免疫组化结果：ER++,PR++,HER-2-,KI-67约5%，p53-_百姓问医生
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免疫组化结果：ER++,PR++,HER-2-,KI-67约5%，p53-
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病情分析： 你好，像这个检查结果来看的话，目前是可以考虑可能会有复发的情况的，这个最好是进行后期的治疗。手术切除以后的话，还需要进行后期的化疗或者是放射治疗的，这个需要注意控制，定期复查。
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乳腺侵润性导管癌中ER、PR和Her-2、Ki-67、P53的表达
目的 探讨ER、PR 和Her-2、Ki-67、P53 在乳腺浸润性导管癌中的表达关系.方法 用免疫组化检测115 例乳腺侵润性导管癌患者病理组织中以上蛋白的表达情况并分析其相互关系.结果 ER、PR 和Her-2、P53 的表达都为负相关,和Ki-67 的表达无关.ER、PR双阳性和双阴性组与Her-2、P53 的表达也为负相关,和Ki-67 的表达无关.结论 联合检测Ki-67、HER-2 和p53 蛋白的表达能更清楚地了解乳腺侵润性导管癌的生物学行为,对临床诊断、治疗及预后评价有指导意义.
作者单位：
海南医学院附属医院血液肿瘤内科,海南,海口,570102;贵阳中医学院,贵州,贵阳,550001
海南医学院附属医院血液肿瘤内科,海南,海口,570102
海南医学院附属医院病理科,海南,海口,570102
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万方数据电子出版社免疫组化结果；ER（90%+）PR（9
免疫组化结果；ER（90%+）PR（9
基本信息：女&&44岁
发病时间：不清楚
病情描述及疑问：免疫组化结果；ER（90%+）PR（90%+）HER-2（-）P53（10%+）Ki-67（20%+）这个怎么看 什么意思？
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成都复兴医院&&&肿瘤科
表示肿瘤细胞中这些受体和基因表达的情况ER(
).表示内分泌治疗有效CERBB-2(
).表示预后不好KI-67(
).KI-67是肿瘤核增殖指数，(
)表示肿瘤增殖速度快
有关的更多问题，
中国医学科学院肿瘤医院&&&营养科
副主任医师
北京军区总医院&&&肝病科
中国中医科学院望京医院&&&肿瘤科
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【讨论】免疫组化标准化大讨论
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免疫组化（IHC）标准化
免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。以下免疫组化技术标准化的讨论是建立在环保组织固定液固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与***，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。病理科以前常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。尽管中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，但是由于甲醛毒性极大，既污染环境，也危害医技人员的健康，因此目前国内外各大实验室都逐渐淘汰醛类固定液，随着一些关键技术的解决，现在的环保固定液，已经大大改善性能，具有很好的固定效果，能保持组织和细胞的形态结构，也非常好保存抗原，而且避免了醛类固定液的过度交联蛋白的副作用，可提高的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。应避免使用含重金属的固定剂。固定液的量一般为组织块总体积的10-20倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。如需较长时间固定，可存放于4度冰箱固定，长达一周左右不会影响组织的后续操作，可防止组织经过度固定造成的组织抗原损失和抗原活性降低。（2）取材：组织标本的取材厚度一般为0.3cm(不应&0.5cm)，面积一般为（1.0-1.5）cm x (1.0-1.5)cm。（3）脱水：组织在脱水机中的处理需十分恰当，大量的实验室经验公认加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。（4）包埋与切片：组织经过脱水、透明（透明液推荐使，不含甲苯、二甲苯等有毒溶剂，透明效果优于二甲苯，且不会使组织变脆）及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度过高容易导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡（熔点&60°C）。（5）切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5um之间，淋巴结/淋巴组织和肾穿组织切片应该更薄些。切片要求完整，厚薄均匀，无皱褶无刀痕，太厚会影响免疫组化染色结果和判断，还容易在染色过程中发生脱片。展片可采用二次展片，所谓二次展片：是指在展片过程中，先将组织切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展片，然后将切片捞起放入45-50°C的温水中进行第二次展片。此方法的优点是酒精溶液于水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织接触酒精后会散开，不建议采用此法。（6）烤片：推荐58-60°C恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片，因为在干燥的条件下加热切片可以加速组织内抗原的氧化而破坏组织中的抗原，使抗原定位不明确。（7）暂不染色切片的保存：进行免疫组化染色最好采用新切片。在实际工作中，蜡块面端可以采用蜡封来避免抗原损失以便长期保存。如果切好暂不染色的切片，应该将切片放置于4°C冰箱短时间保存。