女性，50岁，慢性萎缩性胃炎20余年。胃镜检查，胃窦部大弯侧可见一直径约1cm的息肉状隆起。活体检查，病理诊断为中分化腺_答案_百度高考
女性，50岁，慢性萎缩性胃炎20余年。胃镜检查，胃窦部大弯侧可见一直径约1cm的息肉状隆起。活体检查，病理诊断为中分化腺癌。手术切除癌组织局限于粘膜内。符合该患者早期胃癌的肉眼类型是
A．Ⅰ型B．Ⅱa型C．Ⅱb型D．Ⅱc型E．Ⅲ型
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婴儿早期喂养对1岁前疾病与生长发育的影响
目的 了解西安市第一医院所属地段婴幼儿喂养情况,探讨不同喂养方式及疾病对婴幼儿体格发育的影响.方法
将582例婴儿根据出生后前4～6个月的喂养方式分为完全母乳喂养组,部分母乳喂养组和人工喂养组.分别从1个月开始每月测量身长、体重到其1岁时,并记录婴儿1岁内&四病&的患病情况.结果
完全母乳喂养组,部分母乳喂养组和人工喂养组婴儿6月龄时的身长分别为68.41±2.31cm、68.25±2.39cm及68.06±2.41cm,体重分别为8.33±0.99kg、8.18±1.01kg及8.07±0.98kg,方差分析提示不同喂养方式婴儿6月龄时身长、体重的比较有统计学意义(身长F=36.71,体重F=34.54,均P＜0.05),身长及体重超均值率也有统计学意义(身长χ2=11.940,P=0.03;体重χ2=7.105,P=0.029),其中完全母乳喂养与部分母乳喂养儿高于人工喂养儿;1岁时,3种喂养方式婴儿身长分别为76.31±2.33cm、76.28±2.35cm及76.19±2.43cm,体重分别为10.32±1.36kg、10.41±1.38kg及10.43±1.36kg,经比较无统计学意义(身长F=19.31,体重F=18.89,P＞0.05);3种喂养方式的婴儿1岁内&四病&患病率比较有统计学差异(χ2=22.398,P&0.05).结论
母乳喂养是婴儿最理想的喂养方式,可降低&四病&患病率,在无母乳的情况下,配方奶粉不失为最佳的选择.
SHI Jun-ling
KANG Qiu-fang
作者单位：
西安市第一人民医院,陕西,西安,710002
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万方数据电子出版社Process for the preparation of N6-substituted NAD, NADP or FAD
European Patent EP0247537
Abstract of EP0247537N&6&-substituted NAD, NADP or FAD is prepared by Dimroth rearrangement, by carrying out the rearrangement without previous reduction and subsequent reoxidation.
Inventors:
Bückmann, Andreas F. (Romintenstrasse 23, Braunschweig, D-3300, DE)
Application Number:
Publication Date:
09/04/1991
Filing Date:
05/22/1987
Export Citation:
Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) (Mascheroder Weg 1, Braunschweig, D-38124, DE)
Degussa Aktiengesellschaft (Weissfrauenstrasse 9, Frankfurt, D-60311, DE)
International Classes:
B01D15/08; C07H19/207; C07H21/02; C12N9/00; (IPC1-7): C07H19/207; C07H21/02
European Classes:
C07H19/207; C07H21/02
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Foreign References:
DE2841414A
Other References:
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 108, 1988, Seite 381, Nr. 52347m, Columbus, Ohio, US; A.F. BUECKMANN: "A new synthesis of coenzymically active watersoluble macromolecular NAD and NADP derivatives", & BIOCATALYSIS ), 173-86
Attorney, Agent or Firm:
Boeters, Dr. Hans Dietrich (Patentanw?lte Boeters & Bauer, Bereiteranger 15, München, 81541, DE)
1. Process for the preparation of N6-substituted NAD or NADP, in which (a) NAD or NADP is alkylated with ethylene imine in the N(1)-position to N(1)-(2-aminoethyl)-NAD or N(1)-(2-aminoethyl)-NADP, (b) the alkylation product is subjected to Dimroth rearrangement to form N6-(2-aminoethyl)-NAD or N6-(2-aminoethyl)-NADP and (c) the product obtained according to (a) or (b) is optionally covalently bonded in a known manner to a macromolecule, characterised in that (d) rearrangement is carried out in an aqueous medium, (e) a pH of 4 to 9 and in particular 5 to 8 is maintained and (f) a temperature of 25 to 75°C and, in particular, of 40 to 60°C is maintained, (g) the Dimroth rearrangement is not preceded by a reduction and consequently not followed by oxidation and (h) the 1,N6-ethane adenine-NAD or 1,N6-ethane adenine NADP formed as a by-product during stage (b) is separated and isolated.
2. Process for the preparation of N6-substituted-FAD, in which (a) FAD is alkylated in the N(1)-position, (b) the alkylation product is subjected without prior reduction and subsequent reoxidation to a Dimroth rearrangement to form the N6 derivative, (c) the product obtained according to (a) or (b) is optionally covalently bonded in a known manner to a macromolecule, characterised in that (d) alkylation is carried out with ethylene imine and the resultant N(1)-(2-aminoethyl)-FAD is rearranged in an aqueous medium to form N6-(2-aminoethyl)-FAD, (e) a pH of 4 to 9 and, in particular, of 5 to 8 is maintained and (f) a temperature of 25 to 75°C and, in particular, of 40 to 60°C is maintained and (g) the 1,N6-ethane adenine-FAD formed as a by-product in stage (b) is separated and isolated.
