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即送15丁当
【求助】如何检测肺癌EGFR基因突变检测？
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这个帖子发布于6年零213天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
老板最近说想开展EGFR基因突变检测，我也查了些文献，还是不是很清楚。请教各位大虾，哪种方法检测细支气管肺泡癌患者EGFR基因突变最好？需要什么仪器。并且HRM检测怎么样，成本如何。ARM-PCR呢？谢谢
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barolei40 1、基因测序法；2、免疫组化；3、RT-PCR法；4、FISH法，只能检测EGFR有无扩增，具体突变基因不知道能不能检测，5、高效液相谱法，HRM也是PCR的一种，具有操作简单，省时的优点；6、毛细管电泳法。不知道查的对不对，希望能起到抛砖引玉的效果啊。检测EGFR突变的方法很多，各有优缺点，要看你最终的用途是什么。FISH法不能检测EGFR突变。方法要取决于你的标本特点和实验目的，肿瘤EGFR突变检测，本质就是在高野生型DNA背景下检出突变的EGFR基因。这就决定了需要从两方面考虑解决方案：一是用高灵敏度的方法；二是富集肿瘤细胞/DNA，尽量剔除正常细胞/DNA的“污染”。1. Sanger测序法灵敏度较低，对石蜡标本检测难度较大。灵敏度大概为25%；2. 免疫组化法需要用EGFR突变特异性抗体，对19外显子缺失突变筛选效果较好，但21外显子点突变的检测特异性不佳；3. RT-PCR法，我想你说的可能是real time PCR吧，这是基于实时应该定量平台的一类方法，具体要看方法设计。如果使用TaqMan探针，而引物不做特别设计的话，灵敏度大概为10%；如果是荧光染料和普通引物的话，即所谓HRM，灵敏度大概也是10%；如果用特异性引物和探针的话，即所谓ARMS，灵敏度约1%；4. dHPLC法，灵敏度大概5-10%；5. 其它方法：如PNA-LNA Clamp法，灵敏度1%；焦磷酸测序法，灵敏度5-10%。方法选择只是实验成功的一方面，还要做好标本和DNA的质控。新鲜组织标本优于石蜡标本，手术标本优于穿刺或支气管镜标本，这其中的原因不用多说。石蜡标本比较特殊，因为DNA会断裂成碎片，影响后续的检测，而且石蜡和福尔马林中会有PCR抑制剂，影响PCR。由于目前大多数方法是基于PCR技术的，所以必须了解PCR技术的特点。PCR技术的一个特点是：强者越强，弱者越弱。意思是当DNA中含有多种模板分子时，含量较少的模板在扩增时会受到高含量模板扩增的竞争性抑制，含量低至一定比例时，低含量模板的扩增就被高含量模板完全抑制。这一特点也就决定了上述不同方法的灵敏度差异。
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You plan could be a genome analysis project. Try to collect tissue samples as many as possible (600-800 individuals). It would be better to collect tumor samples as well as their normal counterparts. Isolate both genomic DNA and total cellular RNA from each sample.If your institute has RNA sequencing facility, do RNA sequencing directly. If you don't, try to run RT-PCR for each sample, and do cDNA sequencing. At the same time, try to do direct genomic DNA sequencing for entire EGFR locus for each sample. Run data processing, and try to establish sequencing data including point mutations, deletions, copy number variations (CNV), and single nucleotide polymorphism (SNP), etc.
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谢谢 mpark
我还想问下，用HRM检测怎么样？准确性、可操作性如何，成本如何？
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ABI基因测序仪检测
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hrm只检测现有突变,也要分段检测,不过,费用比测序便宜一些
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是这样，我们科主任想进些设备开展肺癌的基因检测，为开展靶向治疗做基础。现在的问题是，不知道进什么设备好些，检测项目多些。
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为何不外包服务？除了设备，最主要还在于要有熟练运行这些设备的人，你老板有这个准备吗，不过反正事业单位，特别是领导不差钱，还愁花不掉呢，从成本上来讲，外包服务远比自己做合算.
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guoxingzhong edited on
老板想做这方面的东西，派我查资料，有没有更详细，比如，哪位大侠懂实验室建设的。有时候上网查的东西一头雾水。先谢了。
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guoxingzhong edited on
Personally, I think it would be a study that followed the discovery of EGFR activating mutation in some NSCLC patients.
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Thanks，I will learn it.
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EGFR检测苏州为真提供试剂盒。
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1、基因测序法；2、免疫组化；3、RT-PCR法；4、FISH法，只能检测EGFR有无扩增，具体突变基因不知道能不能检测，5、高效液相谱法，HRM也是PCR的一种，具有操作简单，省时的优点；6、毛细管电泳法。不知道查的对不对，希望能起到抛砖引玉的效果啊。
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barolei40 1、基因测序法；2、免疫组化；3、RT-PCR法；4、FISH法，只能检测EGFR有无扩增，具体突变基因不知道能不能检测，5、高效液相谱法，HRM也是PCR的一种，具有操作简单，省时的优点；6、毛细管电泳法。不知道查的对不对，希望能起到抛砖引玉的效果啊。检测EGFR突变的方法很多，各有优缺点，要看你最终的用途是什么。FISH法不能检测EGFR突变。方法要取决于你的标本特点和实验目的，肿瘤EGFR突变检测，本质就是在高野生型DNA背景下检出突变的EGFR基因。这就决定了需要从两方面考虑解决方案：一是用高灵敏度的方法；二是富集肿瘤细胞/DNA，尽量剔除正常细胞/DNA的“污染”。1. Sanger测序法灵敏度较低，对石蜡标本检测难度较大。灵敏度大概为25%；2. 免疫组化法需要用EGFR突变特异性抗体，对19外显子缺失突变筛选效果较好，但21外显子点突变的检测特异性不佳；3. RT-PCR法，我想你说的可能是real time PCR吧，这是基于实时应该定量平台的一类方法，具体要看方法设计。如果使用TaqMan探针，而引物不做特别设计的话，灵敏度大概为10%；如果是荧光染料和普通引物的话，即所谓HRM，灵敏度大概也是10%；如果用特异性引物和探针的话，即所谓ARMS，灵敏度约1%；4. dHPLC法，灵敏度大概5-10%；5. 其它方法：如PNA-LNA Clamp法，灵敏度1%；焦磷酸测序法，灵敏度5-10%。方法选择只是实验成功的一方面，还要做好标本和DNA的质控。新鲜组织标本优于石蜡标本，手术标本优于穿刺或支气管镜标本，这其中的原因不用多说。石蜡标本比较特殊，因为DNA会断裂成碎片，影响后续的检测，而且石蜡和福尔马林中会有PCR抑制剂，影响PCR。由于目前大多数方法是基于PCR技术的，所以必须了解PCR技术的特点。PCR技术的一个特点是：强者越强，弱者越弱。意思是当DNA中含有多种模板分子时，含量较少的模板在扩增时会受到高含量模板扩增的竞争性抑制，含量低至一定比例时，低含量模板的扩增就被高含量模板完全抑制。这一特点也就决定了上述不同方法的灵敏度差异。
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买一台pyrosequencing就OK了
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用DHPLC、HRM都可以做。DHPLC 仪器是由transgenomic公司的专利仪器，HRM技术是美国Idaho公司的专利技术，应用于市场上的仪器有Lightscanner96/384，Lightscanner32.个人认为HRM技术或DHPLC技术比较适合于你这个实验，因为有不少文献报道，可以参考一下！
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关于丁香园*健康问题描述（发病时间、主要症状、症状变化等）
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