（8）脱蜡：免疫组化的脱蜡过程与常规HE脱蜡步骤相同。，无毒、环保、速度快，效果明显优于二甲苯。2、免疫组化抗体的选择、稀释和保存（1）选择：选择抗体应先了解其反应谱和适用条件（包括适用切片&石蜡切片或冰冻切片&、稀释度及温育时间等）。使用一种新抗体时，必须首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳特异反应所需抗原的最低浓度。或者按照有关说明书的提示。（2）稀释：①一般用0.01M PBS，PH值7.2；②或用0.05M TBS，PH值7.6；③必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。（3）保存：合理地保存使用抗体十分重要，这样才能最大限度地发挥抗体的作用，使抗体不致在短期内失去活性。①浓缩型抗体：应先根据厂家提供的效价，将其分类。可按5ul、10ul、20ul等至100ul为一单位分装入安瓿或0.25ml带盖塑料离心管中，并注明标记（批号、名称、效价、量），密封后放入-20°C — -40°C低温冰箱中保存，用时按需用量取出，稀释后置4°C冰箱保存使用，切勿反复冻存，以免效价降低。②即用型抗体可置于4°C冰箱中保存。远程运送，路途携带，邮寄抗体时，应加冰、干冰、防湿材料，以免影响效价。3、免疫组化中被测组织的抗原修复使用。（1）组织细胞经10%中性缓冲福尔马林固定后，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，抗原结构的理化性质发生显著的改变，表位空间结构改变而导致许多抗原免疫活性丢失，影响了抗原的定位。目前在免疫组化实验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素之一。常用的抗原修复方法是加热抗原修复法和酶消化法。有些抗体不需要进行抗原修复，有些抗体需要酶消化法，有些抗原需要加热修复法，有些抗体则需要几种抗原修复技术的联合应用（抗原双重修复法），至于哪种抗体是否需要抗原修复以及如何修复，一般试剂公司在产品目录或说明书上会予以说明。（2）酶消化法：现免疫组化实验室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法。①胰蛋白酶消化法：浓度一般是0.05-0.1%，37°C下温育15-30分钟。②胃蛋白酶消化法：浓度一般为0.04%，37°C下温育10-30分钟。（3）加热抗原修复法：主要包括：高压法、微波法、水浴法。英联邦免疫细胞化学室间质控组织（UK NEQAS-ICC）进行过一项由105家实验室参与，历时两年（1996年8月-1998年8月）的研究对ER、PR进行8次循环反馈实验，进行不同实验室间实验方法的比较的结论，就目前实验室间ER、PR染色结果偏弱的原因最终得出一致性实验结论，即由于微波加热时间不足与实验室中操作控制不当所致，故强烈推荐使用高压抗原修复方法。抗原修复必须使用耐高温塑料切片架，不能使用铜染色架，以防止因修复液PH值改变抗原修复效果，修复结束后必须等修复液冷却至室温后，才能取出切片，取出后的切片需要用自来水充分洗涤，修复液的量必须保证所有切片都能浸泡到，无论哪一步骤都不能使切片干燥。用过的柠檬酸修复液或EDTA修复液不建议反复使用。影响抗原修复的基本因素是加热的温度和时间以及加热处理时浸泡切片的抗原修复液的PH。（4）抗原修复液的选择：加热抗原修复液有多种，如柠檬酸修复液（PH6.0）、EDTA修复液（PH8.0-9.0）、EGTA（PH9.0）、Tris修复液（PH10.0），至于需要哪种修复液，应该根据试剂公司提供的产品目录或说明书上的预处理方法。4、防脱玻片的制备：由于免疫组化过程长，组织切片长时间浸泡在缓冲液和试剂内经过多次冲洗浸泡和作用，尤其是在抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等因素的影响，极易造成脱片，因此，必须在载玻片上涂上粘附剂，增加切片的粘附作用。一般采用多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）和APES两种粘附剂。①多聚赖氨酸防脱玻片的制备多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）
9份配制方法：取多聚赖氨酸1份，蒸馏水9份，置于干净的玻璃容器中，混合均匀，将充分洗净、预先干燥的玻片浸泡入稀释好的多聚赖氨酸中5-10秒，取出放置于室温下晾干或60°C干燥箱内烘干备用。处理后的玻片避光干燥可长期保存、备用。浓缩多聚赖氨酸液室温（18-26°C）贮存，有效期12个月。稀释后的工作液2°C-8°C冰箱保存，有效期3个月。②APES玻片的制备：APES
50份配制方法：取APES1份，丙酮50份，置于干净的玻璃容器中，充分搅拌均匀。将洗净的玻片放入稀释好的APES液中20-30秒后取出，稍停，在放入纯丙酮液洗去多余的APES液，置通风橱中晾干即可。注意，用APES防脱玻片处理玻片捞片时组织应一步到位，不要留有气泡。浓缩液室温（18-26°C）贮存，有效期12个月。Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用且效果最好的一种防脱片剂，多聚赖氨酸溶液也可按1：10稀释成工作液，适合于需要酶消化、微波、高压的防脱片处理。5、免疫组化染色：（1）内源性过氧化物酶的阻断：在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等，它们能使H202分解，DAB沉积而着色，最常见的是红细胞（血红蛋白），另外还有横纹肌细胞（肌球蛋白）、粒细胞和单核细胞（细胞色素）、肝细胞和肾细胞（过氧化氢酶），如果不进行处理，组织中红细胞、粒细胞等会干扰染色结果的判断，消除内源性过氧化物酶干扰的办法就是将组织切片浸泡在3%的H2O2中10分钟。（2）内源性生物素的阻断：抗原修复对组织中内源性生物素受到不同程度的封闭，在加热抗原修复增强抗原表位暴露的同时，也增强了组织中内源性生物素的呈现。内源性生物素指的是组织内能够与抗生素蛋白结合的分子或基团，使用生物素-链霉菌抗生素蛋白的结合形成足以以假乱真的阳性。