3. Process according to claim 2, characterised in that a pH of about 6.5 and a temperature of about 40°C are maintained.
Description:
An feste polymere Tr?ger oder an wasserl?sliche Makromoleküle gebundenes NAD(H) oder NADP(H) sind bereits seit etwa 15 Jahren untersucht und verwendet worden. Die an feste Tr?ger gebundenen Coenzyme werden mit Erfolg in der Affinit?tschromatographie (1) eingesetzt. Wasserl?sliches makromolekulares NAD(H) oder NADP(H) wird als enzymatisch regenerierbares Coenzym-Derivat in Enzym-MembranReaktoren für die kontinuierliche Herstellung von Feinchemikalien durch Coenzym-abh?ngige enzymatische Katalyse (2) verwendet.Eine herk?mmliche Strategie zur Synthese dieser makromolekularen NAD(H)- oder NADP(H)-Derivate ist: Alkylierung der N(1)-Position des Adeninringsystems von NAD oder NADP, chemische Reduktion zu N(1)-alkyliertem NADH oder NADPH, Dimroth-Umlagerung im basischen Milieu und bei erh?hten Temperaturen (pH 10-11, 60-70°C) zu N6-alkyliertem NADH oder NADPH, kovalente Bindung dieses reduzierten Coenzyms am Makromolekül oder enzymatische Oxidation zum N6-alkylierten NAD oder NADP und anschliessende kovalente Verknüpfung am Makromolekül.Für NAD und NADP ist die Reaktionsfolge verwendet worden im Falle der Alkylierungsmittel wie Jodessigs?ure (3,4), Propionlakton (5) 3,4-Epoxybutters?ure (6,7) oder Ethylenimin (8,9). Auf diese Weise alkylierte Coenzyme weisen für die kovalente Bindung an Makromolekülen Carboxyl- oder Aminogruppen am Ende der Kette am N6-Atom des Adeninringes auf.Für die Verknüpfung kommen solche unl?slichen Makromoleküle (feste Tr?ger, Matrices) oder l?sliche, insbesondere wasserl?sliche, Makromoleküle in Betracht, die über eine oder mehrere für die Verknüpfung wirksamen funktionellen Gruppen verfügen. Die Makromoleküle k?nnen per se derartige funktionelle Gruppen aufweisen, bzw. die funktionellen Gruppen k?nnen in die Makromoleküle durch dem Fachmann bekannte Methoden eingeführt werden. Beispiele für verwendbare Makromoleküle sind: Dextrane, Polyethylenglykole, Polyethylenimine, Polyacrylamide, Mischpolymere wie Methylvinylether/Maleins?ureanhydrid, Ethylen/ Maleins?ureanhydrid, Divinylether/Maleins?ureanhydrid, Agarose,
Glas, Zellulose, Silicagel und Derivate der Makromoleküle. Für die Synthese makromolekularer Coenzymderivate sind alternative Strategien entwickelt worden, die als Varianten der herk?mmlichen Strategie zu betrachten sind und manchmal eine Vereinfachung der Synthese bezwecken. So ist eine durch Transglutaminase katalysierte kovalente Kopplung beschrieben worden im Falle der Bindung des herk?mmlich synthetisierten N6-[(6-aminohexyl)carbamoylmethyl]-NAD&spplus
an wasserl?sliche Proteine, z. B. Casein via γ-Carboxyamidgruppen des L-Glutamins (10). Auch ist es m?glich, erst N6-Vinyl-Derivate von NAD auf herk?mmliche Weise herzustellen und diese mit anderen Vinylmonomeren zu makromolekularem NAD zu copolymerisieren (5). Ein vereinfachtes Copolymerisationsverfahren (Herstellung N(1)-Vinyl-NAD&spplus -Derivat und simultane Copolymerisation und Dimroth-Umlagerung) ergab ein makromolekulares NAD-Derivat, das nur beschr?nkt (&40 %) enzymatisch zu reduzieren war (11). Basierend auf wasserl?slichen Polymeren mit Epoxygruppen ist ein Verfahren bekannt, bei dem - ausgehend von unmodifiziertem NAD - die N(1)-Alkylierung, Reduktion zu N(1)-alkyliertem NADH und Dimroth-Umlagerung zu N6-alkyliertem NADH in kovalent gebundenem Zustand am Polymer in einem Dreischritt-Verfahren durchgeführt wurde (12). Ausgehend von NADH ist sogar ein Einschrittverfahren m?glich, da Kopplung durch N(1)-Alkylierung und Dimroth-Umlagerung im basischen Milieu unter gleichen Bedingungen simultan stattfinden k?nnen (12). Im besten Fall wurde makromolekulares NADH erhalten, das etwa 60 % enzymatisch oxidierbar war. Diese vereinfachten Verfahren haben den Nachteil, dass nicht gut definierte makromolekulare NAD(H)-Derivate wegen Nebenreaktionen am Coenzym entstehen, die Hauptursache sind für die beschr?nkte Oxidier- oder Reduzierbarkeit. Ein Kompromiss zwischen dem vereinfachten und herk?mmlichen Verfahren mit dem Vorteil der Uniformit?t des gekoppelten NADH-Analogen konnte mit dem folgenden Verfahren erreicht werden: Synthese des N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD, kovalente Bindung an ein wasserl?sliches Polymer zu makromolekularem N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD, chemische Reduktion zu makromolekularem N(1)-(2-Aminoethyl)-NADH und Dimroth-Umlagerung zu makromolekularem N6-(2-Aminoethyl)-NADH (13, 14).Es sei betont, dass alle Methoden zur Herstellung von makromolekularem NAD (H) oder NADP (H) mit gut definierten Coenzymen den Schritt der Dimroth-Umlagerung des reduzierten N(1)-alkylierten Coen vgl. beispielsweise DE-B-2 841 414. Diese Umlagerung findet für das Coenzym unter extremen Bedingungen statt, wodurch erhebliche Verluste im ungekoppelten Zustand auftreten k?nnen (pH 10,5 bis 11,2, Temperatur 60 bis 70 °C, Zeit 1,5 bis 2 h).Für N(1)-(Carboxymethyl)-ATP konnten die Bedingungen der Dimroth-Umlagerung zu N6-(Carboxymethyl)-ATP verbessert werden durch Zugabe eines Anionenaustauschers in OH?-Form in der w?ssrigen N(1)-(Carboxymethyl)-ATP-L?sung zur angeblichen Stabilisierung der Triphosphatgruppe (15). Durch HPLC konnte die komplette Dimroth-Umlagerung mit stark reduziertem Produktzerfall innerhalb 5, bzw. 10 oder 240 Minuten w?hrend der Inkubation bei 100, 75 oder 50°C nachgewiesen werden. Ausgehend von N(1)-(Carboxymethyl)-NAD konnte bei einem ?quivalenten Vorgang kein coenzymatisch aktives N6-(Carboxymethyl)-NAD hergestellt werden (15).Gem?ss einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von N6-substituiertem NAD oder NADP, bei dem man
