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求助！关于考马斯亮蓝制作标准蛋白曲线的问题，麻烦各位进来看下！
用的是1mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液制作标准曲线，配制成20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，总体积是1ml，可是测出来的OD值好大啊 ，连续测了两次都后面的浓度全都超过1了，正常的一般是0~1之间的啊！
& && & 寻求各位虫子的帮助&&谢谢 ！
可是蛋白含量已经很低了啊& &&&我师姐以前都是用200μg&&400μg 600μg 800 μg 1000μg 做的标曲&&线性也可以的啊
最后总体积是0.1ml，蛋白质含量分别是20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，加的3ml考马斯亮蓝，没有用到酶标仪啊
而且我测的还是负值啊&&不知道怎么回事 做了十个梯度&&前五个递增 后五个递减 不知道是怎么回事！
首先要说明的是，你在这个帖里说“最后总体积是0.1ml，蛋白质含量分别是20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，加的3ml考马斯亮蓝”，样品体积为0.1ml，考马斯亮蓝为3ml，一共3.1ml。但在这个帖里&&http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=3323351&&说的是“每个最后体积是0.1ml ，最后加入3.5ml的考马斯亮蓝”，到底你用的是什么样的体系？参考的是什么样的文章，可信度如何？
测定体系较大，是不是你用的分光光度计一定要3ml样品才能测定？我觉得浪费试剂。我们的分光光度计不用3ml那么多的，你看看能不能把体积缩小。
姑且不考虑样品和显色剂体积的问题，就从显色之后溶液中BSA的浓度来看，你样品中含有100微克BSA时，显色之后溶液中BSA的浓度为100/3100约等于0.032微克每微升，在我的实验里，这个浓度是在线性范围内的。虽然我用酶标仪来测定，但是线性范围内的浓度范围是不变的。
在我的实验里，单单是考马斯亮蓝的吸光度就达到了0.6，线性读数最高不超过0.95，也就是说考马斯亮蓝法测定的线性范围只有0.35而已。如果有酶标仪就别用分光光度计，用BCA法，线性范围可以达到1.0，测起来舒服得多。
你这张帖里 http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=3323351 读数那么奇怪，我怀疑是操作错了，或许没有做三个重复，没有标准偏差的。
附上我做的一次标准曲线
首先&&样品体积和染色液体积我看的参考书里没有特别规定&&0.1ml总体积加入3.5ml染色液的有 ，也有1ml加入5ml染色液的。我们的分光度计型号UV-756型分光光度计，不是说比色皿所装液体的体积要超过其四分之三吗，那至少是要3ml啊
还有& &你说的三个重复&&是在一次实验里测三次吗&&还是重复做三次实验呢？
明白了&&还有& &制作标准曲线的时候 到底是按照浓度还按照蛋白的量来做横坐标呢？
谢谢！ 我最近做的一次 R方是0.9792，行吗？ 测蛋白含量只是为了后面确定电泳上样量& & 是不是一定要非常精确呢
导师不管这个的&&实验的目的主要是为了跑后面的电泳 所以不知道依据这样线性关系的加的样品跑出来结果怎么样
唉~我做出来的是Y=0.005X+0.4151&&X蛋白含量&&Y 吸光值& &
刚测出来一个样品里吸光值只有0.059& &就是您所说的截距大了& &这怎么克服呢？难道在做一次标准曲线？
用紫外分光光度法，Brad-ford方法测蛋白浓度，考马斯亮蓝的吸光度不可能像你说的那样达到0.6，我测得的空白的考马斯亮蓝吸光度都是很低的，线性也可以达到0.99，当然用ＢＣＡ试剂盒酶标仪来测定很快速，线性也很好，灵敏度理论上是毕考马斯亮蓝法高，但ＬＳ有没有考虑到酶标仪测定是非常迅速的，光达到一个样立马一到达下一个样品，在一个样品上所需的时间很少，这也不能说它完全没有误差，况且BCA试剂盒不能反复冻融，各有各的缺点和优点吧，看自己实验室条件如何，而且一批实验用同一种测定蛋白浓度的方法，误差也是差不多的，趋势不会有太大改变