周小鸽等人2002年采用组织芯片技术对大范围的正常组织和肿瘤组织进行的系统性研究显示：①冰冻组织中存在生物素，②经福尔马林固定石蜡包埋后的组织中生物素被封闭，③加热抗原修复可造成生物素暴露，④生物素暴露的强度各不相同，强者可到强阳性（+++），⑤生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，⑥生物素在组织中的分布形式，特别是腺上皮组织，包括正常组织和肿瘤组织，亦存在部分非上皮组织，⑦生物素暴露的强弱与修复液亦有关，PH9.0EGTA的暴露能力比PH8.0EDTA和PH6.0的柠檬酸更强；⑧加热抗原修复暴露的生物素可以被蛋清液封闭。周小鸽等人提出建议：凡采用加热抗原修复和生物素相关检测系统，应进行生物素常规封闭，冰冻切片做免疫组化染色时亦应进行生物素常规封闭，或者采用非生物素检测系统，如Envision等，坚持使用阴性对照。在实验室中一般凡进行加热抗原修复处理并准备使用生物素-抗生素辣根过氧化物酶检测系统，免疫组化染色的组织都需要进行内源性生物素封闭处理。阻断内源性生物素的方法是采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）加以封闭，在常温下孵育20-30分钟即可，Avidin-biotin可以与组织中内源性生物素结合，以消除影响。但最简便的方法是使用非生物素的酶聚合物检测系统。（3）血清封闭：作为检测试剂的抗原蛋白带有一定的负电荷，免疫组化染色时，易与带正电荷的组织（特别是纤维组织、变性和&或&坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等）发生静电吸引而导致非特异性染色（实验室使用的封闭血清，一般在加一抗之前使用，选择的血清种属一般与二抗的种属相同），去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5—1：20，正常血清保护作用时间10-20分钟。（4）冲洗缓冲液：实验室中常用冲洗缓冲液为PBS和TBS（PH7.2-7.4）。冲洗缓冲液中加入0.025%Tween-20可以增强缓冲液的效果。（5）一抗孵育：①即用型第一抗体可按照厂家提供的实验操作条件进行实验（迈新实验室针对即用型抗体稳定性与长期有效保存条件的问题进行了长达1年时间对照追踪实验观察,结果表明:即用型抗体在4°C冷藏条件下存放14个月是稳定的）;②浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度进行成倍稀释预实验,以选择最佳稀释度。抗体的最佳稀释度是指:在无背景染色的情况下,获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度。一般染色背景深大多是抗体浓度过浓所致。③抗体孵育时的温度一般以25°C±8°C为准，在此区间内，一抗的孵育时间为30-60分钟。若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当减少孵育时间，或者在4°C冰箱过夜，冰箱4°C下孵育常需要注意的是：抗体孵育应在潮湿密封闭的环境中进行，避免抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥，致使染色背景产生。高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品。免疫组化染色过程的试剂浓度，孵育时间是相关联的，浓度与温度和时间基本呈反比，即浓度过高孵育，温度应越低，孵育时间应该越短，反之亦然，因此，每个实验室应根据各自的情况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件。（6）常用检测系统：目前常用的检测系统为辣根过氧化物酶检测系统，主要为两类：①以生物素-链霉菌抗生物素蛋白链接的辣根过氧化物酶（Biotin-Streptavidin-HRP）检测系统，如：SP、ABC、SABC等；②以聚合物（Polymer）链接的辣根过氧化物酶检测系统，如：MaxVision、Elivision、EnVision等。这两类检测系统都是在国内外临床广泛采用的检测方法。非生物素型酶聚合物检测系统敏感性较高、操作便捷、无内源性生物素干扰，已成为免疫组化的常规检测系统。（7）显色系统：由于通常采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）或AEC（红色）作为酶底物显色。若采用的是碱性磷酸酶检测系统则选择BCLP/NBT（蓝紫色）作为酶底物显色。①DAB阳性部位呈棕色，一般以苏木素复染。配制DAB时应注意：&1&DAB具有致癌性，可诱发皮肤癌和膀胱癌，使用过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此情况应立即用大量的水冲洗，用过的DAB应倒入清洁液中集中消毒处理；&2&DAB一定要新鲜配制，如有沉淀可过滤后使用，否则未溶的DAB颗粒会沉积在切片上，影响结果的观察，配制好的的溶液避光保存，30分钟内有效；&3&DAB的浓度不宜太高，否则会增加背景染色。H2O2浓度也不宜太高，否则会加速反应，也可增加背景染色。室温下染色约为3-5分钟，可在显微镜下观察控制染色时间。DAB试剂盒冰箱4-8°C避光保存。②AEC阳性部位呈红色，如以苏木素或亮绿等作为背景染色，则效果更好，配制AEC时应注意：&1&配制AEC过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此情况应立即用大量的水冲洗；&2&由于终产物溶于乙醇中，不能用酒精处理，因阳性棕红色产物能溶于究酒精中，故需甘油明胶封片，不能长期保存。&3&若出现沉淀可过滤后使用，配制好的溶液避光存放，30分钟内有效，染色结果为红色，室温下染色约为8-20分钟，可在显微镜下观察控制染色时间。AEC试剂盒冰箱4-8°C避光保存。显色时间不宜过长，过长可导致背景着色，但也不宜过短，过短可导致假阴性染色。免疫组化复染一般只需苏木素浅淡的染色（1-3分钟），苏木素的配方不同，但首选的是Harris苏木素衬染。在经0.1%盐酸酒精分化，自来水蓝化，常规脱水透明后封片。6、标准化实验对照的设立免疫组化对照实验的设立在免疫组织化标准化中是极其必要的，正确设立阳性、阴性对照，才能确保免疫组化染色过程的准确性、抗体及相关试剂有效性，是对技术人员实验操作和试剂供应商提供试剂质量的验证，也是对患者的负责。对照的设立包括试剂对照和组织对照，分别作为阳性和阴性对照。（1）试剂对照：主要是为了确定所使用的一抗和检测试剂盒的特异性，替代对照是使用与一抗相同种属来源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或使用PBS代替一抗进行染色。