(a) NAD oder NADP mit Ethylenimin in N(1)-Stellung zu N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD oder N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP alkyliert, (b) das Alkylierungsprodukt einer Dimroth-Umlagerung zu N6-(2-Aminoethyl)-NAD oder N6-(2-Aminoethyl)-NADP unterwirft und (c) gegebenenfalls das gem?ss (a) oder (b) erhaltene Produkt in an sich bekannter Weise kovalent an ein Makromolekül bindet, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man (d) in w?sserigem Milieu umlagert, (e) dabei einen pH-Wert von 4 bis 9 und insbesondere 5 bis 8 einh?lt und (f) eine Temperatur von 25 bis 75 °C und insbesondere von 40 bis 60 °C einh?lt, (g) der Dimroth-Umlagerung keine Reduktion vorausgehen und entsprechend keine Oxidation folgen l?sst und (h) das bei der Stufe (b) als Nebenprodukt gebildete 1,N6-Aethanadenin-NAD bzw. 1,N6-Aethanadenin-NADP abtrennt und isoliert. Beispielsweise kann man unter den angegebenen Bedingungen bei einer Temperatur von 50 °C 6 bis 8 h lang arbeiten.FAD-Derivate, synthetisiert durch Modifizierung der N6-Position des Adeninringes, sind bisher in zwei F?llen beschrieben worden in Zusammenhang mit der Immobilisierung an wasserl?slichen Polymeren oder festen Tr?gern. Zapelli et al. (16) koppelten N6-(2-Hydroxy-3-carboxypropyl)-FAD an Polyethylenimin, synthetisiert durch Dimroth-Umlagerung unter extremen Bedingungen (pH 10, 80°C) des N(1)-(2-Hydroxy-3-carboxypropyl)-FAD nach Alkylierung des FAD mit 3,4-Epoxybutters?ure. Sie zeigten, dass für D-Aminos?ureoxidase und Glucoseoxidase, die nicht-kovalent gebundenes und deshalb ausblutbares FAD besitzen, die Langzeitstabilit?t in immobilisierter Form in Anwesenheit des Polyethylenimin-N6-(2-Hydroxy-Carboxypropyl)-FAD - funktionierend als st?ndiger FAD-Vorrat - stark verbessert werden konnte.Narasimhan und Wingard (17) immobilisierten auf Indium/Zinnoxid-Elektroden FAD, das mit anwesenden Formaldehyd-aktivierten Aminosilangruppen reagierte, wodurch direkt eine -NH-CH2-NH-Bindung zustande kam über die N6-Position des Adeninringes. Dadurch konnten sie das ?berpotential des NADH um 180 mV sinken, obwohl dies nicht genügte, um an der Elektrode befriedigend NADH in NAD zu oxidieren. Die Autoren erw?hnen die Wahrscheinlichkeit, dass durch Nebenreaktionen auch andere Kopplungsstellen am FAD-Molekül involviert sein k?nnten bei der Immobilisierung.N6-aminoalkylierte FAD-Derivate, beispielsweise N6-(2-Aminoethyl)-FAD, sind bisher nicht beschrieben worden.Gem?ss einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung nun ein Verfahren zur Herstellung von N6-substituiertem FAD, bei dem
(a) FAD in N(1)-Stellung alkyliert, (b) das Alkylierungsprodukt ohne vorhergehende Reduktion und anschliessende Reoxidation einer Dimroth-Umlagerung zum N6-Derivat unterwirft, (c) gegebenenfalls das gem?ss (a) oder (b) erhaltene Produkt in an sich bekannter Weise kovalent an ein Makromolekül bindet, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man (d) die Alkylierung mit Ethylenimin durchführt und das so erhaltene N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD in w?sserigem Milieu zum N6-(2-Aminoethyl)-FAD umlagert, (e) dabei einen pH-Wert von 4 bis 9 und insbesondere von 5 bis 8 einh?lt und (f) eine Temperatur von 25 bis 75 °C und insbesondere von 40 bis 60 °C einh?lt und (g) das bei der Stufe (b) als Nebenprodukt gebildete 1,N6-Aethanadenin-FAD abtrennt und isoliert.
Herstellung von makromolekularem NAD A. Herstellung von N(1)-(2-Amino?thyl)-NADEs wurden 200 g (300 mMol) NAD (Oriental yeast, freie S?ure) in 400 ml destilliertem Wasser gel?st. Dazu wurden 42.5 ml (850 mMol) Ethylenimin (Serva) langsam zugegeben, wobei der pH-Wert bei 3.2 ± 0.05 mit 70 %iger Perchlors?ure gehalten wurde (Gesamtvolumen 650 ml). Die Reaktionsmischung wurde 50 Std. lang bei 30°C und pH 3.2 ± 0.05 gerührt (Einstellung mit 70 %iger Perchlors?ure). Die Umwandlung des NAD in N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD wurde durch UV-Scanning nach Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, E. Merck) mit Laufmittel Isobutters?ure/destill. Wasser/25 %iger NH3 in Wasser 66/33/1 (Vol./Vol./Vol.), pH 3.7, ermittelt. Die Reaktionsmischung wurde mit destilliertem Wasser auf 1 Liter gebracht. Durch 5fach wiederholte F?llung und anschliessende Zentrifugation mit jeweils der 10fachen Menge techn. Ethanol bei 4°C wurde das in Ethanol l?sliche, nicht umgesetzte Ethylenimin entfernt. Der Niederschlag wurde unter Vakuum bei 25°C in einem Trockenschrank getrocknet und in einem Exsikkator über NaOH bei 4°C aufbewahrt. Zur Fraktionierung wurden 20 g des trockenen Reaktionsgemisches in der Zusammensetzung: 5.3 mMol NAD (23 %), 15 mMol N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD (65 %) und 2.6 mMol Nebenprodukte (12 %) in destilliertem Wasser gel?st bis zu 40 ml. Nach pH-Einstellung auf 5.0 mit 10 N NaOH wurde die L?sung bei 4°C auf eine Kationen-Austauschs?ule gegeben (100 x 2,6 cm, Biorex 70, 50-100 Maschen, Bio-Rad), die gegen 0.01 M LiCl, pH 4.5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach dem Beschicken wurde das NAD in einer 2 Liter-Fraktion quantitativ mit 0.01 M LiCl, pH 4.5, eluiert (5.3 mMol). Weitere Elution mit 2 1 0.01 M LiCl, pH 4.5, ergab 2.5 mMol eines Gemisches mit zwei Verbindungen, die sich dünnschichtchromatographisch verhielten wie N6-(2-Aminoethyl)-NAD und das vermutliche 1,N6-Ethanadenin-NAD, die - wie unter B beschrieben - leicht aus N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD entstehen k?nnen.Die S?ule wurde jetzt verkürzt auf 50 cm L?nge durch Absenkung der S?ulenfüllung, um eine schnellere Elution des Hauptproduktes N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD zu erreichen. Diese Elution wurde mit
