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, December 2016, Pages 258–270
Effects of branch removal on water use of rain-fed jujube (Ziziphus jujuba Mill.) plantations in Chinese semiarid Loess Plateau region, , , , , , , , , a College of Water Resources and Architectural Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, Chinab Institute of Soil and Water Conservation, Chinese Academy of Sciences and Ministry of Water Resources, Yangling 712100, Chinac Institute of Soil and Water Conservation, Northwest A & F University, Yangling 712100, Chinad Department of Water Conservancy, Yangling Vocational & Technological College, Yangling, Shaanxi 712100, Chinae Shaanxi Center for River Engineering Research, Xian 710018, China&Jujube, a drought tolerant plant which was seldom studied, was used as material.&Branch removal is an effective way to control soil drying in jujube plantation.&Branch removal decreased stand transpiration and total ET during growth seasons.&Branch removal decreased fresh fruit yield, but maintained an acceptable yield.&Branch removal decreased average vessel lumen diameters.As a drought tolerant plant, jujube (Ziziphus jujuba Mill.) is commonly planted in Chinese semiarid Loess Plateau Region under rain-fed conditions. To evaluated the effectiveness of branch removal to conserve water resources in rain-fed jujube plantations in the region, two degrees of branch removal treatments (T1&two m T2&one main branch removed) were compared with control treatment (none of the three main branches removed) and the effects on water use in Jujube plantations were analyzed. Sap flow was monitored (using the Granier-type thermal dissipation probes) along with meteorological factors, soil water content, vessel diameter, crown projection area and leaf area index, with soil moisture condition divided into water stress and non-water stress. Results showed that branch removal was an efficient way of conserving water resources in jujube plantations. a) It improved soil water content by reducing water loss via total evapotranspiration (ET) during jujube growth period. Total ET values were 452, 463 and 478 mm respectively for T1, T2 and the control treatments during jujube growth period in , 426 and 451 mm respectively for T1, T2 and the control treatments during jujube growth period in 2013 and 374, 381 and 392 mm respectively for T1, T2 and the control treatments during jujube growth period in 2014. b) Branch removal not only decreased transpiration per unit ground area (stand transpiration: Tg), but also increased the sensitivity of Tg to environmental variables. In contrast, the removal of two (out of three) branches increased transpiration per unit leaf area (leaf transpiration: Tl), making it less sensitive to soil water content. c) Treatment T1 significantly increased the sensitivity of canopy conductance (Gc) to vapor pressure deficit (VPD), which effect was not significant under T2. Isohydric regulation of water loss through Gc response to VPD was the same for the three treatments, regardless of the different tree canopy sizes and soil water conditions, but reference canopy conductance (Gcref: canopy conductance at VPD = 1 kPa) was treatment-specific. d) Branch removal improved the tolerant of jujube tree to negative water potential and xylem cavitation by decreasing average vessel lumen diameters. Compared with the control, both branch removal treatments (T1 and T2) resulted in a significant decrease in average vessel lumen diameter at 15 mm below the cambium (40.74, 42.53 and 46.81 μm respectively for T1, T2 and the control treatments). Similarly, T1 and T2 reduced mean vessel lumen diameter at 5 mm below the cambium (43.20, 47.44 and 48.39 μm respectively for T1, T2 and the control treatments). e) Branch removal significantly decreased the fresh fruit yield and water use efficiency except in 2013, during which differences were not significant. Fresh fruit yield values were