Vimentin抗体可以作为免疫组化染色中一种很有用的阳性对照试剂，在每次免疫组化染色中加入Vimentin染色作为阳性对照，可以观察甲醛固定后抗原表达的敏感性，对甲醛固定后抗原损伤的程度进行分析。（2）组织对照：组织对照实验有阳性对照、阴性对照和组织内部对照。①阳性对照：对照组织中含有已知的抗原，常用的阳性对照有多组织蜡块、组织芯片等②阴性对照：用确定不含有待测抗原的组织作为阴性对照组织③组织内部对照：待测组织自身含有某种相关抗原，如淋巴结内一定含有血管内皮细胞，在观察外部阳性和阴性的同时，也要注意到内部的表达情况，有时候可以起到相当关键的作用。当然，有不少染色或病例缺乏内阳性对照，若对染色反应有疑问，只能选用另外的阳性对照片核实，若内（或外）阳性对照是组织免疫反应阴性，瘤组织阳性则表达假阳性；瘤组织阴性则表明假阴性，只有阳性对照染色阳性，瘤组织反应才属真实，除了观察内阳性对照外，还要看内阳性对照是否有非特异性反应。7、免疫组化染色结果正确判读实验室染色结果的观察、染色结果的判定需要丰富的经验，免疫组化染色最终是否能得到正确的结论，关键还要看对染色结果如何评价，在判断免疫组化染色结果时，为确保其准确性，必须要注意：①首先应观察常规石蜡切片，形成初步诊断意见，在观察免疫组化染色结果时，应以有意义的组织/细胞为准，即主要观察有意义的组织/细胞的反应是阳性反应还是阴性反应；②免疫组化染色结果必须建立在组织阳性对照和阴性对照实验有效的基础上，这是正确判断染色结果的前提。只有当阳性对照呈阳性反应，阴性对照呈阴性反应，且背景清晰时才能从正反两面说明抗体的稀释度和效价准确、染色方法和步骤准确无误、无交叉反应及非特异性染色；③染色阳性结果应在预期的组织/细胞结构上定位清晰准确。阳性表达有强弱之分，只要在抗原的特定部位上，即使有少数细胞有抗原表达，也应视为阳性表达；④阴性结果是组织细胞内预期区域中未见抗原表达；⑤免疫组化染色结果为病理诊断辅助信息，当免疫组化染色结果与HE诊断不相符或发生矛盾时，应以HE诊断为标准，而不能简单的用免疫组化染色结果推翻、否定HE诊断，应在多做抗体标记并结合临床资料及实验室影像学检查等全面综合分析再做出正确诊断。染色阳性的判断：特别要注意内源性生物素造成的非特异性染色（如在肝、肾及富含线粒体的细胞等），常常表现为非特异的胞浆阳性。总之，只有阳性对照染成阳性，阴性对照基本阴性，这样的免疫组化染色结果才可信。一般来讲，免疫组化染色阳性结果比阴性结果更有意义，因为阴性结果可能缘于许多因素，可能抗原的确不存在，或抗原含量低，组织处理时抗原丢失，染色方法不敏感或操作有误。在免疫组化鉴别诊断过程中，大多数染色结果的判读为阳性或阴性即可，但在某些特殊情况下，如肿瘤组织中激素受体含量、分子靶向治疗药效，细胞增殖指数等进行免疫组化检测时，染色结果可用半定量计数法。染色强度：（－）阴性、（±）弱阳性、（＋＋）中度阳性、（＋＋＋）高度阳性；阳性细胞分布：（-）阴性、（＋）少数细胞阳性、（＋＋）中等细胞阳性、（＋＋＋）多数细胞阳性。8、免疫组化报告免疫组化实验报告已经融合在病理常规报告中，除了在本医院病理科与手术送检科室之间进行程序化的规范使用外，随着各个病理科实验室间的交流日益广泛，标准化的免疫组化报告已成为必不可少的交流资料。免疫组化实验报告中包括如下内容：（1）病人的一般资料介绍；（2）免疫组化检测系统（3）注明所选择抗体的品名、克隆号、细胞定位及表达意义；（4）实验对照的设立；（5）医生对免疫组化结果的诠释。最大限度、正确地叙述待测组织中抗原表达信息是病理免疫组化报告的基本要求。在条件允许下，病理免疫组化报告单应附有免疫组化染色图片。 参考书目①吴秉铨，刘彦仿主编.免疫组织化学病理诊断.北京：北京科学技术出版社，2007②王学民，田乃增主编.免疫组织化学和分子生物学实用技术.北京：人民卫生出版社，2002③中华医学会编著.临床技术操作规程病理学分册.北京：人民卫生出版社，2004
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免疫组化操作规程 （一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA?2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于中浸泡10分钟，更换后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。用固定可省去。 1）抗原热修复 （1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化； 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复； 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 15）PBS或自来水冲洗10分钟； 16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 17）自来水冲洗10～15分钟； 18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 4)抗原修复。 5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 8)PBS洗三次每次2分钟。 9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 10)PBC洗3次每次2分钟。 11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 12)PBS洗4次每次5分钟。 13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。