1.5 1 0.2 M LiCl, pH 4.7, durchgeführt und 11.3 mMol reines N(1)-(2-Amino?thyl)-NAD gewonnen. Nebenprodukte (2.6 mhol), entstanden w?hrend der Alkylierung durch Ethylenimin, wurden nicht isoliert.Die verschiedenen Fraktionen wurden unter reduziertem Druck (flash evaporation) auf 30 ml konzentriert und 5mal mit techn. Ethanol (20facher ?berschuss auf Volumenbasis) gef?llt, wodurch das in Ethanol gut l?sliche Licl abgetrennt wird. Die Produkte der Fraktionen wurden nach L?sung in so wenig destilliertem Wasser wie m?glich gefriergetrocknet und bei 4°C in einem Exsikkator über NaOH gelagert.Die erzielte Fraktionierung ist in folgender Tabelle zusammen gestellt: B. Herstellung und Reinigung von N6-(2-Aminoethyl)-NADEs wurden 2 g (278 mMol) N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD in 200 ml destilliertem Wasser gel?st und mit 1 N LiOH auf pH 6.5 eingestellt. Diese L?sung wurde in einem Wasserbad bei 50°C über 7
Stunden inkubiert. Jede Stunde erfolgte pH-Einstellung mit 1 N LiOH. Nach Dünnschichtchromatographie gem?ss A wurde wahrgenommen, dass zwei Verbindungen aus N(1)-(2-Aminoethyl)-NAD entstanden waren, und zwar N6-(2-Aminoethyl)-NAD (rf - 0.13) und das vermutliche 1,N6-Ethanadenin-NAD (rf - 0.068). Die Zusammensetzung der Inkubationsl?sung wurde durch UV-Scanning nach Dünnschichtchromatographie bestimmt: 62.5 % (1.74 mMol) N6-(2-Aminoethyl)-NAD und 37.5 % (1.04 mMol) 1,N6-Ethanadenin-NAD.Das gefriergetrocknete Reaktionsgemisch wurde in 16.5 ml destilliertem Wasser gel?st und mit 1 N LiOH auf pH 5.5 eingestellt. Diese L?sung wurde auf eine Kationen-Austauschers?ule gegeben (100 x 1.6 cm, Biorex 70, 50-100 Maschen, Bio-Rad), die gegen 0.01 M LiCl, pH 3.5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Durch Elution bei 4°C mit 0.01 M LiCl, pH 3.5, wurden beide Verbindungen getrennt eluiert mit einer leichten ?berlappung, wobei N6-(2-Aminoethyl)-NAD als letztes von der S?ule kam.Drei dünnschichtchromatographisch einheitliche Fraktionen mit 1,N6-Ethanadenin-NAD (0.98 mMol in 250 ml), Gemisch (0.20 mMol in 120 ml) und reines N6-(2-Aminoethyl)-NAD (1.56 mhol in 660 ml) wurden unter reduziertem Druck auf 3 ml konzentriert und zweimal mit kaltem techn. ?thanol (20facher ?berschuss auf Volumenbasis) zur Entfernung des LiCl gef?llt. Nach Aufnahme in so wenig destilliertem Wasser wie m?glich wurden die Fraktionen gefriergetrocknet und bei 4°C in einem Exsikkator über NaOH gelagert. Die erzielte Reinigung ist in folgender Tabelle zusammengestellt. UV-Spektren und NMR-Daten haben N6-(2-Aminoethyl)-NAD als solches best?tigt. Die Verbindung gibt mit Ninhydrin eine positive Reaktion (prim?re Aminogruppe anwesend). λmax liegt bei 267 nm, die Verbindung zeigt keine Schulter mehr im Bereich 300-310 nm bei pH 11.5, was charakteristisch w?re für N(1)-Alkylierung des Adeninringes. Quantitative Reduktion, katalysiert durch Bierhefe-Alkoholdehydrogenase, ergibt fluorescierendes N6-(2-Aminoethyl-NADH (Excitation bei 366 nm) mit Extinktion bei 267 nm/Extinktion bei 338 nm = 3.2, charakteristisch für N6-alkylierte NADH-Derivate.
C. Beispiel 1: Herstellung von Polyethylenglykol-N6-(2-Aminoethyl)-NAD2 g carboxyliertes Polyethylenglykol (M 20 000, 0.1 mMol mit 0.14 mMol Carboxylgruppen), hergestellt gem?ss Bückmann et al. (Makromol, Chem. 182,
/1981/), wurden in destilliertem Wasser bis zu 4 ml gel?st und 2 ml mit 125 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben. Nach pH-Einstellung auf 4.7 mit 1 N HCl wurden 200 mg (1.04 mMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-carbodiimid-HCl in zwei gleichen Portionen innerhalb 10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (pH-Einstellung im Bereich 4.5-4.8 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH). Nach Inkubation w?hrend 16 Stunden bei 4°C wurde das Reaktionsgemisch (7 ml) in zwei Chargen von 3.5 ml gelfiltriert über eine Sephadex G 50-S?ule (100 x 2.6 cm), ins Gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die vereinigten Fraktionen mit Polyethylenglykol-N6-(2-Aminoethyl)-NAD wurden unter reduziertem Druck auf 15 ml konzentriert mit 85 uMol an Polyethylenglykol gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 5.5 mM] mit Kopplungsausbeute 68 %. D. Beispiel 2: Herstellung von Dextran-N6-(2-Aminoethyl)-NAD0.2 g carboxyliertes Dextran T 70 (M 70 000, 1 mMol Anhydroglucosemonomere, wovon 0.3 mMol carboxyliert waren), hergestellt gem?ss Bückmann et al., J. Appl. Biochem. 3, 301-315 (1981), wurden in 2 ml destilliertem Wasser gel?st und 1 ml mit 65 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben. Nach pH-Einstellung auf 4.7 mit 1 N HCl wurden 150 mg (0.78 mMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-carbodiimid-HCl in zwei gleichen Portionen innerhalb 10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (pH-Einstellung im Bereich 4.5-4.8 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH). Nach Inkubation bei 4°C w?hrend 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch (3.5 ml) bei 4°C gelfiltriert über eine Sephadex G50-S?ule (100 x 2.6 cm), ins gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die Fraktion mit Dextran-N6-(2-Aminoethyl)-NAD wurde unter reduziertem Druck zu 10 ml konzentriert mit 14 uMol an Dextran gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 1.4 mM] mit Kopplungsausbeute 22 %.
