毒活性的计算方法：求出3个平行孔的平均值，按以下方法计算NK细胞毒活性，以杀伤率%表示。细胞毒活性=［1-（效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值）/靶细胞孔OD值］×100%统计学处理所有数据均以（±SD）表示，组间比较采用方差分析，所有统计学分析均采用CHISS 2004统计软件进行。结果NK细胞纯化效率10名献血者标本显示，2×107个外周血单个核细胞经分选后可获得（2.56±1.23）×106个CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%（图1）。NK细胞增殖情况各组实验条件下NK细胞计数情况见图2。培养期内台盼蓝染色示细胞存活率均为95%以上。培养前5天，各组细胞增殖均较缓慢；最快增殖时间出现于培养第2周，即第7-15天，此阶段各组培养条件下NK细胞均较培养初期显著扩增。培养至第15天IL2组、IL2+ IL12组、IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组NK细胞的扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01）。IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组细胞的扩增倍数显著高于IL2组、IL2+ IL12组（P＜0.01）。在这10例标本中，IL2+IL15+IL12组虽然曾获得一次最大扩增倍数60.8倍，同时平均扩增倍数也略高于IL2+IL15组，但统计学分析显示它们的扩增效率无显著差异（P＞0.05）。
.NK细胞扩增前后免疫表型分析取自于培养第15天的细胞分别标记CD3、CD56抗体，结果显示在含有细胞因子的4组培养体系中，CD3-CD56+NK细胞纯度均大于94%，与开始培养时（0天）NK细胞纯度无显著差异（P＞0.05）。对照组CD3-CD56+NK细胞纯度为83.26±6.39%，较其余各组及培养初始时略有下降（P＜0.05）（图2）。NK细胞对K562细胞的杀伤作用分别比较培养15天后各细胞因子组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞（E0组）对K562细胞的杀伤率的变化。如图3所示：各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且NK细胞对K562 细胞的杀伤活性呈C组≈D组（P＞0.05）＞B组＞A组＞E组（P＜0.01）。随着效靶比从1∶1、5∶1到10∶1，各组NK细胞对K562细胞的杀伤率均逐步提高（P＜0.01）（图3）。讨论目前的研究证实，NK细胞是造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及抗肿瘤免疫中非常有应用价值的效应细胞之一。尤其在造血干细胞/骨髓移植方面，许多的动物实验和临床观察均提示异基因造血干细胞移植后，供者的异源反应性NK细胞可促进植入，阻止T细胞介导的GVHD，攻击宿主白血病细胞发挥GVL效应。故输注供者异源反应性NK细胞已成为临床移植辅助治疗的新策略。如何获得高纯度、足够数量的NK细胞是临床应用的前提条件。虽然国内外有应用ClinMACS直接从供者外周血中分选NK细胞，但用血量大，分选费用昂贵，获得的NK细胞量仍不能满足临床需要，往往需要体外进一步扩增［6］，这些问题均大大限制其临床应用。近年来Carlens［7］、Klingemann［8］、黎阳等［9］国内外学者都曾尝试建立人NK细胞体外扩增体系，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高，应用饲养细胞等问题，这些研究虽然部分的满足了科研的需要，但临床应用问题尚未解决。尤其对于移植免疫中对NK细胞的需要，由于移植前后受者处于特殊的免疫状态中，不同免疫细胞对患者影响不同，故输注时NK细胞的纯度直接关系到输注后的疗效。本研究在前人研究的基础上，先采用miniMACS免疫磁珠分选方法，从正常人外周血中得到高纯度的NK细胞，随后优化NK细胞培养体系进行体外扩增，以降低大量分选NK细胞的昂贵费用。从我们NK细胞分选的实验结果看，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的（11.19±5.25）%提高到（94.23±3.50）%，肯定了经miniMACS高梯度磁场的NK细胞阴性免疫磁珠分选方法的分选效果。进一步优化NK细胞体外扩增体系时，在选用，含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的SCEM培养体系基础上，我们又选择细胞因子IL2、IL12、IL15组成不同的组合。文献报道IL2，IL12，IL15均对于促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。