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当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。 对照/标本无染色 ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。 ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 ⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 ⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。 ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。 弱阳性 如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑： ① 标本的，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 ② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 ③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。 ④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。 ⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。 如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。 非特异性染色 ① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。 饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。 ② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。 ③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。 ④ 一抗的使用浓度是否过高。 ⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。 ⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。 ⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。 ⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
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免疫组化技术制片的规范和质量控制　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。 影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。 　　一、免疫组织化学技术对组织切片的要求 　　免疫组织化学技术适用于和，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于。冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。 　　二、组织的固定 　　组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。常用的固定液为10％ 福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用(不含甲醛 安全 环保），固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。 　　冰冻切片的固定液可用无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min，但因这些固定液均有一定毒性，国外实验室基本不再使用，改用新型，安全无毒。 　　三、载玻片的处理 　　组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用效果较好的是硅化玻片。 　　硅化玻片的制备： 　　1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。 　　2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。 　　3. 无水丙酮液浸1-2min。 　　3. 蒸馏水浸洗1-2min。 　　4. 烤干备用。 　　可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。 　APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA产品。 　　四、组织切片前处理 　　经福尔马林溶液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。新型的组织，可省去抗原修复步骤。组织切片前处理（也称抗原修复）常用的方法主要有： 　　1. 胰蛋白酶消化法 将切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化钙水溶液 pH7.8）消化30分钟，37℃。 　　2. 水煮法 将切片置入蒸馏水内，加热至沸腾持续10分钟，自然冷却。 　　3.微波加热法 常规是将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率（约800W）加热10分钟，自然冷却。 　　4. 高压加热法 用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。 　　5.联合处理法 按上述方法先进行胰蛋白酶消化，然后再进行水煮法或微波加热法或高压加热法。是否进行切片前处理要按第一抗体说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。切片前处理不当会出现： 假阳性、假阴性或阳性定位改变 　　五、内源性过氧化物酶的消除 　　组织中的粒细胞、单核细胞及红血球等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，因此，在显色前要把这些内源性过氧化物酶消除，方法是用3％过氧 化氢作用15分钟。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。 　　