E. Beispiel 3: Herstellung von Polyvinylpyrrolidon-N6-(2-Aminoethyl)-NAD0.3 g carboxyliertes Polyvinylpyrrolidon (M 160 000, 2.7 mMol Vinylpyrrolidonmonomere mit 0.135 mMol Carboxylgruppen), hergestellt gem?ss Specht, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 354,
(1973), wurden in 3 ml destilliertem Wasser gel?st, 100 mg (63 uMol) N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben und der pH-Wert auf 4.7 eingestellt mit 1 N HCl. 150 mg (0.78 mMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-carbodiimid-HCl wurden in zwei gleichen Portionen innerhalb 10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (pH-Einstellung im Bereich 4.5-4.8 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH). Nach Inkubation bei 4°C w?hrend 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch (3.8 ml) bei 4°C gelfiltriert über eine Sephadex G 50-S?ule (100 x 2.6 cm), ins Gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die Fraktion mit Polyvinylpyrrolidon-N6-(2-Aminoethyl)-NAD wurde konzentriert unter reduziertem Druck zu 10 ml mit 10 uMol an Polyvinylpyrrolidon gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 1 mM) mit Kopplungsausbeute 16 %. F. Beispiel 4: Herstellung von Poly-(Ethylen/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NAD50 mg Poly-(Ethylen/Maleins?ureanhydrid) (M unbekannt, 0.4 mMol Ethylen/Maleins?ureanhydridmonomere, Aldrich) wurden in 10 ml destilliertem Wasser gel?st (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1 N NaOH) und 20 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 l destilliertes Wasser bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 22 ml mit 13 uMol an Poly-(Ethylen/Maleins?ure) gebundenes N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 0.6 mM] mit Kopplungsausbeute 65 % wurden erhalten. G. Beispiel 5: Herstellung von Poly-(Methylvinylether/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NAD50 g Poly-Methylvinylether/Maleins?ureanhydrid) (M 20 000, 0.32 mMol Methylvinylether/Maleins?ureanhydrid-monomere, Polysciences)
wurden in 10 ml destilliertem Wasser (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1N NaOH gel?st und 20 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 l destilliertes Wasser bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 22 ml mit 17 uMol an Poly-(Methylvinylether/Maleins?ure) gebundenes N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 0.78 mM] mit Kopplungsausbeute 85 % wurden erhalten. H. Beispiel 6: Herstellung von Poly-(Divinylether/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NAD50 mg Poly-(Divinylether/Maleins?urenahydrid) (M 18 000, 0.19 mMol Divinylether/Maleins?ure-anhydridmonomere, Hercules) wurden in 10 ml destilliertem Wasser (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1 N NaOH) gel?st und 20 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 1 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 l destilliertes Wasser bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 22 ml mit 20 uMol an Poly-(Divinylether/Maleins?ure) gebundenes N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 0.92 mM] mit Kopplungsausbeute 100 % wurden erhalten.Die enzymatische Reduzierbarkeit der wasserl?slichen polymergebundenen N6-(2-Aminoethyl)-NAD-Derivate wurde im Vergleich zu N6-(2-Aminoethyl)-NAD bestimmt mit der von Hefe-Alkohol-Dehydrogenase katalysierten Reaktion unter folgenden Bedingungen: 0.1 M Tris/HCl, pH 8.2, Raumtemperatur 0.1 M Ethanol 7 mM Semicarbazid/HCl 0.1 M N6-(2-Aminoethyl)-NAD (frei oder polymer-gebunden) 0.3 mg Alkoholdehydrogenase/mlDie Reduzierbarkeitsdaten sind in folgender Tabelle zusammengestellt:
I. Beispiel 7: Herstellung von CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-NAD1.5 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia, mit 60-84 uMol Carboxyhexylgruppen) gequollen in 10 ml destilliertem Wasser, wurden über einer Glasfritte mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das halbtrockene CH-Sepharose 4B wurde suspendiert in 2 ml destilliertem Wasser und 430 mg (2.25 mMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-Carbodiimid-HCl zugegeben. Die Suspension wurde 10 min inkubiert bei Zimmertemperatur (pH-Einstellung auf 4.8-5.0 mit 1 N NaOH oder 1 N HCl). Das aktivierte CH-Sepharose 4B wurde innerhalb einer Minute zweimal mit 25 ml destilliertem Wasser gewaschen und addiert an 2 ml w?ssriger L?sung mit 34 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NAD. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert nach pH-Einstellung auf 4.6 (1 N NaOH oder 1 N HCl). Nach Waschen mit 75 ml 20 % LiCl und 25 ml destilliertem Wasser und Sedimentation in destilliertem Wasser wurden 7 ml CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-NAD mit 20.6 uMol gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NAD [Konzentration 3 mM] erhalten mit Kopplungsausbeute 60.5 %.
Herstellung von makromolekularem NADP A. Herstellung und Reinigung von N(1)-(2-Aminoethyl)-NADPEs wurden 7.5 g (9.51 mMol) NADP (Boehringer, Di-Natriumsalz) in 10 ml destilliertem Wasser gel?st. Dazu wurden 1.4 ml (28 mMol) Ethylenimin (Serva) langsam zugegeben, wobei der pH-Wert bei 3.35 ± 0.05 mit 70%iger Perchlors?ure gehalten wurde (Gesamtvolumen 25 ml). Die Reaktionsmischung wurde 120 Stunden lang bei 30°C, pH 3.35 ± 0.05, gerührt (Einstellung mit 70 %iger Perchlors?ure). Die Umwandlung des NADP in N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP wurde ermittelt durch UV-Scanning nach Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, E. Merck) mit Laufmittel Isobutters?ure/destilliertes Wasser/25 %iger NH3 in Wasser = 66/33/1 (Vol./Vol./Vol.), pH 3.7. Die Reaktionsmischung wurde mit destilliertem Wasser auf 50 ml gebracht. Durch 5fach wiederholte F?llung und anschliessende Zentrifugation mit jeweils der 10fachen Menge techn. Ethanol bei 4°C wurde das in Ethanol l?sliche, nicht umgesetzte Ethylenimin entfernt. Der Niederschlag wurde in so wenig destilliertem Wasser wie m?glich aufgenommen und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in