and 11293 kg ha&1 respectively for T1, T2 and the control treatments in , 5426 and 6000 kg ha&1 respectively for T1, T2 and the control treatments in , 8341 and 10589 kg ha&1 respectively for T1, T2 and the control treatments in 2014. WUE values were 1.79, 1.94 and 2.36 kg m&3 in , 1.28 and 1.33 kg m&3 in , 2.19 and 2.70 kg m&3 in 2014. T1 treatment was recommended in terms of improving soil water storage as well as maintaining a certain amount of productivity in jujube plantations in Chinese semiarid Loess Plateau Region. The result of the study is critical for the development of effective water management strategies in jujube plantations ensure that the fragile ecology of the Loess Plateau is sustained.KeywordsBranch removal; Soil desiccation; Water use; Rain-fed jujube plantation; Semiarid region
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This article has not been cited.
No articles found.114网址导航CONJUGATES OF FLU VIRUS M2 OR HA2 FRAGMENTS AND PROTEIN CARRIERS, AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF
WIPO Patent Application WO/
Provided are a conjugate of fragments of the extracellular domain of flu virus M2 protein and protein carriers as well as a conjugate of fragments of amino acids 18-72 of flu virus HA2 protein and protein carriers. The fragments and carriers are linked covalently via disulfide bonds. Also provided are vaccines comprising the conjugates. The vaccines are suitable for large scale preparation.
Inventors:
LI, Xianzhong (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
李先钟 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
ZHANG, Qi (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
张琪 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
WANG, Xin (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
王鑫 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
SUN, Yushi (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
孙宇石 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
LIU, Fangjie (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
刘方杰 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
Application Number:
Publication Date:
12/15/2011
Filing Date:
06/10/2011
Export Citation:
BEIJING JINGYITAIXIANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
北京精益泰翔技术发展有限公司 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
LI, Xianzhong (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
李先钟 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
ZHANG, Qi (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
张琪 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
WANG, Xin (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
王鑫 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
SUN, Yushi (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
孙宇石 (中国北京市经济技术开发区中和街14号B座303室, Beijing 6, 100176, CN)
LIU, Fangjie (B-303, No.14 Zhonghe Street, BDA, Beijing 6, 100176, CN)
International Classes:
C07K14/11; A61K39/145; A61K39/385; A61K47/42; A61K47/48; A61P31/16
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Domestic Patent References:
Foreign References:
CN1756562ACNA
Attorney, Agent or Firm:
DRAGON INTELLECTUAL PROPERTY LAW FIRM (Maples International Center 10F, Bldg. 2No.32 Xizhimen North Street,Haidian District, Beijing 2, 100082, CN)
权利 要求 书
1. 一种预防流感的 M2e-载体蛋白偶联物， 其特征在于， 所述蛋白偶联 物由甲型流感病毒 M2蛋白质的胞外结构域 M2e与载体蛋白化学偶联而成， 其中，所述的 M2e与载体蛋白通过硫醚键共价连接，所述的 M2e的氨基酸序 列是如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、 如 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸 序列或者如 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列：
SLLTEVETPTRXaa!EWEXaazRXaagSDSSDC [SEQ ID NO: 2]
Xa 为苏氨酸、 异亮氨酸或丝氨酸；
Xaa2为丝氨酸、 天冬氨酸或半胱氨酸；
Xaa3为半胱氨酸、 丙氨酸或丝氨酸；
所述的载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K; 所述 P64K的氨基酸 序列是如序列表中 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
2. 根据权利要求 1所述的蛋白偶联物， 其特征在于， 所述的 M2e的氨 基酸序列是如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 如 SEQ ID NO: 7所示的 氨基酸序列或者如 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求 1所述的蛋白偶联物， 其特征在于， 所述的 M2e的氨 基酸序列是如 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
4. 权利要求 1-3中任意一项所述的蛋白偶联物的制备方法， 所述方法包 括先将载体蛋白用活化剂活化，再与 M2e混合，反应得到蛋白偶联物； 其中， 所述的 M2e与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.5-7.5;
所述偶联反应的时间为 18-36小时；
所述的活化剂选自 SMCC、 MBS和 sulfo-MBS的任意一种。