六、内源性生物素的消除 　　组织细胞中存在着内源性生物素，在应用与卵白素结合或生物素标记抗体的免疫组化检测系统检测组织细胞中的抗原时，内源性生物素容易与ABC法中的卵白素（avidin）或S-P（LSAB）法中的链霉菌抗生物素蛋白(streptavidin)结合，引起假阳性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除内源性生物素。消除内源性生物素的方法有：（1）用鸡蛋清或卵白素封闭。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫组化检测系统检测如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。 　　七、高敏感免疫组化染色方法的选用 　　免疫组织化学技术的特点之一是敏感性高，就是能把抗原抗体结合物特异性地放大。目前，免疫组化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般来说，抗体与抗体的连接步骤少，特异性高，敏感性低；反之，连接步骤多，特异性低，敏感性高。但是，不同公司生产的试剂盒，技术由于不断地改进和提高，在特异性和敏感性方面各有特点。各实验室可以根据自己的实际情况对照比较，合理选用。目前应用最广泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。 　　八、第一抗体与免疫组化检测系统的正确配套 　　常用的第一抗体一般为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，也有羊抗的抗体。常用检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能错配，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好选用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗体。 　　九、酶标抗体系统中的酶与显色剂的合理选用 　　在S-P等常用免疫组化方法中，标记抗体的酶主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP或AKP)，显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红、固蓝或BCIP/NBT作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝、BCIP/NBT呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，因其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。 在多重免疫组化染色中，合理选用酶标抗体检测系统和显色剂，在同一切片上可以清晰地显示组织细胞中多种抗原的表达。 　　十、实验对照的设置 　　为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。 　　1.阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性 ，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者更应设阳性对照。 　　2.阴性对照：选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。 　　十一、免疫组织化学染色后的背景复染 　　免疫组织化学技术的另外一个特点是抗体在组织中的定位准确。因此，免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有蓝色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色，Mayer~{!/~}s苏木素复染细胞核呈蓝色。甲基绿复染细胞核，颜色鲜艳，特别适用于显微照相，但容易腿色。 　　十二、免疫组化染色结果的观察 1. 阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应 定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的组织切片前处理会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜如LCA和UCHL1等。（2）细胞浆如Keratin和Lysozyme等。（3）细胞核如PCNA和ER、PR等 2. 不当的组织切片前处理有可能出现假阳性或假阴性的结果。 3. 组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性反应，但绝大多数都是非特异性染色。 4. 染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。 5. 组织切片背景深与下列因素有关： (1)第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。 (2)显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。 (3)正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。 (4)抗体纯度不高。 (5)抗体孵育切片后冲洗不干净。 　　十三、抗体的保存和稀释 　　抗体应于低温保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间。检测试剂盒一般存放于4℃，不宜于-20℃保存，如长时间不用，可存放于-20℃，解冻使用后则不能再存放于0℃以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易离解，导致检测的敏感度降低。 　　浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5-20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价是否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用商品化的抗体稀释液，也可以用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中加入1％BSA和10％正常血清后稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。 　　十四、注意事项 1．石蜡切片脱蜡要彻底。 2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37℃；如果不是由于诊断急需，一抗置于4℃孵育过夜也是一种较佳的选择。 3．滴加抗体应完全覆盖组织，避免引起组织边缘效