恩&&呵呵&&请问下 你的那个标准曲线图的横坐标1~8是蛋白的微克数吗？
“考马斯亮蓝的吸光度不可能像你说的那样达到0.6”
你看看我十楼的测定体系，依照放大倍数放大到你的总体积时，所加稀释液体积是不是一样的，如果体系中那些比例不同就难说了。你说不可能，我觉得不应该说得这么绝对。
“BCA试剂盒不能反复冻融”
这东西是室温保存的，我们实验室的试剂盒上写着的，不用冻存，使用时也不用融化。你用的BCA是-20度保存的？
“但ＬＳ有没有考虑到酶标仪测定是非常迅速的，光达到一个样立马一到达下一个样品，在一个样品上所需的时间很少，这也不能说它完全没有误差。”
我加样品的时候非常快，而且BCA是显色半小时才测定OD值的，只要我在一分钟内可以加完50管就可以无视误差了。你该不会是把蛋白质样品加到显色液里吧？那样太慢了，而且也不能混匀，我是把BCA试剂加到样品里的，20微升的样品加180微升的显色剂，大体积的显色剂一加进去有冲力，一下子就混匀了，所以我可以一秒钟加一管显色液，加样时间产生的误差相对于30分钟的显色时间来说完全可以无视。
“而且一批实验用同一种测定蛋白浓度的方法，误差也是差不多的，趋势不会有太大改变”
问题是，这不是R平方值能达到多少个9的问题，而是楼主的B值太大了，使得曲线完全无效，你没有看他的那条标准曲线？
是的，样品体积为20微升，含有0-20微克的BSA，如果换算成浓度就除以二。
配好的蛋白溶液不是会失活吗& &&&失活的话测出来还准嘛
嗯 是的&&我也是用BSA粉末现配的&&我的意思是说 配成蛋白溶液放在室内 会不是变性&&对测值会不会有影响啊？不是说蛋白质的稀溶液非常容易变性吗
呵呵 由于实验需要 今天又来看了下 你关于三次重复的说法 可是按照你说的这样 说白了不就是重复三次所做的实验吗&&只不过你说的是&&在同一次实验中 就设置三个相同的浓度& & 我觉得和做三次实验 结果不都是一样的吗？
嗯 ！那我重复所测得的试验结果 最后再平均 是这个意思吗？
我的样品吸光度只有0.008，而截距有0.317，截距很大，计算会出负值的，怎么办?楼主找到解决方法了么?
我也遇到这个问题了，楼主解决这个问题了么
吸光度最小的样，不要把样稀释，浓点去测。。然后再计算。
我也遇到这个问题，求助。
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【求助】提组织RNA时，为何OD值总是小于1.8
我做了几例提取组织中RNA实验，每次测得的260/280都是小于1.8。不知是什么原因。也不知最后能否PCR出电泳条带。是不是有污染啊，还是降解了很可能是降解了，我最近也是在提RNA总是降解，有些细节还是要注意的原因是多方面的：1 有污染，从新提取，从各方面注意。2 我以前也遇到过比值很低的情况，其实是我们的仪器不太准，如果这样的话，低了也能用应该跑电泳看看。OD值小和降解与否无关。od值比较不仅与降解有关,也与RNA纯度有关,一般值比较低,说明不纯,有蛋白质污染,较高,则可能是有降解;另用DEPC水溶解也能使od值偏低;我没提取的RNA有时比值较低,但纯化后一般都能达到1.8以上,在1.9左右.1）检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是&2.2的）。当R&1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R&2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。此主题相关图片如下：以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染（见下图）。此主题相关图片如下：如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！