5. 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于， 所述的 M2e与载体蛋白 的比例为 12: 1至 18: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.8-7.2;
所述偶联反应的时间为 24小时； 所述的活化剂为 SMCC。
6. 一种广谱型流感疫苗， 其特征在于， 所述的疫苗含有权利要求 1-3中 任意一项所述的 M2e-载体蛋白偶联物和佐剂。
7. 一种 HA218_72-载体蛋白偶联物， 其特征在于， 所述蛋白偶联物是由禽 流感 H5N1病毒 HA218_72多肽与载体蛋白化学偶联而成，其中，所述的 HA218_72 多肽与载体蛋白通过硫醚键共价连接， 所述的 HA218_72多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列； 所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜 蛋白 P64K、 破伤风类毒素、 乙肝核心抗原、 匙孔血蓝蛋白、 轮状病毒衣壳蛋 白和牛或人乳头瘤病毒 VLP的 L1蛋白的任意一种。
8. 根据权利要求 7所述的蛋白偶联物， 其特征在于， 所述的载体蛋白为 脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 Ρ64Κ, 所述 Ρ64Κ的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 5 所示的氨基酸序列。
9. 根据权利要求 7所述的蛋白偶联物， 其特征在于， 所述的 HA218_72多 肽是经基因工程菌表达而来；
所述 HA218_72多肽编码基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 4所 示；
所述基因工程菌为大肠杆菌 Ecoli.BL21。
10. 根据权利要求 7-9中任意一项所述的蛋白偶联物的制备方法， 是先 将载体蛋白用活化剂活化， 再与适当比例的 HA218_72多肽混合， 反应得到蛋 白偶联物； 其中， 所述的 HA218_72多肽与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.5-7.5;
所述偶联反应的时间为 18-36小时；
所述的活化剂选自 SMCC、 MBS, sulfo-MBS的任意一种。
11. 根据权利要求 10所述的方法， 其特征在于， 所述的 HA218_72多肽与 载体蛋白的比例为为 12: 1至 16: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.8-7.2;
所述偶联反应的时间为 24小时；
所述的活化剂为 SMCC。
12. 一种广谱型流感疫苗， 其特征在于， 所述的疫苗含有权利要求 7-9 中任意一项所述的偶联物和佐剂。
13. 一种广谱型流感疫苗， 其特征在于， 所述的疫苗含有权利要求 1-3 中任意一项所述的 M2e-载体蛋白偶联物和含有权利要求 7-9中任意一项所述 的 HA218_72 -载体蛋白偶联物和佐剂。
Description:
流感病毒 M2或 HA片段与蛋白载体的缀合物及其制药应用
本发明涉及蛋白偶联物及其制备方法， 以及包括该蛋白偶联物的广谱型 流感疫苗， 特别是涉及 M2e/HA218_72-载体蛋白偶联物及其制备方法， 以及包 括所述两种载体蛋白偶联物至少之一的广谱型流感疫苗。 背景技术
流感病毒株具有高度变异性， 因此， 需要研制对不同血清型 （例如甲型 流感病毒 H1N1、 甲型流感病毒 H3N2、 甲型流感病毒 H5N1 (又称禽流感） 等） 的流感病毒均有预防保护效果的广谱型流感疫苗。 目前的流感疫苗一般 以包括高度保守的抗原片段， 例如：
Merck 公司开发出预防流感的偶联物， 如 USA1 和 CN1756562A利用流感病毒中高度保守的，具有预防保护效果的抗原片段 M2e 和 HA0蛋白质与载体蛋白 OMP偶联。
Acambis公司开发出 M2e-HBc VLPs,如 US 和 CN1913920A, 同样利用流感病毒的 M2e片段， 与乙肝核心抗原通过化学偶联形成抗流感病 毒的嵌合体分子颗粒。
然而， 现有流感疫苗的广谱性仍然需要提高， 尤其是目前全球流感形势 严峻， 新的流感病毒株如禽流感病毒 (H5N1)和甲型流感病毒 (H1N1)不断出 现， 而且存在病毒重组产生新的、 高致病性二代病毒的危险， 已有的疫苗对 新出现的病毒没有预防保护效果。 因此， 急需采用全新技术路线， 研制广谱 型的、 对甲型 （H1N1 )流感、 禽流感（H5N1 )、 该两种病毒重组产生的二代 病毒和季节性流感病毒都具有预防保护效果的流感疫苗， 彻底控制、 消除流 感的危害。 发明内容
本发明的目的在于克服现有流感疫苗光谱性差的缺陷， 提供一种利用流 感病毒中高度保守、 具有预防保护效果的抗原片段 M2e或 HA218_72与载体蛋 白 P64K化学偶联， 开发出广谱型的流感疫苗， 该疫苗能够有效的应对各型 流感病毒， 由该偶联物制备的广谱型疫苗易于大规模生产制备， 且有效周期 长， 可以大量储备。 克服了传统流感疫苗研制、 生产技术路线的不足， 从而 实现对各种流感病毒引发的疫情及时、 有效地控制。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种预防流感的 M2e-载体蛋白偶联物， 其中， 所述蛋白偶 联物由甲型流感病毒 M2蛋白质的胞外结构域 M2e与载体蛋白化学偶联而 成， 其中， 所述的 M2e与载体蛋白通过硫醚键共价连接， 所述的 M2e的氨基 酸序列是如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、 如 SEQ ID NO: 7所示的氨 基酸序列或者如 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列：
SLLTEVETPTRXaa!EWEXaazRXaagSDSSDC [SEQ ID NO: 2]
Xa 为苏氨酸、 异亮氨酸或丝氨酸；
Xaa2为丝氨酸、 天冬氨酸或半胱氨酸；
Xaa3为半胱氨酸、 丙氨酸或丝氨酸；
所述的载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K; 所述 P64K的氨基酸 序列是如序列表中 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
本发明还提供了以上所述的 M2e-载体蛋白偶联物的制备方法， 所述方法 包括先将载体蛋白用活化剂活化， 再与 M2e混合， 反应得到蛋白偶联物； 其 中， M2e与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.5-7.5;
所述偶联反应的时间为 18-36小时；
所述的活化剂选自 SMCC、 MBS和 sulfo-MBS的任意一种。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 M2e-载体蛋白偶联物和佐剂。
本发明还提供了一种 HA218_72-载体蛋白偶联物， 其中， 所述蛋白偶联物 是由禽流感 H5N1病毒 HA218_72多肽与载体蛋白化学偶联而成， 其中， 所述 的 HA218_72多肽与载体蛋白通过硫醚键共价连接， 所述的 HA218_72多肽的氨 基酸序列为 SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列； 所述的载体蛋白选自脑膜炎 奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K、 破伤风类毒素、 乙肝核心抗原、 匙孔血蓝蛋白、 轮 状病毒衣壳蛋白和牛或人乳头瘤病毒 VLP的 L1蛋白的任意一种。
本发明还提供了以上所述的 ΗΑ218_72-载体蛋白偶联物的制备方法， 是先 将载体蛋白用活化剂活化， 再与适当比例的 ΗΑ218_72多肽混合， 反应得到蛋 白偶联物 ΗΑ218_72; 其中， 所述的 ΗΑ218_72多肽与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1;
所述偶联反应的 ρΗ值为 6.5-7.5;
所述偶联反应的时间为 18-36小时；
所述的活化剂选自 SMCC、 MBS, sulfo-MBS的任意一种。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 HA218_72载体蛋白偶联物和佐剂。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 M2e-载体蛋白偶联物和含有本发明所述的 HA218_72 -载体蛋白偶联物和 佐剂。
包括本发明的 M2e-载体蛋白偶联物和 /或 HA218_72-载体蛋白偶联物的广 谱型流感疫苗的毒副作用小，安全性高，耐受性好，能够有效预防甲型 H1N1 , 禽流感 H5N1 流感病毒的感染， 甚至还能有效其他病毒亚型的感染， 广谱性 好。 用本发明的疫苗免疫小鼠， 能够诱导小鼠产生高水平的抗体， 并能保护 免疫小鼠对病毒的致死剂量攻击。 附图说明
图 1为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 图；
图 2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K的反相色谱图谱；