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这是我们实验室做石蜡切片的流程和方法，是做很多免疫组化后摸索出来的，切实可用，大家可以直接使用。
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1．固定：常用4%的多聚甲醛固定液，最好用，安全，无毒。对于冰冻切片，有更好的优越性；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。 Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。 PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 2．组织脱水，透明：时间不能太长，应用新型，不含二甲苯等有毒试剂，可避免切片时容易碎片，切不完整。 3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。 4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。 5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存 6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。 7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。 8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。 9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭 10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。 11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。 12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。 13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。 14．在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
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　　　　　　　　　　　　　 病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生做出正确的病理诊断。因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片的控制，为提高临床病理诊断水平，促进临床病理学事业的发展做出我们应有的贡献。 一、 高素质技术人员的规范管理 1． 要有敬业精神，强烈的工作责任心、 2． 努力学习，刻苦钻研，掌握过硬的基本功，引进和学习新技术，工作精益求精。 3． 领导重视，为技术人员提供进修学习和提高的机会。 4． 技术员和医生，技术员与技术员互相团结，密切配合，发挥团队精神的作用、 二、 仪器设备规范管理 1． 配备先进，高质量的仪器设备是保证和提高制片质量的重要条件、 2． 正确使用，定期维修保养，保证仪器设备在最佳的状态下工作、 三、 标本和资料档案的规范管理 1． 标本和送检单的接收 检查标本和送检单的名字是否相符，有否标本，有没有病史。标本补充固定液，送检单编号登记。 2． 资料档案的规范管理 诊断报告发出后，附有诊断报告记录的送检单、玻片和组织蜡块存档并专人保管。建立严格的资料借出制度，确保档案资料不被丢失。 四、 技术操作规范 1. 及时固定组织：过去常用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用浓甲醛液1份加蒸馏水9份稀释）固定组织，因甲醛易氧化成甲酸，因此多会偏酸性，最理想的是配成中性甲醛液；现在实验室开始采用无毒绿色环保的（不含甲醛），固定效果与甲醛相当，后续如进行，则效果更好。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约4小时左右，然后取材时修切成大小约22 x 22mm，厚不超过2mm的组织块进行脱水。取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。 常规固定液的配制：，大多公司都有即用型，无需配制，直接使用（1） 10%甲醛液 浓甲醛 10ml 蒸馏水 90ml （2） 缓冲中性甲醛液 浓甲醛 10ml PBS缓冲液（Ph7.2） 90ml （3） 10%中性甲醛液 浓甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 碳酸钙 加至饱和 冷冻切片固定液(，有即用型销售，直接使用即可） (1) 乙醚酒精液 无水乙醚 1份 95%酒精 1份 (2) 酒精—冰醋酸液 95%酒精 100ml 冰醋酸 3~5滴 细胞学涂片固定液的配制 (1) 酒精—冰醋酸液 95%酒精 97ml 冰醋酸 3ml (2) 乙醚--酒精液 95%酒精 50ml 乙醚 50ml 冰醋酸 1ml (3) Carney`s液 无水酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml
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讨论很好，免疫组化标准化很难，看似简单，要做好，真不容易，很多试剂有毒，科研，又不能像医院有机器代劳，环保试剂是很重要
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免疫组化标准化很难，各位同仁共同探讨啊