einem Exsikkator über NaOH bei 4°C aufbewahrt.Zur Fraktionierung wurden 0.75 g gefriergetrocknete Reaktionsmischung mit Zusammensetzung 0.235 mMol NADP (27.5 %), 0.575 mMol N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP (68 %) und 0.038 mMol Nebenprodukte (4.5 %) in destilliertem Wasser gel?st bis zu 22 ml. Nach pH-Einstellung auf 3.5 mit 1 N HCl wurde diese L?sung auf eine Kationen-Austauschers?ule gegeben (60 x 1.5 cm, AG W50 X4, 100-200 Maschen, Bio-Rad), die gegen 0.01 M Triethanolamin-Bicarbonat, pH 3.5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Durch Elution bei 4°C mit 0.01 M Triethanolamin-Bicarbonat, pH 3.5, wurden sukzessive drei Fraktionen gewonnen: mit Nebenprodukten verunreinigtes NADP (0.29 mMol, 34 % in 25 ml), Nebenprodukte (0.115 mMol, 13.5 % in 100 ml), entstanden w?hrend der Alkylierungsreaktion aus N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP und w?hrend der Fraktionierung auf der S?ule, und reines N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP (0.39 mMol, 46 %, in 200 ml).Die Fraktionen wurden unter reduziertem Druck bis 25 ml konzentriert und gefriergetrocknet zur Entfernung des Triethanolamin-Bicarbonats und bei 4°C in einem Exsikkator über NaOH gelagert. Die erzielte Fraktionierung ist in der folgenden Tabelle zusam mengestellt. N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP gibt mit Ninhydrin eine positive Reaktion (prim?re Aminogruppen sind vorhanden) und zeigt eine für N(1)-Alkylierung im Adeninring charakteristische Schulter im Bereich 300-310 nm bei pH 11.5. B. Herstellung und Reinigung von N6-(2-Aminoethyl)-NADPEs wurden 0.35 g (0.24 mMol) N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP gel?st in 0.5 l destilliertem Wasser und mit 1 N LiOH ein pH-Wert von 6.0 eingestellt. Diese L?sung wurde in einem Wasserbad bei 50°C w?hrend 4 Stunden inkubiert. Stündlich erfolgte pH-Einstellung mit 1 N LiOH. Durch Dünnschichtchromatographie gem?ss A wurde wahrgenommen, dass zwei Verbindungen aus N(1)-(2-Aminoethyl)-NADP entstanden waren, und zwar N6-(2-Aminoethyl)-NADP (rf = 0.048) und das vermutliche 1,N6-Ethan-Adenin-NAD (rf = 0.031). Die Zusammensetzung der Inkubationsl?sung wurde durch UV-scanning bei 260 nm nach Dünnschichtchromatographie bestimmt: 75 % 1,N6-Ethan-Adenin-NAD (0.18 mMol) und 25 % N6-(2-Aminoethyl)-NADP (0.06 mMol). Die Inkubationsl?sung wurde unter reduziertem Druck auf 7 ml eingeengt. Nach pH-Einstellung auf 5.0 wurde diese L?sung bei 4°C auf eine Anionen-Austauschers?ule gegeben (100 x 1.6 cm, AG1X4, 100-200 Maschen, Bio-Rad), die gegen 0.01 M Triethanolamin-Bicarbonat, pH 3.5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Durch Elution
mit 0.01 M Triethanolimin-Bicarbonat, pH 3.5, wurde sukzessive in zwei Hauptfraktionen: 1,N6-Ethan-Adenin-NAD (0.17 mMol, 70 % in 1 Liter) und N6-(2-Aminoethyl)-NADP (0.053 mMol, 22 %, in 250 ml) eluiert. Die zwei Fraktionen wurden unter reduziertem Druck auf 2 ml eingeengt und zur Entfernung des Triethanolamin-Biocarbonats zweimal bei Raumtemperatur über eine Sephadex G10-S?ule (100 x 1.5 cm), die gegen destilliertes Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden war, eluiert. Nach Gefriertrocknung wurden beide Produkte in einem Exsikkator über NaOH bei 4°C gelagert. Die erzielte Fraktionierung ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt: UV-Spektren und NMR-Daten haben N6-(2-Aminoethyl)-NADP als solches best?tigt. Die Verbindung gibt mit Ninhydrin eine positive Reaktion (prim?re Aminogruppe anwesend), hat λmax bei 267 nm und zeigt keine Schulter mehr im Bereich 300-310 nm bei pH 11.5, die für die N(1)-Alkylierung des Adeninringes charakteristisch w?re. Quantitative Reduktion, katalysiert durch Bierhefe-Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, ergibt fluorescierendes N6-(2-Aminoethyl)-NADPH (Excitation bei 366 nm) mit Extinktion bei 267 nm/Extinktion bei 338 = 3.2, charakteristisch für N6-alkylierte NADPH-Derivate.
C. Beispiel 1: Herstellung von Polyethylenglykol-N6-(2-Aminoethyl)-NADPPEG (Mr=4000)-N6-(2-Aminoethyl)-NADP: 60 mg N-Hydroxysuccinimid-aktiviertes, carboxyliertes Polyethylenglykol (M 4 000, 0.015 mMol mit 0.03 mMol aktivierte Carboxylgruppen), hergestellt gem?ss Bückmann et al., Makromol. Chem. 182,
(1981), wurden in 1 ml destilliertem Wasser mit 15 uMol N6-(2-Aminoethyl)NADP gel?st, bei pH 7.2, eingestellt mit 1 N NaOH. 5 Stunden wurde bei Raumtemperatur und pH 7.2 gerührt (pH-Einstellung mit 1 N NaOH). Das Reaktionsgemisch wurde bei 4°C über eine Sephadex G50-S?ule (100 x 2.6 cm) gelfiltriert, ins Gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die Fraktion mit Polyethylenglykol-N6-(2-Aminoethyl)-NADP wurde eingeengt auf 10 ml mit 12 uMol an Polyethylenglykol (Mr=4000) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 1.2 mM] mit Kopplungsausbeute 80 %.PEG (Mr=20,000)-N6-(2-Aminoethyl)-NADP: 325 mg N-Hydroxysuccinimid aktiviertes, carboxyliertes Polyethylenglykol (Mr=20,000, 0.015 mMol mit 0.03 mMol aktivierte Carboxylgruppen), hergestellt gem?ss Bückmann et al., Makromol. Chem. 182,
(1981), wurden in 1 ml destilliertem Wasser mit 15 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NADP bei pH 7.2 gel?st, eingestellt mit 1 N NaOH. Bei Zimmertemperatur wurde w?hrend einer Stunde bei pH 7.2-7.3 gerührt und 3 Stunden bei pH 6.8 (1 N HCl oder 1 N NaOH). Das Reaktionsgemisch wurde gelfiltriert bei 4°C über eine Sephadex G 50-S?ule (2.6 x 100 cm), ins Gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die Fraktion mit Polyethylenglykol N6-(2-Aminoethyl)-NADP wurde eingeengt auf 10 ml mit 15 uMol an Polyethylenglykol(Mr=20,000) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 1.5 mM] mit Kopplungsausbeute 100 %.NB: Die Kopplungsmethode, basierend auf Aktivierung der Carboxylgruppen mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid, kommt für NADP-Derivate nicht infrage, weil dieses Reagenz auch die 2,3-Zyklisierung über der 2-Phosphatgruppe der Ribose an der Adeninseite des Moleküles bewirkt, wodurch NADP-Derivate die Coenzymaktivit?t verlieren.