IL2是一种多功能的炎性细胞因子，能够激活NK细胞，诱导NK细胞增殖及细胞因子的产生［10］。IL12最先从人B淋巴母细胞系的培养上清液中发现，它不仅可促进NK细胞的杀伤活性和分泌功能，而且可在体外促进NK细胞的增殖，同时可协同IL2诱导健康成人NK的细胞因子激活的细胞毒作用［11］。IL15在刺激NK细胞增殖及活化等方面与IL2有许多相似性。当然，这与二者都可与IL2受体复合体的β、γ链结合有关。然而，IL15还可结合于1个新的α链，即IL15受体［12,13］，故IL15还在促进造血干细胞定向分化为NK细胞,并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活等方面有显著作用。另外IL2与IL15也具有协同作用。所以，我们根据不同细胞因子组合将培养体系分为4组：IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组，以期筛选出最佳组合。实验结果显示：经过15天的培养，与对照组相比，上述细胞因子均能促进NK细胞的体外扩增，并能保持扩增体系中NK细胞的高纯度；其中IL2+ IL12组虽较IL2组添加了IL12，但增殖效果的提高并不明显，同样情况也可在上述分组的后2组中看到，这说明IL12在体外对NK细胞增殖的促进作用远不及IL2，两者结合并不比单独使用IL2更有效，这与前人的一些实验结果吻合；同时在IL2组与IL2+IL15组的比较中我们看到，IL15与IL2的组合大大提高了扩增倍数，由单独使用IL2 时的15.43±1.08倍增至50.46±4.31倍，说明IL15能显著促进NK细胞的体外扩增，并可协同IL2大大提高扩增效率；而IL2+IL15+IL12组在实验中虽然有1例标本获得了最大增值倍数60.8倍，但统计学结果显示其并不比IL2+IL15组有更好的扩增效率。为了检测所得NK细胞的活性，我们在进一步的实验中分别比较了培养15天后实验组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞对K562细胞的杀伤率的变化。结果各组效靶比与杀伤率呈正比，从1∶1、5∶1到10∶1对K562细胞的杀伤率逐步提高（P＜0.01），这说明在一定条件下，NK细胞杀伤活性存在量效关系。其次，各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且杀伤活性呈IL2+IL15组≈IL2+IL15+IL12组（P＞0.05）＞IL2+ IL12组＞IL2组＞对照组（P＜0.01）；体外扩增后当效靶比为10∶1时，各组对K562 细胞的杀伤率均在60% 以上，其中IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组接近100%。即使当效靶比1∶1时，这两组NK细胞对K562细胞的杀伤率也从扩增前的17%提高到45%，NK细胞活性显著增强（P＜0.01）。另外结果还显示，虽然IL12可增强NK细胞的细胞毒活性，但其效果略逊于IL2及IL15，尤其后二者的组合可在效靶比为10∶1时达到近乎100%的杀伤率。总之，经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后，在含IL2+ IL15的SCEM（含10%人AB血清的）培养条件下，我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增殖倍数较高的NK细胞，同时培养扩增条件简单，成本较低，为NK细胞用于造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫生物治疗奠定了良好基础。【参考文献】1Ruggeri L, Capanni M, Casucci M, et al. Role of natural killer cell alloreactivity in HLAmismatched hematopoietic stem cell transplantation. Blood, -3392Nguyen S, Dhedin N, Vernant JP, et al. NK cell reconstitution after haploidentical hematopoietic stem cell transplants: immaturity of NK cells and inhibitory effect of NKG2A override GvL effect. Blood, : 3董陆佳.KIR基因与异基因造血干细胞移植.中国实验血液学杂志, 8-1144Passweg JR, Stern M, Koehl U, et al. Use of natural killer cells in hematopoetic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant, -6435李晓红，高春记.异基因造血干细胞移植中NK细胞的作用.