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1、设置单独的实验室。2、必须有专用的冰箱，天平和pH计，并定期校对。3、实验用玻片，器皿必须清洁。经过泡酸处理，清洗干净。4、即用型试剂必须放入4度冰箱内，并每天对冰箱温度进行检查并登记（包括-80度和-20度冰箱）。5、试剂在有效期内使用（自己配制的试剂，也需标明有效期），使用前必须核对有效期。6、，入水流程与常规石蜡切片分开，不宜混在一起。7、设立阳性和阴性对照。8、根据各种抗体具体要求进行抗原修复。9、新抗体必须摸索出最佳稀释度。10、孵育时间，温度根据各种抗体的具体要求操作。11、DAB显色必须在镜下观察。12、复染后经酒精充分脱水，。13、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。14、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚。15、制片工作一般应在48小时内完成。16、切片完成后交付医师时必须按照记录当面清点。17、对使用的免疫组化抗体进行克隆号、稀释比、配制时间记录。
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内容好详细，谢谢
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继续努力，欢迎大家补充新的内容，特殊技巧
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接到标本后快速冰冻。2、切片厚度6—7微米。3、切片完整，无污染，无皱褶。4、切片完成后立即固定。5、染液，脱水液必须及时更换。6、封固前必须经酒精脱水，。7、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。8、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚。9、制片工作一般应在15—20分钟内完成。10、冰冻报告后及时将“冰对”组织放入内。11、每天操作完成后，及时对机器进行清理和消毒。
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标准化的重要性，需要技术员形成共识，非一朝一夕之功呀
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石蜡切片标准讨论组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。　　石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。　　1.取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。　　2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。,我实验室用。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。　　3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。　　4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完
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整切片，最长为数小时。　　5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。　　6.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。　　7.贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。　　8.切片脱蜡及水化干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。　　9.染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。　　10.切片脱水、透明和封片染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
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为何传不上呢
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楼主怎么回事，我的文章改几个字发到这里来了！ 何解？？？
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xkj2797xkj edited on
网上收集，内容较多，如有你的内容，请多包涵，内容均为转帖，仅供讨论
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免疫组化质控尚需解决的问题1）
大多数医学院校无病理技术专业，病理技术员大多由检验专业或其它专业转行，同时缺乏病理新技术的规范培养机构和计划。2）
没有病理专科医师培养计划，现有住院医师培养计划不适用于病理医师的培养。缺乏各类病理医师培养的教材或参考资料。3）
部分医院对病理科重视不够，人才流失严重。4）
病理收费极不合理，已严重影响病理队伍的稳定，长此下去会影响整个医疗质量。
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详细介绍免疫组化操作的幻灯片，非常详细，值得一看。参见同一板块另一个主题
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非常实用简明的免疫组化的幻灯片系列， 一看就懂，容易操作，包括免疫组化基本技术免疫组化与杂交组化免疫荧光组化技术免疫酶组化技术详见 同一板块另一个主题
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还有一个免疫荧光组化技术的PPT，很不错的，和前面几个组成一套，就很全面了 ，补充道同一板块另一个主题
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关于丁香园