D. Beispiel 2: Herstellung von Poly-(Ethylen/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NADP12 mg Poly-(Ethylen/Maleins?ureanhydrid) (M unbekannt, 0.1 mMol Ethylen/Maleins?ureanhydrid-Monomere, Aldrich) wurden in 1 ml destilliertem Wasser (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) gel?st und 5.5 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NADP zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 Liter bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 3.3 ml mit 0.8 uMol an Poly-(Ethylen/Maleins?ure) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 0.24 mM] mit Kopplungsausbeute 15 % wurden erhalten. E. Beispiel 3: Herstellung von Poly-(Methylvinylether/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NADP12 mg Mol-(Methylvinylether/Maleins?ureanhydrid) (M 20 000, 0.077 mMol Methylvinylether/Maleins?ureanhydrid-Monomere, Polysciences) wurden in 1 ml destilliertem Wasser (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) gel?st und 5.5 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NADP zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 Liter bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 4.4 ml mit 0.6 uMol an Poly-(Methylvinylether/Maleins?ure) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 0.2 mM] mit Kopplungsausbeute 11 % wurden erhalten. F. Beispiel 4: Herstellung von Poly-(Divinylether/Maleins?ure)-N6-(2-Aminoethyl)-NADP12 mg Poly-(Divinylether/Maleins?ureanhydrid) (M 18 000, 0.046 uMol Divinylether/Maleins?ureanhydrid-Monomere, Hercules) wurden in 1 ml destilliertem Wasser (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) gel?st und 5.5 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NADP zugegeben. Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur (pH-Einstellung auf 7.5 mit 0.2 N NaOH) wurde das Reaktionsgemisch gegen 5 Liter bei 4°C w?hrend 16 Stunden dialysiert. 3.5 ml mit 0.7 uMol an Poly-(Divinylether/Maleins?ure) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 0.136 mM] mit Kopplungsausbeute 13 % wurden erhalten.NB: Die N6-(2-Aminoethyl)-NADP-Kopplungsausbeute für D, E und F ist wesentlich niedriger im Vergleich zu ?hnlichen Kopplungen im Falle N6-(2-Aminoethyl)-NAD. Die aus dem S?ureanhydrid entstehenden negativ geladenen Carboxylgruppen werden die Kopplung für die auch negativen N6-(2-Aminoethyl)-NADP-Moleküle erschweren im Vergleich zu den positiv geladenen N6-(2-Aminoethyl)-NAD-Molekülen.Die enzymatische Reduzierbarkeit der wasserl?slichen Polymer-gebundenen N6-(2-Aminoethyl)-NADP-Derivate wurde im Vergleich zu N6-(2-Aminoethyl)-NADP bestimmt mit der von Hefe-Glukose-6-Phosphatdehydrogenase katalysierten Reaktion unter folgenden Bedingungen: 0.05 M Triethanolamin/HCl, pH 8.0, Raumtemperatur 5.5 mM MgCl2 4.5 mM Glukose-6-Phosphat 0.1 mM N6-(2-Aminoethyl)-NADP (frei oder Polymer-gebunden) 30 ug Glukose-6-PhosphatdehydrogenaseDie Reduzierbarkeitsdaten sind in folgender Tabelle zusammengestellt:
G. Beispiel 5: Herstellung von CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-NADP:0.25 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia, mit 10-14 uMol Carboxyhexylgruppen) gequollen in 3 ml destilliertem Wasser, wurden über einer Glasfritte mit 25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das halbtrockene CH-Sepharose 4B wurde suspendiert in 0.45 ml destilliertem Wasser und 70 mg (365 uMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-carbodiimid-HCl zugegeben. Die Suspension wurde 10 min sp?ter inkubiert bei Zimmertemperatur (pH-Einstellung auf 4.8-5.0 mit 0.1 N NaOH oder 0.1 N HCl). Das aktivierte CH-Sepharose 4B wurde innerhalb einer Minute zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen und addiert an 0.45 ml w?ssriger L?sung mit 1.4 uMol N6-(2-Aminoethyl)-NADP. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert nach pH-Einstellung auf 4.6 (0.1 N NaOH oder 0.1 N HCl). Nach Waschen mit 20 ml 20 % LiCl und 16 ml destilliertem Wasser und Sedimentation in destilliertem Wasser wurden 1 ml CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-NADP mit 1 uMol gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-NADP [Konzentration 1 mM] erhalten mit Kopplungsausbeute 71.4 %.
Herstellung von makromolekularem FAD A. Herstellung und Reinigung von N(1)-(2-Aminoethyl)-FADEs wurden 0.5 g (0.6 mMol) FAD (Serva, Di-Natriumsalz) in 1 ml destilliertem Wasser gel?st. Dazu wurden 40 ul (0.8 mMol) Ethylenimin (Serva) langsam zugegeben, wobei der pH-Wert bei 3.5 ± 0.1 mit 35 %iger Perchlors?ure gehalten wurde (Gesamtvolumen 1.5 ml). Die Reaktionsmischung wurde 144 Stunden lang bei 30°C, pH 3.5 ± 0.1, gerührt (Einstellung mit 35 %iger Perchlors?ure). Die Umwandlung des FAD in N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD wurde ermittelt durch UV-Scanning nach Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, E. Merck) mit Laufmittel Isobutters?ure/destilliertes Wasser / 25 %iger NH3 in Wasser = 66/33/1 (Vol./Vol./Vol.), pH 3.7. Die Reaktionsmischung wurde mit destilliertem Wasser auf 3 ml gebracht. Durch 2fach wiederholte F?llung und anschliessende Zentrifugation mit jeweils 50 ml techn. Ethanol bei 4°C wurde das in Ethanol l?sliche, nicht umgesetzte Ethylenimin entfernt. Der Niederschlag wurde in so wenig destilliertem Wasser wie m?glich aufgenommen und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in einem Exsikkator über NaOH bei 4°C aufbewahrt.Zur Fraktionierung wurde die gefriergetrocknete Reaktionsmischung mit Zusammensetzung 0.192 mMol FAD (32 %), 0.354 mMol N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD (59 %) und 0.054 mMol Nebenprodukte (9 %) in destilliertem Wasser gel?st bis zu 20 ml. Nach pH-Einstellung auf 5.0 mit 1 N HCl wurde diese L?sung auf eine Kationen-Austauschers?ule gegeben (60 x 1.5 cm, Biorex 70, 50-100 Maschen, Bio-Rad), die gegen destilliertes Waser, pH 