图 3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K的肽谱（胰蛋白酶）；
图 4为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K的电泳图谱；
图 5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K的质谱分析图谱；
图 6为 M2e的反相高效液相色谱图谱； 图 7为 M2e的质谱分析图谱；
图 8为 M2e-P64K偶联物的 SDS凝胶电泳图；
图 9为 M2e-P64K偶联物的凝胶色谱图；
图 10为 HA2 ( 18_72) PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图 11为 HA2 ( 18_72)的载体构建；
图 12为 HA218_72的 Mono Q纯化过程图谱；
图 13为 HA218_72的 SOURCE纯化过程图谱；
图 14为 HA218_72的 SDS-PAGE图谱；
图 15为 HA218_72的反相高效液相色谱图；
图 16为 HA218_72-P64K的 SDS-PAGE图谱；
图 17为 HA218_72-P64K的凝胶色谱图；
图 18为 M2e-P64K偶联物的免疫原性分析： 抗体效价图；
图 19为 M2e-P64K偶联物的免疫原性分析： 抗体亚型鉴定图； 图 20为 M2e-P64K偶联物的免疫原性分析： 血清交叉反应；
图 21为 HA218_72- P64K偶联物的免疫原性分析： 抗体效价图； 图 22为 M2e- P64K偶联物对小鼠 PR8株流感病毒攻击保护效果图； 图 23为 M2e- P64K偶联物对禽 H5N1攻击保护效果图。 具体实施方式
本发明提供了一种预防流感的 M2e-载体蛋白偶联物， 其中， 所述蛋白偶 联物由甲型流感病毒 M2蛋白质的胞外结构域 M2e与载体蛋白化学偶联而 成， 其中， 所述的 M2e与载体蛋白通过硫醚键共价连接， 所述的 M2e的氨基 酸序列是如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、 如 SEQ ID NO: 7所示的氨 基酸序列或者如 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列：
SLLTEVETPTRXaa!EWEXaa2RXaa3SDSSDC [SEQ ID NO: 2]
Xa 为苏氨酸、 异亮氨酸或丝氨酸；
Xaa2为丝氨酸、 天冬氨酸或半胱氨酸；
Xaa3为半胱氨酸、 丙氨酸或丝氨酸； 所述的载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K; 所述 P64K的氨基酸 序列是如序列表中 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。 其中， 优选编码 P64K 的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 6所示。
进一步优选地， 所述的 M2e来源于甲型流感病毒 H1N1 , 具有如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列： SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDC [SEQ ID NO: 1] , 甲型流感病毒 H3N2 具有如 SEQ ID NO : 7 所示的氨基酸序列： SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDC [SEQ ID NO: 7] , 或者甲型流感病毒 H5N1 ( 即禽流感） 具有如 SEQ ID NO : 8 所示的氨基酸序列： SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDC [SEQ ID NO: 8]。 最优选地， 所述的 M2e 来源于甲型流感病毒 H3N2 具有如 SEQ ID NO: 7 所示的氨基酸序列： SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDC [SEQ ID NO: 7]。
优选地， 本发明所述的 M2e优选由固相合成法得到。
本发明还提供了以上所述的 M2e-载体蛋白偶联物的制备方法， 所述方法 包括先将载体蛋白用活化剂活化， 再与 M2e混合， 反应得到蛋白偶联物； 其 中， M2e与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1;
所述偶联反应的 pH值为 6.5-7.5;
所述偶联反应的时间为 18-36小时；
所述的活化剂选自 SMCC、 MBS和 sulfo-MBS的任意一种。 其中 SMCC 全称为 Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cy dohexane- 1 -carboxylate , MBS 全称为 m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester , sulfo-MBC全称为 m -maleimidobenzoyl- N-hydroxysulfosuccinimide ester。
优选地， 所述的 M2e与载体蛋白的比例为 12: 1至 18: 1 , 更优选 15:1; 所述偶联反应的 pH值为 6.8-7.2; 所述偶联反应的时间为 24小时； 所述的活 化剂为 SMCC。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 M2e-载体蛋白偶联物和佐剂。
本发明还提供了一种 HA218_72-载体蛋白偶联物， 其中， 所述蛋白偶联物 是由禽流感 H5N1病毒 HA218_72多肽与载体蛋白化学偶联而成， 其中， 所述 的 HA218_72多肽与载体蛋白通过硫醚键共价连接， 所述的 HA218_72多肽的氨 基酸序列为 SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列 （ MVDGWYGYHHSNEQGSG YAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFC[SEQ ID NO: 3] ); 所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K、破伤风类毒素、 乙肝核 心抗原、 匙孔血蓝蛋白、 轮状病毒衣壳蛋白和牛或人乳头瘤病毒 VLP的 L1 蛋白的任意一种。
优选地， 所述的载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 Ρ64Κ, 所述 Ρ64Κ 的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。 所述的 HA218_72多肽是 经基因工程菌表达而来； 所述 HA218_72多肽编码基因的核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID NO: 4所示； 所述基因工程菌为大肠杆菌 Ecoli.BL21。
本发明还提供了以上所述的 HA218_72-载体蛋白偶联物的制备方法， 是先 将载体蛋白用活化剂活化， 再与适当比例的 HA218_72多肽混合， 反应得到蛋 白偶联物 HA218_72; 其中， 所述的 HA218_72多肽与载体蛋白的摩尔比例为 10: 1至 20: 1; 所述偶联反应的 pH值为 6.5-7.5; 所述偶联反应的时间为 18-36 小时； 所述的活化剂选自 SMCC、 MBS, sulfo-MBS的任意一种。
优选地， 所述的 HA218_72多肽与载体蛋白的摩尔比例为 12: 1至 16: 1 , 更优选 15： 1； 所述偶联反应的 pH值优选为 6.8-7.2; 所述偶联反应的时间优 选为 24小时； 所述的活化剂优选为 SMCC。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 HA218_72载体蛋白偶联物和佐剂。
本发明还提供了一种广谱型流感疫苗， 其中， 所述的疫苗含有本发明所 述的 M2e-载体蛋白偶联物和含有本发明所述的 HA218_72 -载体蛋白偶联物和 佐剂。
本发明所述广谱型流感疫苗，可以包括本领域常用的各种例如氢氧化铝、 弗氏佐剂的免疫佐剂。
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。 然而， 应当理解， 本发明 的实施方案不限于这些实施例的特定细节， 因为对于本领域的普通技术人员 来说， 其其他的变化是已知的， 或根据直接公开的内容和附属的权利要求是 显而易见的。 因此， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范 围。 本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。
下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所述试剂 和生物材料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 例如， 本实施例所用病 毒购自国家流感中心。