祝实验顺利!!!把你的比色杯好好洗一下,泡在洗洁净里用棉签小心擦拭管壁,然后用双蒸水冲洗晾干,再比一次试试.可能有以下原因:1.匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小2.匀浆后，样本没有静置3.水相中可能有酚残留4.RNA沉淀溶解不充分5.测比值时，RNA溶解在DEPC水中，低的离子浓度和PH值增加了280nm的吸光值用TE稀释，用TE调0谢谢各位的指点。会不会是TRIZOL的问题了？我买的是韩国产的，价格很便宜。qxkillgre说: 检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。有错误吧!OD280指的是蛋白质的吸光度呀,OD260才是核酸的吸光度!小于1.8大多是蛋白污染，不大影响实验结果的分层后吸取上清液的时候不要贪心，离中间蛋白层还有段距离时就别吸了，用乙醇洗涤时多洗两遍。我也是出现这样的情况，做了一批标本，260/280都是1.1左右，电泳结果也不是太好，只吸取200ul上清液,每次乙醇洗两遍，也换了TRIZOL,沉淀在室温溶解大约有20分钟左右，我现在怀疑是不是我的样本问题。能说说你是什么材料吗？是不是多糖很多，或者开始的处理比较不得当？我选取的是大鼠的腹部脂肪组织，前几次先用液氮碾磨，再转移至冻存管加TRIZOL电动匀浆。这几次是液氮处理后没碾磨直接加TRIZOL电动匀浆的。结果都是一样。不知搂主使用的是TE缓冲液测OD吗，一般来讲如果使用DEPC处理水会使数值偏小的。如果使用TE缓冲液效果没有改善，有可能是有蛋白的污染。是不是因为大鼠的腹部脂肪组织富含甘油三脂和其他脂类，所以会存在干扰？而且脂肪组织的RNA更容易降解。液氮研磨的时候要舍得加液氮，转圈研磨的彻底一些，取样时尽量新鲜，要保存在液氮里。再就是脂类会比较轻，加入trizol震荡分层后，会不会有油样的东西票在上面阿？把这层去掉。用酒精洗涤的时候多洗两遍。如果跑电泳能看到条带，说明RNA提出量还比较多的话，可以减少处理的组织量。我使用的是人体的宫颈组织，匀浆器无法完全研磨成匀浆，我就用剪刀剪。这些都是在冰块上操作。不知这个步骤会不会影响OD值。应该不是DEPC水和检测仪器的问题，因为其他人用的也是这个，测出的OD值都不低。应该是研磨过程中降解了吧，为什么不用液氮呢？买液氮可以租个小液氮罐嘛，甚至可以免费使用，我们这里液氮才15元/L。用液氮的话，组织就会变得很脆，用研钵就可以研磨完全了，不过记得剪刀，研钵什么都要用锡箔纸包起来180度烘4小时以上以去除rnase。我们这边实验室里都是用的冰块，测出的OD值也不低呀。sorry,很糊涂我的概念搞错了。od值主要用来反映纯度，跑电泳用来反映rna的完整性。你的od值小，应该是RNA不纯，不知道OD260/230怎么样。你看看上面qxkillgre的回答吧组织能否完全研磨成匀浆是否也与比值有关？我的组织较硬，研杵研不碎，剪刀也不能完全剪成匀浆，所以每次总有一些微小的块状物。这是否会影响所提取RNA的质量了？当然会有影响了，没有完全研磨成粉末状，与trizol反应时怎么能接触完全呢？必然导致块状物里的RNAse起作用。还是用液氮吧，我以前做的是海参的肌腱，不光硬而且还很韧，但是用液氮一冻就变得特别脆，用研钵可以完全研磨成粉末状了，趁液氮还没挥发完毕就转移到trizol里取得了很好的质量。把异丙醇加大用量，再用乙醇多洗几次再看看。组织中RNA的量是多但是杂质也多。你可以试试！我们试过了很管用。请问一下，用乙醇多洗几次，每次洗完都要离心吗？请问fx1981 ：异丙醇加大到多少量？乙醇洗几次比较好了？
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菌悬液OD值测定的疑问？
1.请问大家在配置菌悬液的时候是怎么配置呢？是用液体培养基呢还是生理盐水？文献里怎么各种说法都有？
2.我在对菌悬液进行全波长扫描的时候发现的最大吸收峰是200~300nm左右，我用的不同不同梯度的菌悬液测定OD值的时候波长应该选择600nm吗？而我选择600nm的时候测定的10倍的稀释液竟然也才不到0.2.