3.5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Durch Elution bei 4°C mit destilliertem Wasser, pH 3.5, wurden sukzessive zwei Fraktionen gewonnen: mit Nebenprodukten verunreinigtes FAD (0.22 mMol, 46.6 % in 150 ml) und Nebenprodukte (0.043 mMol, 8.9 % in 100 ml), entstanden w?hrend der Fraktionierung auf der S?ule. Reines N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD (0.215 mMol, 44.5 %, in 1000 ml) wurde eluiert mit 0.5 M LiCl, pH 3.5.Die Fraktionen mit FAD und N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD wurden unter reduziertem Druck bis 5 resp. 10 ml eingeengt. Aus der N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD-Fraktion wurde durch 3fach weiderholte F?llung und anschliessende Zentrifugation in jeweils 250 ml techn. Ethanol bei 4°C LiCl entfernt. Die FAD-Fraktion und N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD wurden nach L?sen in 10 ml destilliertem Wasser gefriergetrocknet und bei 4°C einem Exsikkator über NaOH gelagert.Die erzielte Fraktionierung ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt: N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD gibt mit Ninhydrin eine positive Reaktion (prim?re Aminogruppen sind vorhanden) und zeigt die Maxima im UV-Spektrum, üblich für FAD und Derivate bei 450, 373 und 262 nm. Angeregt bei 360 nm wird starke Fluoreszenz beobachtet. Der rf-Wert im o.g. Elutionssystem für Dünnschicht-Chromatographie betr?gt 0.138. B. Herstellung und Reinigung von N6-(2-Aminoethyl)-FADEs wurden 39 uMol N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD gel?st in 8.3 ml destilliertem Wasser und mit 0.1 N LiOH ein pH-Wert von 6.5 eingestellt. Diese L?sung wurde in einem Wasserbad bei 40°C w?hrend 7 Stunden inkubiert. Stündlich erfolgte pH-Einstellung mit 0.1 N LiOH. Durch Dünnschichtchromatographie gem?ss A wurde wahrgenommen, dass zwei Verbindungen aus N(1)-(2-Aminoethyl)-FAD entstanden waren, und zwar N6-(2-Aminoethyl)-FAD (rf = 0.177) und das vermutliche 1,N6-Ethan-Adenin-FAD (rf = 0.12). Die Zusammensetzung der Inkubationsl?sung wurde durch UV-scanning bei 265 nm nach Dünnschichtchromatographie bestimmt: 35 % 1,N6-Ethan-Adenin-FAD (13.5 uMol) und 65 % N6-(2-Aminoethyl)-FAD (25.5 uMol).Die Inkubationsl?sung wurde unter reduziertem Druck auf 4 ml eingeengt. Nach pH-Einstellung auf 6.5 wurde diese L?sung bei 4°C auf eine Anionen-Austauschers?ule gegeben (100 x 0.5 cm, AG1X4, 100-200 Maschen, Bio-Rad), die gegen destilliertes Wasser, pH 3.5, in Gleichgewicht gebracht worden war. Durch Elution mit destilliertem Wasser, pH 3.5, wurden erst undefinierte Zersetzungsprodukte eluiert (± 2 uMol, 5 %). Durch einen Gradienten 0 - 0.2 M LiCl (pH 3.5, 500 ml/500 ml) wurden sukzessive N6-(2-Aminoethyl)-FAD (13.7 uMol, 53 %, in 400 ml) und das vermutliche 1,N6-Ethan-Adenin-FAD (5.6 uMol, 40 %, in 300 ml) eluiert. Die zwei Fraktionen wurden unter reduziertem Druck auf 4 ml eingeengt und zur Entfernung des LiCl über eine Sephadex G10-S?ule (100 x 1cm), die gegen destilliertes Wasser in Gleichgewicht gebracht worden war, gelfiltriert. Nach Gefriertrocknung wurden beide Produkte in einem Exsikkator über NaOH bei 4°C gelagert. Die erzielte Fraktionierung ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt: UV-Spektren und erste NMR-Daten haben N6-(2-Aminoethyl)-FAD als solches best?tigt. Die Verbindung gibt mit Ninhydrin eine positive Reaktion (prim?re Aminogruppe anwesend), hat λmax bei 266 nm und zeigt die für FAD und Derivate charakteristischen Maxima bei 450 und 373 nm im UV-Spektrum. Angeregt bei 366 nm wird starke Fluorescenz wahrgenommen. C. Beispiel 1: Herstellung von Polyethylenglykol-N6-(2-Aminoethyl)-FADPEG (Mr=20,000)-N6-(2-Aminoethyl)-FAD: 110 mg N-Hydroxysuccinimid aktiviertes, carboxyliertes Polyethylenglykol (Mr=20,000, 5 uMol mit 10 uMol aktivierte Carboxylgruppen) hergestellt gem?ss Bückmann et al., Makromol. Chem. 182,
(1981), wurden in 1 ml destilliertem Wasser mit 5 uMol N6-(2-Aminoethyl)-FAD bei pH 7.2 gel?st, eingestellt mit 0.1 N NaOH. Bei Zimmertemperatur wurde w?hrend einer Stunde bei pH 7.2 - 7.3 gerührt (0.1 N HCl oder 0.1 N NaOH). Das Reaktionsgemisch wurde gelfiltriert bei 4°C über eine Sephadex G 50-S?ule (0.5 x 60 cm), ins Gleichgewicht gegen destilliertes Wasser. Die Fraktion mit Polyethylenglykol N6-(2-Aminoethyl)-FAD wurde eingeengt auf 1.7 ml mit 2 uMol an Polyethylenglykol(Mr=20,000) gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-FAD [Konzentration 1.18 mM] mit Kopplungsausbeute 40 %. D. Beispiel 2: Herstellung von CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-FAD:0.25 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia, mit 10-14 uMol Carboxyhexylgruppen) gequollen in 3 ml destilliertem Wasser, wurden über einer Glasfritte mit 25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das halbtrockene CH-Sepharose 4B wurde suspendiert in 0.5 ml destilliertem Wasser und 100 mg (520 uMol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethyl-Carbodiimid-HCl zugegeben. Die Suspension wurde 10 min inkubiert bei Zimmertemperatur (pH-Einstellung auf 4.8-5.0 mit 0.1 N NaOH oder 0.1 N HCl). Das aktivierte CH-Sepharose 4B wurde innerhalb einer Minute zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen und addiert an 0.5 ml w?ssriger L?sung mit 2.1 uMol N6-(2-Aminoethyl)-FAD. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert nach pH-Einstellung auf 4.6 (0.1 N NaOH oder 0.1 N HCl). Nach Waschen mit 30 ml 20 % LiCl und 20 ml destilliertem Wasser und Sedimentation in destilliertem Wasser wurden 1.2 ml CH-Sepharose 4B-N6-(2-Aminoethyl)-FAD mit 1.75 uMol gebundenem N6-(2-Aminoethyl)-FAD [Konzentration 1.45 mM] erhalten mit Kopplungsausbeute 83 %.
Literatur: 1. Mosbach, K., Advances in Enzymology 46, 205-278 (1978) 2. Wichmann, R., Wandrey, C., Bückmann, A. F. und Kula, M.-R., Biotechn. Bioeng. 23,
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