实施例 1、 脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 （P64K ) 的制备
1、 脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 （P64K )编码基因的克隆
根据 GenBank Accession No.X77920.1 的脑膜炎奈瑟氏菌的序列， 采用 Primer 5.0 软 件 设 计 引 物 ， 上 游 引 物 ： 5-CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA-3 , 下 游 引 物 ： 5-CCGGAATTCTTATTTTTTCTTTTGCGGAG-3，其中下划线部分分别为 Ncol 和 EcoRI的酶切位点。 将脑膜炎奈瑟氏菌 CMCC 29336 (购自中国医学细菌 保藏中心， 筒称 CMCC )于 100°C条件下煮沸 lOmin, 吸取 3μ1作为模板， 进 行 PCR扩增。 PCR反应体系为： 3μ1模板， lOxPCR緩沖液 5μ1, 10mmol/L dNTP Ιμ?, Pyrobest高保真 DNA聚合酶（上海生工产品） Ιμ?, 终浓度为 0.5 mol/L 的上下游引物各 0.5μ1, 加超纯水至 50μ1。 PCR反应条件为： 先 94°C预变性 5 然后 94°C变性 45s, 50°C退火 45s, 72°C延伸 2 共 30个循环， 最 后 72°C延伸 10min。 将 PCR扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 1 所示。 其中， 泳道 1为 DL2000 DNA分子量标准， 泳道 2为 P64K编码基因 的 PCR扩增产物。 结果表明， 扩增得到 1800bp左右的 P64K的编码基因。 对 上述获得的 P64K的编码基因进行测序， 测序结果表明， 其核苷酸序列如序 列表中 SEQ ID NO: 6所示， 其编码的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 5 所示。
2、 载体和工程菌的构建
回收上述目的片段， 将回收的 PCR产物和 pET28a载体分别用 Ncol和 EcoRI进行双酶切， 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测， 切胶回收酶切片段， 将酶切产物与载体 pET28a的酶切产物以 1 : 3的摩尔比进行混合，经 T4 DNA 连接酶室温过夜连接， 连接产物用 CaCl2法转化 JM109感受态细胞， 12小时 后， 挑取单克隆， 用菌落 PCR法筛选阳性克隆， 得到表达 P64K的大肠杆菌 工程菌。 3、 工程菌株大规模培养、 脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 （P64K ) 的纯化和 检测
将上述步骤 2获得的表达 P64K的大肠杆菌工程菌经三级培养放大， 最 后转至 500L的肉汤培养基中， 发酵罐参数设置为： 搅拌速度 350-400rpm, 温度 35-37°C , 溶氧控制在 30-40%, 培养 36-48小时后， 终止培养。
将培养液经连续高速离心进行固液分离以收集菌体， 将收集到的菌体经 高压匀浆后， 离心去除菌体碎片， 在上清液中加入固体硫酸铵， 依次进行疏 水层析、阴离子交换层析（ Q-sepharose FF GE )和凝胶过滤（ sephadex s200 GE ), 得到 P64K的原液。
按照 《中国人民共和国药典》 2005年版第三部要求和质量标准对上述获 得的 P64K原液进行纯度、 残留杂质和结构鉴别， 具体的检测结果如图 1-5 所示。 其中， 图 2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 （P64K ) 的反相高效液相色谱 图，检测波长为 280nm,结果如图中所示只有一个峰，其色谱保留时间为 7.71 分钟， 色谱纯度为 100%; 图 3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白（P64K )肽谱（胰 蛋白酶）， 结果显示， 上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 （P64K )与 P64K 标准品 （古巴分子免疫中心提供） 的谱图完全一致； 图 4为脑膜炎奈瑟氏菌 外膜蛋白 （P64K ) 的电泳图语， P64K表示上述获得的由大肠杆菌工程菌表 达的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白（ P64K ), LMWP表示低分子量蛋白标准品（ GE 公司提供）， 在电泳谱图上， 上述获得的 P64K只有一条带， 纯度为 100%; 图 5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白 P64K的质谱分析图， 分子量为 61932.7Da, 与氨基酸序列推算的理论分子量一致。
实施例 2、 M2e肽的制备
1、 M2e肽的固相合成： 的氨基酸 Cys为起始反应物，将其上的 NH2用 Fmoc保护，与载体 Trityl chloride resin (也可为 Rink Amide resin或 Wang resin )反应, 摩尔比为 1: 1.5, 以 DCM或 DMF为反应溶剂， 碱性条件下混合， 反应 2小时左右； 用碱性溶剂 哌啶脱去连接在载体上第一个氨基酸氨基上的保护基 Fmoc, 用 DMF沖洗， 去除过量的氨基酸， Fmoc等小分子物质； 再加入活化剂 DIC/HOBT混合物， 以活化 Cys N端的自由氨基， 15分钟活化完毕后，加入第二个氨基酸（见 SEQ ID NO: 1 ), 依次循环， 完成 M2e肽上所有氨基酸的连接。 合成完毕后， 利 用三氟乙酸切除载体 Trityl chloride resin , 以及 M2e肽侧链上的保护基团， 以 得到完整的无保护基的 M2e肽链。
2、 M2e肽的纯化和结构确证：
合成完毕后， 利用制备高效液相色谱法纯化 M2e肽， 固定相为 0.1%的 CF3COOH/H20, 流动相为 0.1%的 CF3COOH/CH3CN, 具体的检测结果如图 6-7所示。 图 6为 M2e肽的反相高效液相色谱图， 检测波长为 280nm, 结果 显示， 色谱保留时间为 22.532min, 色谱纯度为 96.52%。 图 7为 M2e肽的质 谱分析图， 质谱分子量为 2670.7Da, 与氨基酸序列推算的理论分子量一致。
实施例 3、 M2e肽- P64K偶联物的制备
1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 -carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1: 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合， 室温搅拌 2小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯（购自密理 博（上海）贸易有限公司， MW:30KDa )超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 M2e以摩尔比 1: 15的比例在 pH6.5, 4°C的条件下反应 24h,用巯基乙醇终止反应。其中巯基乙醇的用量为 15mmol/ mol M2e。 用超滤杯（MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物， 除去未参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 M2e- P64K偶联物的产率为 58%。
1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 - carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1: 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合，室温搅拌 2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯（MW:30KDa ) 超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。 2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 M2e以摩尔比 1： 12的比例在 pH7.2, 4°C的条件下反应 24h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（MW:30KDa ) 纯化 制得的偶联物， 除去未参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 M2e- P64K偶联 物的产率为 50%。
1、 P64K的活化：