中国实验血液学杂志, 0-3546Koehl U, Esser R, Zimmermann S，et al. Ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klin Padiatr, -3507Klingemann HG, Martinson J. Ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications. Cytotherapy, -228Carlens S, Gilljam M, Chambers BJ，et al. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells. Hum Immunol, 2-10989黎阳，黄绍良，吴燕峰等.联合使用干细胞因子、FLT3配基与白介素2，7，15体外扩增人脐血来源CIK/NK细胞.中国实验血液学杂志, 0-35410Mirandola P, Ponti C, Gobbi G，et al. The response of human natural killer cells to interleukin2. J Endocrinol Invest, -15011Carson WE, Giri JG, Lindemann MJ, et al. Interleukin
15 is a novel cytokine that activates human natural killer cells via components of the IL2 receptor. J Exp Med, 95-140312Lin SJ, Chao HC, Yan DC. Phenotypic changes of Tlymphocyte subsets induced by interleukin12 and interleukin15 in umbilical cord vs peripheral blood mononuclear cells. Pediatr. Allergy Immunol, -2613Lin SJ, Yang MH, Chao HC, et al. Effect of interleukin15 and Flt3li
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NKG2D配体在不同发育阶段DC的表达其对NK细胞杀伤活性的影响.pdf57页
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南方医科大学 硕士学位论文
NKG2D配体在不同发育阶段DC的表达及其对NK细胞杀伤活性的影 响 姓名：涂三芳 申请学位级别：硕士 专业：内科血液病学 指导教师：郭坤元 座机电话号码 硕士学位论文
NKG2D配体在不同发育阶段DC的表达及 其对NK细胞杀伤活性的影响 硕士研究生：涂三芳 指导导师：郭坤元教授 摘 要
研究背景与目的： killer 自然杀伤细胞 Naturalcell，NK细胞 是天然免疫系统的主要效应细
胞，对病源感染和转化了的细胞具有自然细胞毒效应。NK细胞表达的受体与靶
细胞表面的配体通过遗传模式识别发挥效应。NK细胞杀伤靶细胞受活化性信号
和抑制性信号共同调节起作用。其中NKG2D-NKG2D配体为NK细胞主要活化
性信号之一，NKG2D配体主要包括包括MHC．I类链相关分子A或B和人巨细
胞病毒ULl6蛋白的结合蛋白两大类。 ’ 树突状细胞 dendriticcell，DC 是机体免疫系统中最重要的抗原提呈细
胞，在获得性免疫应答起着重要的作用。根据发育阶段不同可分为未成熟树突 dendritic dendritic cell，
状细胞 immaturecell，iDC 和成熟树突状细胞 mature
mDC 。它们在形态、表型和功能上均有所不同。 近年来研究表明DC与NK细胞在天然免疫早期存在相互作用。一方面DC
可增强NK细胞的杀伤的活性，提高NK细胞的数量。另一方面NK细胞可杀伤
机制未完全明确。此外Rugged等人的研究表明在异基因造血干细胞移植中通过
输注HLA．KIR错配的供者NK细胞可提高移植物抗白血病效应效应，同时能降 versushost
低移植物抗宿主病 Graft disease，GVHD 。进一步推测同种异体反 中文摘要 Natural
应性自然杀伤 Allo．reactive
来降低GVHD效应，但是其是否真能杀伤受者DC，杀伤哪个阶段DC以及杀伤
机制未做进一步研究。
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IL2、IL12、IL15的不同组合对人外周血源NK细胞功能的影响,nk t 淋巴瘤 外周血,外周血单个核细胞,外周t细胞淋巴瘤,外周血单核细胞,外周血淋巴细胞,外周血干细胞移植,外周血单核细胞分离,外周血干细胞,外周血淋巴细胞分离
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