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即送15丁当
【求助】sumo protease 切割sumo tag 的融合蛋白
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这个帖子发布于5年零193天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位老师：
小女子用pCold-SUMO原核表达载体表达了大小43kD的含SUMO标签的融合蛋白，通过NI柱HIS标签纯化后，蛋白洗脱在250mM咪唑、20mM Tris-HCl pH 8.0、500mM NaCl溶液中。蛋白浓度约0.46mg/mL,SDS-PAGE胶检测纯度很好，只有融合蛋白的目的条带。然后按照sumo protease 酶切融合蛋白，优化酶切体系（100mM、125mM、150mM、180mM、210mM、240mM、300mM NaCl),各种酶切温度（4℃、16℃、30℃），酶量加倍酶切，结果只能切下极微量的目的蛋白。已经换过一只sumo protease.
请老师们帮我分析一下酶切效率低的原因。十分感谢！
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酶切时，有多少目的蛋白，多少酶，酶单位定义如何，酶切体系体积多少，多少时间，上样多少。如果是 invitrogen 的 SUMO protease，根据他们的 unit 定义， One unit of SUMO Protease cleaves ≥85% of 2 μg control substrate in 1 h at 30°C.
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谢谢，本人已找到酶切不开的原因了，甘油的浓度严重影响其酶切活性。另外该酶反复冻融似乎很容易失活。
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反复冻融？不是存储在-20°C 的吗？还有可以说说甘油浓度是怎么影响其效率的么？学习一下。
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请问大家找到切不动的原因是什么了吗？
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关于丁香园参考文献：
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即送15丁当
【求助】求助呀，融合蛋白表达只表达了SUMO标签，我的目的蛋白没有表达，求回复...
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这个帖子发布于2年零285天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
具体说一下，我的目的蛋白前面有一段12个氨基酸的小短肽，目的蛋白加这个短肽共44KD，将这些连接到pET28a-sumo载体上，测序表明载体构建成功，无提前终止密码子，转入BL21(DE3),0.5mM IPTG诱导过夜，发现只有载体上的sumo蛋白被诱导大量表达了，后面我的目的蛋白没有表达，什么原因呀？
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其其格58 具体说一下，我的目的蛋白前面有一段12个氨基酸的小短肽，目的蛋白加这个短肽共44KD，将这些连接到pET28a-sumo载体上，测序表明载体构建成功，无提前终止密码子，转入BL21(DE3),0.5mM IPTG诱导过夜，发现只有载体上的sumo蛋白被诱导大量表达了，后面我的目的蛋白没有表达，什么原因呀？在Sumo的哪一端？做过几次实验？有WB验证吗？
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在sumo的C端，做过两次诱导，抗体年后才能买到没做WB，诱导前后比较可以明显看到诱导后sumo表达了而且量很大，目的蛋白条带没有出现，现在怀疑是不是蛋白前面的12个氨基酸的短肽造成了蛋白不表达
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其其格58 在sumo的C端，做过两次诱导，抗体年后才能买到没做WB，诱导前后比较可以明显看到诱导后sumo表达了而且量很大，目的蛋白条带没有出现，现在怀疑是不是蛋白前面的12个氨基酸的短肽造成了蛋白不表达 上图片？
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其其格58 edited on
其其格58 暂时还不好下定论。看上去载体构建正常，表达诱导正常。初步思考如下：1）12个aa的短肽是什么情况，是载体带的，还是你自己特别加的，序列有特别吗？一般载体上的片段对蛋白表达影响较小。2）如果你的实验没什么问题，看上去可能是目的蛋白自身的原因。不知LZ做的是什么蛋白？不是膜蛋白等不好表达蛋白吧。如果是，出现只表达sumo的可能性是有的。
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12个aa的短肽是自己加在前引物上和我的目的蛋白基因通过PCR连接在一起后又连接到pET28a-sumo载体上的，是一段用来穿膜转运我的目的蛋白的序列，有较强的疏水性，基因序列为GCA，GCC，GTT，CTT，CTC，CCT，GTT，CTT，CTT，GCC，GCA，CCC我的目的蛋白在没加这段序列在pET28a-sumo载体上是可以表达的之前做过，加上这段序列就出现上面的现象了
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SUMO蛋白酶：能识别完整的SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。与EK和TEV等蛋白酶的识别位点相比，由于其识别序列长，所以SUMO蛋白酶酶切反应有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力，例如温度（4-30℃）、pH（5.5-9.5）等。SUMO蛋白酶还具有多聚His 标签，便于融合蛋白切割后利用亲和层析去除该蛋白酶。（备注：可与我公司多种带SUMO标签的表达载体配套使用）。
CoolCutter& SUMO Protease (SUMO蛋白酶)
识别位点长 特异性强
适应多种反应条件 可低温切除
带有His标签 便于纯化
完整切除 得到天然蛋白
CoolCutterTM SUMO
100ul(2U/ul)
生物素连接酶 (Biotin Ligase)能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白（如AviTag 融合蛋白）上，使标签蛋白生物素化（备注：可与我公司多种带AviTag(TM) 标签的表达载体配套使用AviTag是15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端，融合表达后，在体内或体外均可被生物素连接酶生物素化。）。
Biotin Ligase
与化学生物素标记法相比，生物素AviTag标签系统具有以下几大优点：
无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化；
由于此类生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；
每一个AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小。
Biotin ligase催化的生物素化应用实例：选取数个基因，表达载体为WG05，同时含有6×His Tag、Sumo与AviTag
通过AviTag进行生物素化的重组蛋白示意图
CleanerTM Nuclease
GeneCopoeia非特异性核酸酶CleanerTM Nuclease是一种来源于粘质沙雷氏菌的基因工程内切核酸酶，由大肠杆菌重组表达纯化而来。在结构上，这个蛋白是一个含有245个氨基酸，携带2个关键二硫键的30 KD亚基的二聚体。该酶可降解所有形式的DNA和RNA（单链、双链，线性或环状的），并且在很宽泛的条件范围内有效。该酶可完全消化核酸至5'-磷酸为末端的寡核苷酸中的2～5个碱基。虽然该核酸酶可以几乎消化核苷酸链的所有位置，但还是有一定的序列特异性，更倾向于双链DNA的GC富集区域，而避开富含AT的区域。本产品具有高特异性活性，不含蛋白酶活性和病毒污染物，是一种理想的、广泛应用的、可完全消化核酸的核酸酶。
CleanerTM Nuclease
10,000 U（40 ul）
50,000 U（200 ul）
产品应用实例：从重组蛋白中除去核酸；在蛋白提取时降低菌液粘度；2D凝胶电泳的样品准备。
Nuclease 对核酸的降解
Nuclease 减少粘稠度
包含一个pET的E.coil BL21(DE3) 细胞悬浮在GeneCopoeia试剂中(5 ml/g 湿重)。悬浮样品在室温下用一定量的Nuclease处理30分钟，离心澄清样品后琼脂糖凝胶电泳。
包含一个pET的E.coil BL21(DE3) 细胞悬浮在GeneCopoeia试剂中(5 ml/g 湿重)。悬浮样品在室温下用一定量的Nuclease处理10分钟，377×g离心3分钟后拍照。
这些编码基因的ORF 区域完全测序并保证序列，可直接用于蛋白表达， 不需要亚克隆步骤，以及 最优的蛋白翻译骨架设计，让您的蛋白表达更轻松。
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