以 MBS ( ( m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester ) 为活化剂 , 将摩尔比为 1 : 20的 P64K:MBS在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混合， 室温搅拌 2 小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯（MW:30KDa )超滤活化 的 P64K, 以除去未反应的 MBS和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 M2e以摩尔比 1 : 10的比例在 pH7.5, 4°C的条件下反应 36h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（MW:30KDa ) 纯化 制得的偶联物， 除去未参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 M2e- P64K偶联 物的产率为 47%。
1、 P64K的活化：
以 sulfo-MBC ( m -maleimidobenzoyl- N-hydroxysulfosuccinimide ester ) 为活化剂， 将摩尔比为 1 : 20的 Ρ64Κ: sulfo-MBC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液 里混合， 室温搅拌 2 小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯 ( MW:30KDa )超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 sulfo-MBC和过量的甘氨 酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 M2e以摩尔比 1 : 20的比例在 pH6.5, 4°C的条件下反应 18h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（MW:30KDa ) 纯化 制得的偶联物， 除去未参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 M2e- P64K偶联 物的产率为 55%。
E组： 1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 -carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1: 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合，室温搅拌 2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯（MW:30KDa ) 超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 M2e以摩尔比 1: 18的比例在 pH6.8, 4°C的条件下反应 24h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（MW:30KDa ) 纯化 制得的偶联物， 除去未参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 M2e- P64K偶联 物的产率为 54%。
实施例 4、 M2e- P64K偶联物的结构分析
SDS-PAGE检测载体蛋白 P64K与 M2e的偶联度， 如图 8所示， 泳道 4 为标准 Marker, 泳道 3为实施例 3所得的 M2e- P64K偶联物。
利用凝胶色谱 Superdex200, 根据被检测分子的大小差异分离不同组分， 分离条件： 流速： 0.5ml/ 时间: 55 检测波长： 280 温度： 室温； 流动相： 磷酸盐緩沖液 pH6.5。 得到 M2e- P64K的凝胶色谱图如图 9所示， 黑色曲线为 P64K , 灰色曲线为 P64K-M2e偶联物。
根据如下表 1的方法计算分子量 P64K与 M2e的偶联比例：
由上表可以得出， P64K与 M2e的偶联比例为 1: 9, 即 1个 P64K分子 可以偶联 9个 M2e分子。
实施例 5、 HA218_72多肽的制备
1、 HA218_72表达载体的构建
根据大肠杆菌的密码子偏性， 人工合成编码成熟的 HA218_72多肽的全长 DNA序列， 其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 4所示。
以上述合成的重组序列为模板， 采用 Primer 5.0软件设计引物， 上游引 下游引物： 5 ' GCACGATCCGCTCGAGGC AGTTGTTAAACTCGCGGCCC ACG GCC3，， 下划线分别为 BamHI和 Xhol酶切位点。 采用 PCR的方法， 扩 增 HA218_72基因。 PCR反应体系为： 5 lOxPCR緩沖液，4 L 2.5mmol/L dNTP, Pyrobest高保真 DNA聚合酶 0.5 L,两条引物终浓度为 0.5 mol/L,模板 0.5 L, 超纯水 H20补充反应体系至 50μ PCR反应条件为： 95 °C预变性 5 min后 进入 PCR循环。 PCR反应参数为： 94 °C变性 45 s, 55 °C退火 45 s, 72 °〇延 伸 45 30 个循环后， 72 °C延伸 10 min。 将 PCR扩增产物进行 1.5%琼脂糖 凝胶电泳， 切胶回收目的片段。
将 PCR回收产物与 pET28a载体分别进行 BamHI/XhoI双酶切， 经 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 10所示。 其中， 泳道 1为上述步骤 1的 PCR产 物经 BamHI/XhoI双酶切的酶切产物， 切胶回收酶切片段。 PCR酶切产物与 pET28a酶切产物按 1 : 3比例经 T4 DNA连接酶连接过夜， CaCl2法转化 ToplO 感受态。 37°C培养 12小时后， 挑选单克隆， 用菌落 PCR法筛选阳性克隆。
2、 HA218_72小量表达
将测序结果正确的表达载体 pet28a-HA218_72用 CaCl2法转化 Ecoli.BL21 感受态细胞。 如图 11所示。 挑选单菌落接种于 5ml LB培养基中 （卡那霉素 60 g/ml ), 37 °C培养过夜。将过夜菌按 1 : 100接种至 10 ml LB培养基中（卡 那霉素 60 g/ml ), 37 °C摇菌至 OD6。。=0.4-1.0,留取 1ml培养物后，加入 IPTG 至终浓度 lmmol/L, 37°C诱导过夜。 取 lml样品， 离心， 收集菌体， 超声破 碎， 然后 4°C , 12000 rpm, 离心 10 min。 10% SDS-PAGE检测上清和沉淀中 HA218_72的表达状况。
3、 HA218_72的纯化和检测
挑取高表达菌株单菌落至 5mL LLB培养基中培养过夜作为种子。将种子 按 1 : 100接种到 2xYT培养基中培养 3h,加入 IPTG至终浓度为 lmmol/L诱 导表达 6h后离心收集菌体。每克湿重的菌体加入 5mL緩沖液 A(20m mmol/L Tris, pH 6.5)重悬， 超声破碎 20min后离心取上清液经 0.22μιη过滤后进行 Mono Q离子交换层析。使用緩沖液 B(20mmol/L Tris, 500mmol/L NaCl, pH 6.5) 进行阶段洗脱， 先用 20%的緩沖液 B洗杂蛋白， 再用 30%的緩沖液 B洗脱目 的蛋白， 收集洗脱峰， 见图 12。 通过 Sephadex G25将上一步纯化产物更换緩 沖液至緩沖液 C(5%乙腈， 0.05%三氟乙酸)中进行 SOURCE反相层析， 使用 緩沖液 D(80%乙腈， 0.05%三氟乙酸)进行阶段洗脱， 首先用 25%的緩沖液 D 洗杂蛋白， 接着用 35%的緩沖液 D洗脱目的蛋白， 收集洗脱峰， 见图 13。 将 收集到的目的蛋白冷冻干燥后置 -20 °C保存。纯化产物的 SDS-PAGE结果如图 14所示。
使用 HPLC检测目的蛋白的纯度， 色语柱为 ZORBAX 300SB-C8 , 溶液 A为含 0.1 %三氟乙酸的超纯水， 溶液 B为含 0.1%三氟乙酸和 90%乙腈的超 纯水， 洗脱的梯度过程为 0至 100%的溶液 B 用时 30min。 检测结果显示目 的蛋白的纯度在 95.7% (图 15 )。
实施例 6、 HA218_79- P64K偶联物的制备
1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 -carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1 : 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合， 室温搅拌 2小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯（购自密理 博（上海）贸易有限公司， MW:30KDa )超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 HA218-72以摩尔比 1 : 15的比例在 pH6.5, 4°C的条件下反应 24h, 用巯基乙醇终止反应。 其中巯基乙醇的用量为 15mmol/ mol HA218-72。 用超滤杯（ MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物， 除去未 参加反应的 M2e和巯基乙醇等。 所得 HA218_72- P64K偶联物的产率为 62%。