要如何解决呢？请各位朋友帮忙解答，谢谢。
那请问霉菌以及酵母的最大吸收波长你知道吗？我有绿木霉、黑曲霉和青霉以及啤酒酵母，请问他们的最大吸收波长是多少呢？
那霉菌和酵母也可以用600nm测定吗？
我用的是石英比色皿的，可能是培养基的吸收峰吧
你测定的时候不是用培养液做空白对照的吗？应该扣除了培养液的吸收才对。
话说平板法可以测菌液OD吗：要是可以的话好像就是600吧
我用生理盐水配置的菌悬液，空白对照用的是生理盐水，现在的问题是吸光度很小，不是很大。
平板法是测菌含量，不是测OD吧。况且霉菌会和细菌一样都是600吗？
我用的也是，可是这样你有没有测定吸光度呢？会不会也是很小呢？
也可以用生理盐水稀释。不是很清楚你说的吸光度很小是什么意思，一般过夜的细菌OD大概是2左右吧。
霉菌 都是菌丝体成团的 不能用分光光度法测定，酵母菌可以的，霉菌一般低速离心看菌丝体百分比。
不是吧？我是液体培养基震荡培养15h,然后取出0.5ml加入到4.5ml的灭菌生理盐水中，然后测定吸光度，这样不对吗？
能具体点吗？是离心后测定前后的重量差吗？
都是直接拿培养液稀释，用空白培养液做对照测OD的。稀释倍数要看菌液浓度。一般稀释到测定值在0.1-0.5之间，这个范围内分光光度计线性好。
你测OD应该是为了得到生物量吧，称干重或者湿重不行吗？不一定非得用分光光度法吧
怎么用培养液稀释呢？培养液的吸光度就不小吧，那稀释液没有效果啊。
称重太麻烦，还要干燥很久，所以才用分光光度计的。
用无菌培养液做reference测的吸收才是和你样品中菌细胞数呈线性关系。因为你的菌是生长在这个培养液里，测吸收当然应该扣除培养液的吸收了。
没有测定过
我们原来弄青霉好像是600，你可以扫个全波长350-950nm，然后看下哪里没有色素干扰，一般是在600左右，可以用来表征生物量
扫波长是不行的，扫出来的最大吸收一般都是培养液的。
我的意思是吸光度本来就很小，液体培养基里取出来，稀释10倍吸光度 也很小。
如果吸光度本身就很小，就直接放到比色皿里测啊。不过，摇过夜的菌OD肯定早大于1了，需要稀释的。
这个霉菌吧，测定生物量不用分管光度法。成团的菌丝测得不准确不能反映菌体生长真是情况。一般最简单的方法是用带刻度的离心管去10mL菌悬液低速离心使菌丝刚好沉淀但不能压实的情况下看菌丝在培养液中所占百分比。
我振荡培养24小时的，用生理盐水稀释10倍，吸光度才0.2左右。郁闷。
原始菌液的OD在2左右没什么问题呀，虽然24h是长了些。
吸光度是0.2，不是2.:sweat:
你不是说稀释了10倍后测是0.2吗？原液的浓度就是2呀。
哦，那这个数值是正常的？
是的。虽然觉得长得有些慢，一般摇16h的菌液的OD是在2以上的。
哦，明白了。你有没有做过菌悬液的吸光度值和菌含量之间的线性关系？
做过其他菌的，没有数过大肠杆菌的。就是细胞计数与OD做对应关系曲线。不同的菌不一样的。
如果培养基有沉淀那应该怎样处理呢
真空抽滤，然后将滤纸拿到烘箱烘至恒重，称量其干重W2，相减滤纸的重量W1，生物量即为W2-W1。很方便的。
你好一起交流一下吧:D:D:D:D
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