1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 - carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1 : 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合，室温搅拌 2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯（MW:30KDa ) 超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 HA218-72以摩尔比 1 : 12的比例在 pH7.2, 4°C的条件下反应 24h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（ MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物，除去未参加反应的 ΗΔ2皿和巯基乙醇等。所得 HA218-72- P64K偶联物的产率为 54%。
1、 P64K的活化：
以 MBS ( ( m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester ) 为活化剂 , 将摩尔比为 1 : 20的 P64K:MBS在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混合， 室温搅拌 2 小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯（MW:30KDa )超滤活化 的 P64K, 以除去未反应的 MBS和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 HA218-72以摩尔比 1 : 10的比例在 pH7.5, 4°C的条件下反应 36h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（ MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物，除去未参加反应的 ΗΔ2皿和巯基乙醇等。所得 HA218-72- P64K偶联物的产率为 47%。
1、 P64K的活化：
以 sulfo-MBC ( m -maleimidobenzoyl- N-hydroxysulfosuccinimide ester ) 为活化剂， 将摩尔比为 1 : 20的 Ρ64Κ: sulfo-MBC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液 里混合， 室温搅拌 2 小时， 加入适量甘氨酸终止反应， 然后用超滤杯 ( MW:30KDa )超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 sulfo-MBC和过量的甘氨 酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 HA218-72以摩尔比 1 : 20的比例在 pH6.5, 4°C的条件下反应 18h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（ MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物，除去未参加反应的 ΗΔ2皿和巯基乙醇等。所得 HA218-72- P64K偶联物的产率为 57%。 E组：
1、 P64K的活化：
以 SMCC( Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl )cydohexane- 1 -carboxylate ) 为活化剂， 将摩尔比为 1: 20的 P64K:SMCC在 pH 7.2的磷酸盐緩沖液里混 合，室温搅拌 2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯（MW:30KDa ) 超滤活化的 P64K, 以除去未反应的 SMCC和过量的甘氨酸。
2、 偶联物的制备与纯化
活化的 P64K在已知浓度的情况下与 HA218-72以摩尔比 1: 16的比例在 pH6.8, 4°C的条件下反应 24h, 用巯基乙醇终止反应。 用超滤杯（ MW:30KDa ) 纯化制得的偶联物，除去未参加反应的 ΗΔ2皿和巯基乙醇等。所得 HA218-72- P64K偶联物的产率为 52%。
实施例 7、 HA218_72- P64K偶联物的结构表征
SDS-PAGE检测载体蛋白 P64K与 HA218_72的偶联程度， 如图 16所示， 泳道 1为分子量标准 Marker, 泳道 4为 HA218_72- P64K偶联物。
利用凝胶色谱 Superdex200, 根据被检测分子的大小差异分离不同组分。 分离条件为： 流速： 0.5ml/ 时间: 55 检测波长： 280 温度： 室 温； 流动相：磷酸盐緩沖液 pH6.5。检测结果如图 17所示，灰色曲线为 P64K; 黑色曲线为 HA218_72- P64K偶联物。
根据如下表 2的方法计算分子量 P64K与 HA218_72的偶联比例:
由上表可以得出， P64K与 HA218_72的偶联比例为 1: 4, 即 1个 P64K 子可以偶联 4个 HA218_72分子。
实施例 8、 M2e- P64K偶联物在小鼠中的免疫原性分析
1、 M2e-P64K偶联物与佐剂混合
( 1 ) M2e- P64K偶联物与弗氏不完全佐剂混合、 乳化
用一次性无菌无热原注射器取 l.OmL弗氏不完全佐剂， 分别与等体积的 上述实施例 3制备的偶联物 M2e- P64K混合于样品瓶中，反复吹打 20次，使 之形成油包水的混合物， 将反复吹打的混合物滴加到双蒸水中， 乳化物呈白 色液滴， 且不分散。
( 2 ) M2e- P64K偶联物与铝佐剂的混合、 吸附
分别取 1.0mg/mL上述实施例 3制备的偶联物 M2e- P64K于无菌无热原 容器中， 加入等体积的铝佐剂， 室温搅拌 1小时， 即得。
2、 免疫程序
取 40只 10周龄的 BALB/C小鼠随机分为四组， 分别为， 免疫组 1: 弗 氏不完全佐剂偶联物组； 免疫组 2: 铝佐剂偶联物组； 免疫组 3: M2e组； 免 疫组 4: 阴性对照组（生理盐水组）。 分别取 50 g上述四组供试物， 皮下注 射免疫 BALB/C小鼠， 每 14天免疫一次， 共免疫 3次。 最后一次免疫 14天 后采集血液样本， 分离血清用于抗体滴度检测。
3、 抗体滴度检测
采用 ELISA方法测定上述步骤 2中获得的血清中特异性抗流感病毒的抗 体的滴度。 多孔板先用 M2e包被， 加入按一定比例稀释的上述步骤 2获得的 免疫血清， 孵育 2h, 然后再加入酶标抗体， 最后加入底物液显色， 测 OD值： 在 ELISA检测仪上， 于 450nm处， 以空白对照孔调零后测各孔 OD值。 见图 18。
结果表明， 偶联组第三次免疫后的血清滴度达到 1: 128000。
表 3 抗体滴度测定结果
^ . 抗体滴度
免疫组 1 弗氏佐剂偶联物组 1: 128000
免疫组 2 铝佐剂偶联物组 1: 64000
免疫组 3 M2e 1: 1000
免疫组 4 生理盐水组 0
结果表明， 所有佐剂组中， 偶联物 M2e- P64K都能诱导小鼠体内高水平 的抗体，弗氏佐剂和铝佐剂在小鼠体内有明显的佐剂效应差异，而单独的 M2e 在小鼠体内仅有较低的免疫原性。
4、 抗体亚型鉴定
多孔板先用抗原 M2e包被， 将免疫血清按比例稀释， 加入上述已封闭的 反应孔中， 置 37°C孵育 lh, 洗涤（同时做空白孔， 阴性对照孔同步稀释）。 加入山羊抗鼠 IgA\IgM\IgG、 IgGl、 IgG2、 IgG3 , 反应 2h, 洗涤。 于各反应 孔中加入酶标抗体兔抗山羊 IgG, 37°C孵育 lh, 加底物液显色。 在 ELISA检 测仪上， 于 450nm处， 以空白对照孔调零后测各孔 OD值。 见图 19所示。
结果表明， M2e-P64k偶联物主要诱导产生 IgGl亚型抗体。
5、 抗甲型 H1N1流感 M2抗血清与禽流感 H1N1、 季节性流感 (H1N1、 H3N2)交叉反应
用包被液将 H1N1、 H3N2、 H5N1合成序列分别稀释至 2 / ml。 分别 在三列孔中加入 lOOul, 4°C过夜； 封闭 将免疫血清按比例稀释后， 加入 上述已封闭的反应孔中， 置 37°C孵育 lh, 洗涤； 加酶标抗体， 37°C孵育 1.5h, 洗涤； 加底物液显色， 室温放置 10 ~ 20 终止反应； 在 ELISA检测仪上， 于 450nm处， 以空白对照孔调零后测各孔 OD值。 （见图 20 )
结果表明， 抗甲型 H1N1流感 M2e的抗血清与禽流感 H5N1、 季节性流 感 (H1N1、 H3N2) 的 M2产生显著的交叉反应。
实施例 9、 M2e- P64K偶联物对小鼠 H1N1流感病毒攻击保护效果
将实验小鼠分为模型组、 受试疫苗组、 受试疫苗 +弗氏佐剂组， 每组 10 只。各实验组肌肉注射 50μΙ 只（免疫剂量），模型组肌肉注射生理盐水 50μΙ 只。 0, 14, 28天免疫。 末次免疫后 14天攻毒， 将 BALB/C小鼠麻醉后滴鼻 感染 10倍 LD50的 H1N1流感病毒， 攻毒后观察 14天， 流感疫苗对小鼠攻 击保护的效果如下表 4所示。
表 4 攻击保护效果
动物数量 死亡只数 死亡率 （％) 保护率 （％ ) 模型 10 9 90
疫苗 10 8 80 20* 疫苗 +弗氏佐剂组 10 0 0 100
*与模型组比较 ρ & 0.05
疫苗 +弗氏佐剂组保护率为 100 % , 表明偶联疫苗有良好的预防效果， 为 广谱型流感疫苗研究奠定了基础。
实施例 10: M2e-P64K偶联物对小鼠 PR8株流感病毒攻击保护效果 疫苗用 PBS稀释至相应浓度备用； 弗氏佐剂乳化方法： 将等量的弗氏佐 剂和抗原溶液分别吸入 1个注射器内， 与另一个空注射器以一细胶管相连， 注意排净空气， 然后交替推动针管， 直至形成粘稠的乳剂为止； 配制疫苗与 Al ( OH ) 3佐剂时， 先将 Al ( OH ) 3佐剂加至等体积的蛋白溶液中迅速混匀， 至于冰上备用。 采用肌肉注射的方式免疫 Balb/c小鼠。 免疫 3针， 每针间隔 2周， 第三针免疫后 14天攻毒。每组小鼠 10只， 用 10倍 LD50的 PR8攻毒， 攻毒后每天记录小鼠的体重及存活率情况， 连续记录 20天。
如图 22所示， M2e-P64k (新 H1N1 ) +弗氏佐剂组对小鼠的保护效果最 好， 可达 100% , 小鼠发病最轻； M2e-P64k ( H3N2 ) +弗氏组也具有较好的 保护效果， 保护率为 90%; M2e-P64k (新 H1N1 ) +Α1(ΟΗ)3组对小鼠的保护 率为 70%。
实施例 11 : M2e- P64K偶联物对禽流感 H5N1流感病毒攻击保护效果 选取 60只 4 ~ 6周龄雌性清洁级 BLAB/c小鼠，按照体重随机分为 6组， 10只 /组， 分为病毒对照组 CP (弗氏佐剂）和 5个疫苗免疫组， 如表 5所示， 其中疫苗免疫组 5组分别为： TA组（ M2e-P64k (新 H1N1即 SEQ ID No.l ) )、 TB ( M2e-P64k (新 HlNl即 SEQ ID No.l ) +弗氏）、 TC ( M2e-P64k (新 HlNl 即 SEQ ID No.l ) +Al(OH)3 )、 TD ( M2e-P64k ( H3N2即 SEQ ID No.7 ) +弗氏）、 TE ( M2e-P64k (禽 H5N1即 SEQ ID No.8 ) +弗氏）。 各试验组 TA、 TB、 TC、 TD和 TE分别在第 0、 14、 28天共免疫 3次， 免疫途径为后肢 ^^肉注射， 免 疫剂量均为 50 g/只， 体积均为 0.1ml/只。 CP组免疫等体积（0.1ml/只） 的 弗氏佐剂。六组动物免疫后 42天，使用 H5N1禽流感病毒 A/shenzhen/406h/06 株流感病毒通过鼻腔滴注方式进行感染， 感染剂量为 102TCID50/只
(10LD50), 感染体积为 50μ1/只。 在病毒感染后 14天， 观察动物临床症状， 每天称重， 并详细观察其存活状况， 计算各试验组动物的存活率、 平均存活 时间和延长生命率。
动物保护率结果： 免疫动物在攻毒后， 每天观察死亡情况， 连续观察 14 天， 根据动物存活情况计算其死亡保护率。 如图 23和表 6所示， 其中病毒对 照组动物在观察期结束前 10只全部死亡， 各疫苗试验组动物 ΤΑ组死亡率最 高为 100% , TD组最低为 20%。 TE、 TB和 TC分别为 90%、 80%和 70%。 与病毒对照组比较， TD组动物死亡率有显著性差异（P=0.01 & 0.05 )。 与病 毒对照组比较， 以 TD组疫苗的死亡保护率最高为 80%。
注： "弗氏" 为弗氏佐剂； Al(OH)3为氢氧化铝佐剂。 表 6疫苗免疫对小鼠感染 H5N1禽流感病毒 A/shenzhen/406h/06株存活 观察结果 单位： 只
动 0d 1 d 2 d 3 d 4d 5 d 6d 7d 8 9 10 11 12 13d 物 d d d d d 组 数
CP 10 10 10 10 10 10 10 9 4 0 - - - - - TA 10 10 10 10 10 10 10 10 8 2 1 0 - - - TB 10 10 10 10 10 10 9 9 7 4 3 2 2 2 2 TC 10 10 10 10 10 10 10 9 5 3 3 3 3 3 3 TD 10 10 10 10 10 10 10 10 10 8 8 8 8 8 8 TE 10 10 10 10 10 10 10 10 8 4 2 2 1 1 1 实施例 12、 HA21S_77- P64K偶联物的免疫原性分析
( 1 ) HA218_72- P64K偶联物与弗氏不完全佐剂混合、 乳化
用一次性无菌无热原注射器取 l.OmL弗氏完不全佐剂， 分别与等体积的 上述实施例 3制备的偶联物 HA218_72- P64K混合于样品瓶中，反复吹打 20次， 使之形成油包水的混合物， 将反复吹打的混合物滴加到双蒸水中， 乳化物呈 白色液滴， 且不分散。
( 2 ) HA218_72- P64K偶联物与铝佐剂的混合、 吸附
分别取 1.0mg/mL上述实施例 3制备的偶联物 HA218_72- P64K于无菌无热 原容器中， 加入等体积的铝佐剂， 室温搅拌 1小时， 即得。
2、 免疫程序
取 40只 10周龄的 BALB/C小鼠随机分为四组， 分别为， 免疫组 1: 弗 氏佐剂偶联物组； 免疫组 2: 铝佐剂偶联物组； 免疫组 3: HA218_72; 免疫组 4: 阴性对照组（生理盐水组）。 分别取 50 g上述四组供试物， 皮下注射免疫 BALB/C小鼠， 每 14天免疫一次， 共免疫 3次。 最后一次免疫 14天后采集 血液样本， 分离血清用于抗体滴度检测。
3、 抗体滴度检测
采用 ELISA方法测定上述步骤 2中获得的血清中特异性抗流感病毒的抗 体的滴度。 多孔板先用 HA218_72包被， 加入按一定比例稀释的上述步骤 2获 得的血清， 孵育 2h, 然后再加入酶标抗体， 最后加入底物液显色， 测 OD值： 在 ELISA检测仪上， 于 450nm处， 以空白对照孔调零后测各孔 OD值， 见图 21。
表 7 抗体滴度测定结果
抗体滴度（第三次血样） 免疫组 1 弗氏不完全佐剂偶联组 1: 256000
免疫组 2 铝佐剂偶联物组 1: 64000
免疫组 3 HA218_72 1: 2000
免疫组 4 生理盐水组 0
结果表明， 偶联组第三次免疫后的血清滴度达到 1: 256000。 佐剂组中， 偶联物 HA218_72- P64K均能诱导 d、鼠体内产生高水平的抗体， 与铝佐剂相比， 弗氏佐剂具有更明显的免疫效果； 单独免疫 HA218_72的小鼠体内仅产生极低 的抗体。
实施例 13、 HA218_72- P64K偶联物对小鼠 H1N1流感病毒攻击保护效果 疫苗用 PBS稀释至相应浓度备用； 弗氏佐剂乳化方法： 将等量的弗氏佐 剂和抗原溶液分别吸入 1个注射器内， 与另一个空注射器以一细胶管相连， 注意排净空气， 然后交替推动针管， 直至形成粘稠的乳剂为止； 配制疫苗与 Al ( OH ) 3佐剂时， 先将 Al ( OH ) 3佐剂加至等体积的蛋白溶液中迅速混匀， 至于冰上备用。 采用肌肉注射的方式免疫 Balb/c小鼠。 免疫 3针， 每针间隔 2周， 第三针免疫后 14天攻毒。 每组小鼠 10只， 用 10倍 LD50的 H1N1攻 毒， 攻毒后每天记录小鼠的体重及存活率情况， 连续记录 20天。 流感疫苗对 小鼠攻击保护的效果如下表 8所示。
表 8 攻击保护效果
动物数量 死亡只数 死亡率 （％) 保护率 （％) 模型 10 10 100
疫苗 10 8 80 20 疫苗 +弗氏佐剂组 10 6 60 40
HA2-P64k+弗氏佐剂组对小鼠的保护效果最好， 可达 40%, 小鼠发病最 轻。
实施例 14: M2e-P64偶联物和 HA218^- P64K偶联物联用对小鼠 H1N1 流感病毒攻击保护效果
选取 40只 4~6周龄雌性清洁级 BALB/C小鼠， 按照体重随机分为 4组， 10只 /组，分为模型组和 3个疫苗免疫组，其中，其中免疫组分别为 M2e-P64+ 弗氏佐剂， HA218_72- P64K+弗氏佐剂，联用组（ M2e-P64+弗氏佐剂： HA218_72- P64K+弗氏佐剂 =2: 1 )
各实验组肌肉注射 50μΙ 只（免疫剂量），模型组肌肉注射生理盐水 50μ? 只。 0, 14, 28天免疫。 末次免疫后 14天攻毒， 将 BALB/C小鼠麻醉后滴鼻 感染 10倍 LD50的 H1N1流感病毒， 攻毒后观察 14天， 流感疫苗对小鼠攻 击保护的效果如下表所示。 表 9 攻击保护效果
动物数量 死亡 J t 死亡率（％) 保护率（％ ) 模型组 10 9 90
M2e-P64K+弗氏佐剂组 10 0 0 100
HA218_72-P64K+弗氏佐剂组 10 6 60 40
联用组 10 0 0 100
M2e-P64K+弗氏佐剂组保护率为 100 % , 表明偶联疫苗有良好的预防效 果； 联用组（M2e-P64+弗氏佐剂： HA218_72- P64K+弗氏佐剂 =2: 1 ) 的保护 率也为 100%, 表明两种疫苗联用可以达到 M2e-P64K+弗氏佐剂组的效果， 但可以适当减少 HA218_72-P64K+弗氏佐剂组的用量， 上述试验表明两种流感 疫苗可单独使用也可联合使用。
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